用于编辑核苷酸序列的方法和组合物

技术特征：
1.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述向导rna包含选自由seq id no：1-135514组成的组的序列，或与seq id no：1-135514中的任一项具有至少90％序列同一性的序列。2.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述间隔区包含选自由seq id no：135515-271028组成的组的核苷酸序列，或具有与seq id no：135515-271028中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的间隔区。3.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂具有选自由seq id no：271029-406542组成的组的核苷酸序列，或具有与seq id no：271029-406542中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的延伸臂。4.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂包含：(i)引物结合位点，(ii)编辑模板，和(iii)同源臂。5.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂包含具有选自由seq id no：406543-542056组成的组的核苷酸序列的引物结合位点，或具有与seq id no：406543-542056中的任一项至少90％序列相同的核苷酸序列的引物结合位点。6.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂包括包含选自由seq id no：542057-677570组成的组的核苷酸序列的编辑模板，或具有与seq id no：542057-677570中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的编辑模板。7.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂包含具有选自由seq id no：677571-813084组成的组的核苷酸序列的同源臂，或具有与seq id no：677571-813084中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的同源臂。8.向导rna，其包含：(i)具有选自由seq id no：135515-271028组成的组的核苷酸序列的间隔区，或具有与seq id no：135515-271028中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的间隔区，和(ii)选自由seq id no：271029-406542组成的组的延伸臂，或具有与seq id no：271029-406542具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的延伸臂。9.向导rna，其包含：(i)具有选自由seq id no：135515-271028组成的组的核苷酸序列的间隔区，或具有与seq id no：135515-271028中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的间隔区，和(ii)选自由seq id no：406543-542056组成的组的引物结合位点，或具有与seq id no：406543-542056中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的引物结合位点。10.向导rna，其包含：(i)具有选自由seq id no：135515-271028组成的组的核苷酸序列的间隔区，或具有与seq id no：135515-271028中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的间隔区，和(ii)具有选自由seq id no：542057-677570组成的组的核苷酸序列的编辑模板，或具有与seq id no：542057-677570中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的编辑模板。11.向导rna，其包含：(i)具有选自由seq id no：135515-271028组成的组的核苷酸序列的间隔区，或具有与
seq id no：135515-271028中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的间隔区，和(ii)具有选自由seq id no：677571-813084组成的组的核苷酸序列的同源臂，或具有与seq id no：677571-813084中的任一项至少90％相同的核苷酸序列的间隔区。12.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其进一步包含seq id no：813086的终止信号，或与seq id no：813086具有至少90％序列同一性的终止信号。13.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其进一步包括包含发夹序列、茎/环序列或趾环(toeloop)序列的5’末端修饰物区。14.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其进一步包括包含发夹序列、茎/环序列或趾环序列的3’末端修饰物区。15.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其进一步包括包含seq id no：813085的grna核心，或与seq id no：813085具有至少90％序列同一性的grna核心。16.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述向导rna能够与适于引导编辑(prime editing)的napdnabp结合并将所述napdnabp引导至靶dna序列。17.权利要求16的所述向导rna，其中所述靶核酸序列包含靶链(或pam链)和互补非靶链(或非pam链)，其中所述向导rna的间隔区与所述互补非靶链(非pam链)杂交以形成rna-dna杂交体和r环。18.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述引物结合位点的长度在约8个和约20个核苷酸之间。19.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述引物结合位点的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。20.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述引物结合位点的长度为至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。21.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述同源臂与所述靶dna的链互补。22.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述延伸臂的长度在约7和约500个核苷酸之间。23.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述延伸臂的长度为至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸或至少100个核苷酸。24.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述编辑模板的长度为至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核
苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸或至少100个核苷酸。25.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述同源臂是至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸或至少30个核苷酸。26.上述权利要求中任一项的所述向导rna，其中所述编辑模板和同源臂可以被逆转录酶用作模板序列以用于合成具有3’末端的相应单链dna flap，其中所述dna flap与邻近切口位点的内源性靶dna序列的链互补，且其中所述单链dna flap包含由所述编辑模板编码的核苷酸变化。27.权利要求26的所述向导rna，其中所述单链dna flap置换已形成切口的靶dna序列中具有5’末端的内源性单链dna。28.权利要求27的所述向导rna，其中所述细胞切除具有游离5’末端的所述内源性单链dna。29.权利要求27的所述向导rna，其中所述单链dna flap的细胞修复导致所述核苷酸变化的安装(installation)，从而形成期望产物。30.权利要求29的所述向导rna，其中所述期望的核苷酸变化是插入。31.权利要求30的所述向导rna，其中所述插入的长度为至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸或至少100个核苷酸。32.权利要求30的所述向导rna，其中所述插入是编码多肽的序列。33.引导编辑复合物，其包含napdnabp、逆转录酶和权利要求1-32中任一项的所述向导rna。34.权利要求33的所述引导编辑复合物，其中所述napdnabp和所述逆转录酶形成为融合蛋白。35.权利要求33的所述引导编辑复合物，其中所述napdnabp是cas9。36.权利要求35的所述引导编辑复合物，其中所述cas9选自由cas9切口酶或其变体组
成的组。37.权利要求35的所述引导编辑复合物，其中所述cas9具有选自由seq id no：1-135514组成的组的氨基酸序列。38.权利要求34的所述引导编辑复合物，其中所述融合蛋白具有选自由seq id no：1-135514组成的组的氨基酸序列。39.权利要求34的所述引导编辑复合物，其中所述融合蛋白包含接合所述napdnabp和逆转录酶的接头。40.权利要求39的所述引导编辑复合物，其中所述接头具有选自由seq id no：1-135514组成的组的氨基酸序列。41.一种或多种多核苷酸，其编码权利要求33-40中任一项的所述引导编辑复合物。42.载体，其包含权利要求41的所述多核苷酸和驱动所述向导rna和所述引导编辑复合物的融合蛋白的表达的一个或多个启动子。43.细胞，其包含权利要求42的载体。44.细胞，其包含权利要求33-40中任一项的引导编辑复合物。45.药物组合物，其包含：(i)权利要求1-32中任一项的向导rna、权利要求33-40的引导编辑复合物、权利要求41的多核苷酸或权利要求42的载体；和(ii)药学上可接受的赋形剂。46.在核酸序列中安装核苷酸变化的方法，所述方法包括：使所述核酸序列与包含融合蛋白和权利要求1-32中任一项或权利要求56-81中任一项的向导rna的复合物接触，其中所述融合蛋白包含napdnabp和聚合酶，且其中所述向导rna包含间隔区、grna核心和包含编码核苷酸变化的编辑模板的延伸臂；由此(i)在靶链(或pam链)上使双链dna序列形成切口，并产生具有3’末端的游离单链dna；(ii)在引物结合位点处将所述游离单链dna的3’末端与所述向导rna杂交，由此引发所述聚合酶；(iii)从所述3’末端聚合dna的链，由此产生包含所述核苷酸变化的单链dna flap；和(iv)用所述单链dna flap替换紧邻所述靶链(或pam链)上切割位点的下游的内源性dna链，由此在所述双链dna序列中安装期望的核苷酸变化。47.权利要求46的所述方法，其中所述核苷酸变化是单个核苷酸取代、缺失、插入或其组合。48.权利要求46的所述方法，其中所述单个核苷酸取代是转换或颠换。49.权利要求46的所述方法，其中所述核苷酸变化是(1)g到t取代，(2)g到a取代，(3)g到c取代，(4)t到g取代，(5)t到a取代，(6)t到c取代，(7)c到g取代，(8)c到t取代，(9)c到a取代，(10)a到t取代，(11)a到g取代，或(12)a到c取代。50.权利要求46的所述方法，其中所述核苷酸变化转换(1)g：c碱基对为t：a碱基对，(2)g：c碱基对为a：t碱基对，(3)g：c碱基对为c：g碱基对，(4)t：a碱基对为g：c碱基对，(5)t：a碱基对为a：t碱基对，(6)t：a碱基对为c：g碱基对，(7)c：g碱基对为g：c碱基对，(8)c：g碱基对为t：a碱基对，(9)c：g碱基对为a：t碱基对，(10)a：t碱基对为t：a碱基对，(11)a：t碱基对为g：c碱基对，或(12)a：t碱基对为c：g碱基对。51.权利要求46的所述方法，其中所述核苷酸变化是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的插入或缺失。
52.权利要求46的所述方法，其中所述核苷酸变化是多肽编码序列的插入。53.权利要求46的所述方法，其中所述核苷酸变化校正疾病相关基因。54.权利要求46的所述方法，其中所述疾病相关基因与选自由以下组成的组的单基因病症相关：腺苷脱氨酶(ada)缺乏症；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；囊性纤维化；假肥大型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy)；半乳糖血症；血色沉着病(hemochromatosis)；亨廷顿氏病；枫糖浆尿病(maple syrup urine disease)；马凡综合征(marfan syndrome)；1型神经纤维瘤病；先天性厚甲症(pachyonychia congenita)；苯丙酮尿症(phenylkeotnuria)；严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency)；镰状细胞贫血病(sickle cell disease)；史-李-欧综合征(smith-lemli-opitz syndrome)；和泰萨克斯病(tay-sachs disease)。55.权利要求46的所述方法，其中所述疾病相关基因与选自由以下组成的组的多基因病症相关：心脏病；高血压；神经系统疾病；自身免疫病症，关节炎；糖尿病；癌症；和肥胖。56.向导rna，其用于引导编辑以校正靶dna序列中编辑位点处的疾病等位基因以形成健康等位基因，所述向导包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述间隔区能够与seq id no：1217353-1289387或其互补链内的～20个核苷酸区域结合。57.向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂包含dna合成模板和有效进行引导编辑的引物结合位点。58.权利要求56的所述向导rna，其中seq id no：1217353-1289387的任意核苷酸序列中的编辑位点在5’到3’定向的位置201处开始。59.用于引导编辑的向导rna，其包含间隔区、grna核心和延伸臂，其中所述延伸臂包含引物结合位点和dna合成模板。60.权利要求59的所述向导rna，其中所述引物结合位点具有选自由seq id no：406543-542056组成的组的核苷酸序列(引物结合位点)，或与seq id no：406543-542056中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。61.权利要求59的所述向导rna，其中所述dna合成模板包含seq id no：542057-677570的核苷酸序列(编辑模板)，或与seq id no：542057-677570中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。62.权利要求59的所述向导rna，其中所述dna合成模板包含seq id no：677571-813084的核苷酸序列(同源臂)，或与seq id no：677571-813084中的任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。63.权利要求59的所述向导rna，其中所述dna合成模板包含编辑模板和同源臂，其中所述编辑模板包含seq id no：542057-677570的核苷酸序列，并且所述同源臂包含seq id no：677571-813084的核苷酸序列。64.权利要求56-63中任一项的所述向导rna，其进一步包含seq id no：813086的终止信号，或与seq id no：813086具有至少90％序列同一性的终止信号。65.权利要求56-64中任一项的所述向导rna，其进一步包括包含发夹序列、茎/环序列或趾环序列的5’末端修饰物区。66.权利要求56-65中任一项的所述向导rna，其进一步包括包含发夹序列、茎/环序列或趾环序列的3’末端修饰物区。
67.权利要求56-66中任一项的所述向导rna，其进一步包括包含seq id no：813085的grna核心，或与seq id no：813085具有至少90％序列同一性的grna核心。68.权利要求56-67中任一项的所述向导rna，其中所述向导rna能够与适于引导编辑的napdnabp结合并将所述napdnabp引导至靶dna序列。69.权利要求68的所述向导rna，其中所述靶核酸序列包含靶链(或pam或编辑链)和互补非靶链(或非pam或非编辑链)，其中所述向导rna的间隔区与所述非pam链杂交以形成rna-dna杂交体和r环。70.权利要求56-69中任一项的所述向导rna，其中所述引物结合位点的长度在约8个和约20个核苷酸之间。71.权利要求56-70中任一项的所述向导rna，其中所述引物结合位点的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。72.权利要求56-71中任一项的所述向导rna，其中所述延伸臂的长度为至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少100个核苷酸。73.权利要求56-72中任一项的所述向导rna，其中所述引物结合位点的长度为至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。74.权利要求56-73中任一项的所述向导rna，其中所述dna合成模板的长度为至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少100个核苷酸。75.权利要求56-74中任一项的所述向导rna，其中所述dna合成模板可以被rna依赖性dna聚合酶(例如，逆转录酶)用作模板以用于合成具有3’末端的相应单链dna flap，其中所述dna flap与邻近切口位点的内源性靶dna序列的链互补，且其中所述单链dna flap包含由所述dna合成模板编码的期望的核苷酸变化。76.权利要求75的所述向导rna，其中所述单链dnaflap置换已形成切口的靶dna序列中具有5’末端的内源性单链dna。77.权利要求76的所述向导rna，其中所述细胞切除具有游离5’末端的所述内源性单链
dna。78.权利要求77的所述向导rna，其中所述单链dnaflap的细胞修复导致所述核苷酸变化的安装，从而形成经编辑的dna产物。79.权利要求78的所述向导rna，其中所述核苷酸变化是插入。80.权利要求79的所述向导rna，其中所述插入的长度为至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少100个核苷酸。81.权利要求79的所述向导rna，其中所述插入是编码多肽的序列。82.引导编辑复合物，其包含napdnabp、rna依赖性dna聚合酶和权利要求56-81中任一项的所述向导rna。83.权利要求82的所述引导编辑复合物，其中所述napdnabp和所述rna依赖性dna聚合酶形成为融合蛋白。84.权利要求82的所述引导编辑复合物，其中所述napdnabp是cas9。85.权利要求84的所述引导编辑复合物，其中所述cas9是cas9切口酶或其变体。86.权利要求84的所述引导编辑复合物，其中所述cas9具有选自由seq id no：1-135514组成的组的氨基酸序列。87.权利要求83的所述引导编辑复合物，其中所述融合蛋白具有选自由seq id no：1-135514组成的组的氨基酸序列。88.权利要求83的所述引导编辑复合物，其中所述融合蛋白包含接合所述napdnabp和rna依赖性dna聚合酶的接头。89.权利要求88的所述引导编辑复合物，其中所述接头具有选自由seq id no：1-135514组成的组的氨基酸序列。90.编码权利要求82-89中任一项的所述引导编辑复合物的一种或多种多核苷酸。91.载体，其包含权利要求90的所述多核苷酸和驱动所述向导rna和所述引导编辑复合物的融合蛋白的表达的一个或多个启动子。92.细胞，其包含权利要求91的所述载体。93.细胞，其包含权利要求82-89中任一项的引导编辑复合物。94.药物组合物，其包含：(i)权利要求56-81中任一项的向导rna、权利要求82-89的引导编辑复合物、权利要求90的多核苷酸或权利要求91的载体；和(ii)药学上可接受的赋形剂。95.在核酸序列中安装核苷酸变化的方法，所述方法包括：使所述核酸序列与包含融合蛋白和权利要求56-81中任一项的向导rna的复合物接触，其中所述融合蛋白包含napdnabp和rna依赖性dna聚合酶，其中所述向导rna包含间隔区、grna核心和包含dna合成模板和引
物结合位点的延伸臂，所述dna合成模板编码核苷酸变化，且其中所述间隔区能够退火至邻近可用pam和前间隔区(protospacer)的非pam链；由此(i)在pam链上使双链dna序列形成切口，由此产生具有3’末端的游离单链dna；(ii)在所述引物结合位点处将所述游离单链dna的3’末端与所述向导rna杂交，由此引导所述rna依赖性dna聚合酶；(iii)从dna的3’末端聚合dna的链，由所述dna合成模板编码，由此产生从所述dna的3’末端延伸的单链dna flap，其中所述flap包含所述核苷酸变化；(iv)用所述单链dna flap替换紧邻所述pam链上切割位点的下游的所述内源性dna链，由此在所述双链dna序列中安装所述核苷酸变化。96.权利要求95的所述方法，其中当步骤(v)在细胞内完成时，所述细胞通过细胞dna修复和/或复制来修复非编辑链。97.权利要求95的所述方法，其中所述核苷酸变化是单个核苷酸取代、缺失、插入或其组合。98.权利要求97的所述方法，其中所述单个核苷酸取代是转换或颠换。99.权利要求97的所述方法，其中所述单个核苷酸取代是(1)g到t取代，(2)g到a取代，(3)g到c取代，(4)t到g取代，(5)t到a取代，(6)t到c取代，(7)c到g取代，(8)c到t取代，(9)c到a取代，(10)a到t取代，(11)a到g取代，或(12)a到c取代。100.权利要求97的所述方法，其中所述单个核苷酸取代转换(1)g：c碱基对为t：a碱基对，(2)g：c碱基对为a：t碱基对，(3)g：c碱基对为c：g碱基对，(4)t：a碱基对为g：c碱基对，(5)t：a碱基对为a：t碱基对，(6)t：a碱基对为c：g碱基对，(7)c：g碱基对为g：c碱基对，(8)c：g碱基对为t：a碱基对，(9)c：g碱基对为a：t碱基对，(10)a：t碱基对为t：a碱基对，(11)a：t碱基对为g：c碱基对，或(12)a：t碱基对为c：g碱基对。101.权利要求97的所述方法，其中所述核苷酸变化是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的插入或缺失。102.权利要求97的所述方法，其中所述核苷酸变化是多肽编码序列的插入。103.权利要求97的所述方法，其中所述核苷酸变化校正疾病相关基因。104.权利要求103的所述方法，其中所述疾病相关基因与选自由以下组成的组的单基因病症相关：腺苷脱氨酶(ada)缺乏症；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；囊性纤维化；假肥大型肌营养不良症；半乳糖血症；血色沉着病；亨廷顿氏病；枫糖浆尿病；马凡综合征；1型神经纤维瘤病；先天性厚甲症；苯丙酮尿症；严重联合免疫缺陷；镰状细胞贫血病；史-李-欧综合征；和泰萨克斯病。105.权利要求103的所述方法，其中所述疾病相关基因与选自由以下组成的组的多基因病症相关：心脏病；高血压；阿尔茨海默氏病；关节炎；糖尿病；癌症；和肥胖。106.向导rna，其用于引导编辑以利用插入、缺失、倒位、取代或其组合来改变靶dna分子的核苷酸序列以产生相应的经编辑的dna分子，其中：(i)所述向导rna能够与融合蛋白形成复合物，所述融合蛋白包含napdnabp和包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域；(ii)所述向导rna包含(a)能够退火至邻近所述靶dna分子上的pam链上的可用pam和前间隔区的非pam链的间隔区，和(b)grna核心；
(iii)所述向导rna，其在所述向导rna的5’或3’末端处进一步包含延伸臂；(iv)所述延伸臂包含(a)引物结合位点和(b)dna合成模板，其中所述dna合成模板编码单链dna flap，所述单链dna flap包括编辑以整合替代紧邻所述pam链上切割位点的下游的内源性链；(v)所述靶dna分子选自由seq id no：seq id no：1217353-1289387组成的组；和(vi)所述相应的经编辑的dna分子选自由seq id no：1289388-1361420组成的组。107.权利要求106的所述向导rna，其中所述靶dna分子是clinvar变体序列。108.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是cas9、cas12e、cas12d、cas12a、cas12b1、cas13a、cas12c或argonaute，或cas9、cas12e、cas12d、cas12a、cas12b1、cas13a、cas12c或argonaute的变体。109.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp结构域包含切口酶活性。110.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是cas9或其变体。111.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是核酸酶活性的cas9、无核酸酶活性的cas9(dcas9)或cas9切口酶(ncas9)。112.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是cas9切口酶(ncas9)。113.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp包含氨基酸。114.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是氨基酸序列1361421-1361428中的任一项，或与seq id no：1361421-1361428中的任一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的spcas9野生型或其变体。115.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是氨基酸序列1361429-1361442中的任一项，或与seq id no：1361429-1361442中的任一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的spcas9直系同源物(ortholog)。116.权利要求106的所述向导rna，其中所述napdnabp是氨基酸序列1361421-1361484中的任一项，或与seq id no：1361421-1361484中的任一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。117.权利要求106的所述向导rna，其中所述包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域是逆转录酶。118.权利要求117的所述向导rna，其中所述逆转录酶是具有seq id no：1361485-1361496中的任一项的氨基酸序列，或与seq id no：1361485-1361496中的任一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的天然存在的野生型逆转录酶。119.权利要求117的所述向导rna，其中所述逆转录酶是具有seq id no：1361497-1361514中的任一项的氨基酸序列，或与seq id no：1361497-1361514中的任一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的变体逆转录酶。120.权利要求106的所述向导rna，其中所述融合蛋白包含seq id no：1361515-1361519中的任一项的氨基酸序列，或与seq id no：1361515-1361519中的任一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。121.权利要求106的所述向导rna，其中所述融合蛋白包含seq id no：1361515(pe1)或1361516(pe2)的氨基酸序列，或与seq id no：1361515或1361516中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
122.权利要求106的所述向导rna，其中所述可用的pam序列是步骤(i)中使用的napdnabp的功能。123.权利要求106的所述向导rna，其中所述可用的pam序列选自由以下组成的组：(a)5
′‑
ngg-3
′
(规范pam序列)，(b)5
′‑
nng-3
′
，(c)5
′‑
nna-3
′
，(d)5
′‑
nnc-3
′
，(e)5
′‑
nnt-3
′
，(f)5
′‑
ngt-3
′
，(g)5
′‑
nga-3
′
，(h)5
′‑
ngc-3
′
，(i)5
′‑
naa-3
′
，(j)5
′‑
nac-3
′
，(k)5
′‑
nag-3
′
和(l)5
′‑
nat-3
′
，对其的选择是napdnabp的选择的功能。124.权利要求106的所述向导rna，其中步骤(v)的seq id no：1217353-1289387的核苷酸序列中的任一项的编辑位点以5’至3’定向在位置201处开始。125.权利要求106的所述向导rna，其中所述核苷酸变化是核苷酸取代、缺失、插入或其组合。126.权利要求106的所述向导rna，其中所述核苷酸取代是转换或颠换。127.权利要求106的所述向导rna，其中所述单核苷酸取代是(1)g到t取代，(2)g到a取代，(3)g到c取代，(4)t到g取代，(5)t到a取代，(6)t到c取代，(7)c到g取代，(8)c到t取代，(9)c到a取代，(10)a到t取代，(11)a到g取代，或(12)a到c取代。128.权利要求106的所述向导rna，其中所述单核苷酸取代转换(1)g：c碱基对为t：a碱基对，(2)g：c碱基对为a：t碱基对，(3)g：c碱基对为c：g碱基对，(4)t：a碱基对为g：c碱基对，(5)t：a碱基对为a：t碱基对，(6)t：a碱基对为c：g碱基对，(7)c：g碱基对为g：c碱基对，(8)c：g碱基对为t：a碱基对，(9)c：g碱基对为a：t碱基对，(10)a：t碱基对为t：a碱基对，(11)a：t碱基对为g：c碱基对，或(12)a：t碱基对为c：g碱基对。129.权利要求106的所述向导rna，其中所述期望的核苷酸变化是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的插入或缺失。130.权利要求106的所述向导rna，其中所述核苷酸变化是多肽编码序列的插入。131.权利要求106的所述向导rna，其中所述核苷酸变化校正疾病相关基因。132.权利要求131的所述向导rna，其中所述疾病相关基因与选自由以下组成的组的单基因病症相关：腺苷脱氨酶(ada)缺乏症；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；囊性纤维化；假肥大型肌营养不良症；半乳糖血症；血色沉着病；亨廷顿氏病；枫糖浆尿病；马凡综合征；1型神经纤维瘤病；先天性厚甲症；苯丙酮尿症；严重联合免疫缺陷；镰状细胞贫血病；史-李-欧综合征；和泰萨克斯病。133.权利要求131的所述向导rna，其中所述疾病相关基因与选自由以下组成的组的多基因病症相关：心脏病；高血压；阿尔茨海默氏病；关节炎；糖尿病；癌症；和肥胖。134.在核酸序列中安装核苷酸变化的方法，所述方法包括：使所述核酸序列与包含融合蛋白和权利要求56-81中任一项的向导rna的复合物接触。135.权利要求134的所述方法，其中所述融合蛋白包含napdnabp和rna依赖性dna聚合酶。136.权利要求134的所述方法，其中所述向导rna包含间隔区、grna核心和包含dna合成模板和引物结合位点的延伸臂。137.权利要求136的所述方法，其中所述dna合成模板编码核苷酸变化。138.权利要求134-137中任一项的所述方法，其中所述向导rna能够与适于引导编辑的napdnabp结合并将所述napdnabp引导至靶dna序列。
139.权利要求138的所述方法，其中所述靶核酸序列包含靶链(或pam或编辑链)和互补非靶链(或非pam或非编辑链)，其中所述向导rna的间隔区与所述非pam链杂交以形成rna-dna杂交体和r环。140.权利要求136的所述方法，其中所述引物结合位点的长度在约8个和约20个核苷酸之间。141.权利要求136的所述方法，其中所述引物结合位点的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。142.权利要求136的所述方法，其中所述延伸臂的长度为至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少100个核苷酸。143.权利要求136的所述方法，其中所述引物结合位点的长度为至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。144.权利要求136的所述方法，其中所述dna合成模板的长度为至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少100个核苷酸。145.权利要求136的所述方法，其中所述dna合成模板可以被rna依赖性dna聚合酶(例如，逆转录酶)用作模板以用于合成具有3’末端的相应单链dnaflap，其中所述dna flap与邻近切口位点的内源性靶dna序列的链互补，且其中所述单链dna flap包含由所述dna合成模板编码的期望的核苷酸变化。146.权利要求145的所述方法，其中所述单链dna flap置换已形成切口的靶dna序列中具有5’末端的内源性单链dna。147.权利要求146的所述方法，其中所述细胞切除具有游离5’末端的所述内源性单链dna。148.权利要求145的所述方法，其中所述单链dna flap的细胞修复导致所述核苷酸变化的安装，从而形成经编辑的dna产物。149.权利要求148的所述方法，其中所述核苷酸变化是插入。
150.权利要求149的所述方法，其中所述插入的长度为至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少100个核苷酸。151.权利要求149的所述方法，其中所述插入是编码多肽的序列。

技术总结
本公开提供了用于引导编辑的新的引导编辑器向导RNA、用于引导编辑的构建体及其使用方法。此外，本公开提供了用于进行靶DNA分子(例如，基因组)的引导编辑的组合物和方法，其能够掺入核苷酸变化和/或靶向诱变(例如，插入或缺失)。核苷酸变化可以包括单个核苷酸变化(例如，任何转换或任何颠换)、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。更具体地，本公开提供了包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)和聚合酶(例如逆转录酶)的融合蛋白，其由引导编辑器RNA(PEgRNA)引导至特定DNA序列。引导编辑器向导RNA包含延伸臂，该延伸臂提供编码单链DNA flap的DNA合成模板序列，该序列与内源性DNA序列同源，但含有期望的一个或多个核苷酸变化，并且在由聚合酶(例如逆转录酶)合成后掺入到靶DNA分子中。录酶)合成后掺入到靶DNA分子中。[转续页]


技术研发人员：D
受保护的技术使用者：哈佛大学的校长及成员们 麻省理工学院
技术研发日：2020.03.19
技术公布日：2022/7/9