DNA聚合酶和DNA聚合酶衍生的3

技术特征：
1.一种分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中dna外切核酸酶基本上没有聚合酶活性，并且其中在高于25℃，如高于约30℃的温度下所述酶不可逆地失活。2.一种分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，所述dna聚合酶包含seq id no.1的氨基酸序列，或包含与seq id no.1全长序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。3.一种分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，所述dna聚合酶包含seq id no.2的氨基酸序列，或包含与seq id no.2全长序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求2或3所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，包含与seq id no.1或seq id no.2的全长序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，如与seq id no.1或seq id no.2全长序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，如与seq id no.1或seq id no.2全长序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求2-4中任一项所述的分离的dna聚合酶或其酶活性片段，其中所述氨基酸序列在对应于氨基酸位置v440-y447和位置g519-a523的至少一个氨基酸区域中包含至少一个突变，编号是根据seq id no.2中的氨基酸编号。6.根据权利要求2-5中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中442、445和568位置的氨基酸选自由以下组成的组中：seq id no.1的氨基酸位置氨基酸442asp、glu、ala、gly、val、leu、ile445ser、arg、lys、his568asp、glu、ala、gly、val、leu、ile并且条件是位置442(d442)、445(s445)和568(d568)的氨基酸分别不同时是asp、ser和asp。7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶选自包含以下氨基酸序列的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶的组中，其中-位置442的氨基酸是ala；-位置568的氨基酸是ala；-位置442的氨基酸是glu；-位置568的氨基酸是glu；-位置442和568的氨基酸是ala；和-位置445的氨基酸是arg并且其中所述氨基酸的编号是根据seq id no.1。8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶包含选自由seq id no：3、4、5、6、7和8组成的组中的氨基酸序列，或包含分别地与seq id no.3、4、5、6、7和8全长序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是-seq id no.3中位置442的氨基酸是ala；-seq id no.4中位置568的氨基酸是ala；
‑
seq id no.5中位置442的氨基酸是glu；-seq id no.6中位置568的氨基酸是glu；-seq id no.7中位置442和568的氨基酸是ala；和-seq id no.8中位置445的氨基酸是arg。9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶是dna聚合酶ii衍生的3'-5'外切核酸酶。10.一种组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段和缓冲剂。11.一种编码根据权利要求1-9中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段的核酸分子。12.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含seq id no.9或与seq id no.9全长序列具有至少80％序列同一性的序列。13.一种表达载体，包含编码根据权利要求1-9中任一项所述的分离的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段的核酸分子和对于转录和翻译由所述核酸分子编码的蛋白质序列必要的调节序列。14.一种宿主细胞，包含一种或多种根据权利要求13所述的表达载体或一种或多种根据权利要求12-11中任一项所述的核酸分子。15.一种用于制备根据权利要求1-9中任一项所述的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段的方法，包括以下步骤：a)在适合于表达编码的dna聚合酶的条件下培养包含一种或多种根据权利要求13所述的重组表达载体或一种或多种根据权利要求11-12中任一项所述的核酸分子的宿主细胞；b)从所述宿主细胞中或从培养基或上清液中分离或获得dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶。16.根据权利要求1-9中任一项所述的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段在重组克隆过程中的用途，其中所述外切核酸酶或其酶活性片段提供双链dna分子的单链dna悬突。17.一种用于从样品中去除污染多核苷酸的方法，所述方法包括使所述样品与根据权利要求1-9中任一项所述的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段接触。18.一种用于缺失一个或多个靶双链核酸分子的片段的方法，所述方法包括使一个或多个双链核酸分子与根据1-9中任一项所述的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段接触，其中所述外切核酸酶在双链核酸分子的3'-5'方向切割核苷酸从而产生互补单链5'悬突。19.一种用于组装两个或更多个双链(ds)dna分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供两个或更多个待组装的dsdna分子，其中所述dsdna分子的末端共享序列同一性区域；(b)将所提供的两个或更多个dna分子与根据权利要求1-9中任一项所述的热不稳定dna聚合酶衍生的3'-5'接触，由此在所提供的dsdna分子的两端都产生单链悬突；(c)在以下条件下培养(a)的dna分子：藉此所述dna分子通过步骤(b)中产生的悬突部
分退火；(d)可选地使步骤(c)中提供的退火分子与dna聚合酶接触并允许dna聚合酶填充间隙，其中所述dna聚合酶具有降低的、受损的或失活的链置换活性。20.一种将至少一个靶双链核酸分子插入受体核酸分子中以提供重组双链核酸分子的方法，包括以下步骤：(a)使根据权利要求1-9中任一项所述的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段与靶双链核酸分子接触，其中所述外切核酸酶在靶链核酸分子的平末端的3'-5'方向上切割核苷酸以产生互补单链5'悬突；(b)使根据权利要求1-9中任一项所述的dna聚合酶衍生的3'-5'外切核酸酶或其酶活性片段与双链受体核酸分子接触，其中所述外切核酸酶在所述受体核酸分子的平末端的3'-5'方向上切割核苷酸以产生互补单链5'悬突；(c)提供反应混合物，所述反应混合物包含步骤(a)和(b)的产物，dna聚合酶，能够与(a)和(b)的一部分核酸分子退火的寡核苷酸引物，和核苷酸；(d)在以下条件下培养所述反应混合物：藉此所述寡核苷酸引物与步骤(a)和(b)的核酸分子退火，并且藉此所述dna聚合酶通过聚合一个或多个核苷酸延伸所述寡核苷酸引物，以产生重组双链分子。

技术总结
本发明涉及具有DNA聚合酶和3'-5'外切核酸酶活性的酶。具体而言，本发明涉及具有海洋来源的DNA聚合酶II活性和3'-5'外切核酸酶活性的热不稳定酶。此外，本发明涉及主要发挥3'-5'活性，即不存在聚合酶活性的DNA聚合酶。本发明还涉及外切核酸酶活性用于降解双链DNA的3'-5'链从而例如在重组克隆过程中或在去除污染核酸分子的过程中进行单链悬突的用途。染核酸分子的过程中进行单链悬突的用途。


技术研发人员：阿特勒
受保护的技术使用者：特罗姆瑟大学-挪威北极圈大学
技术研发日：2020.10.01
技术公布日：2022/7/9