用于在治疗皮肤疾病中使用的抗炎化合物的制作方法

用于在治疗皮肤疾病中使用的抗炎化合物
1.本技术要求于2019年11月22日提交的印度专利申请第201911047906号的权益，其通过引用由此并入。
技术领域
2.本发明涉及用于治疗选自由以下组成的群组的一种或多种疾状的式i化合物(下文示出)：伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹及银屑病，以及含有式i化合物和药学上可接受的赋形剂的局部组合物。
[0003][0004]
x-＝任何卤素。


背景技术：

[0005]
氧化应激是阻碍组织修复和再生过程的主要事件之一。清除过度积累的自由基引发更快的愈合过程，可能通过促进在伤口部位处的必备血管新生和新血管形成来实现。
[0006]
香豆素由广泛分布在天然植物中的一组酚类化合物组成，并且它们具有广泛的药理学活性。参见例如，egan等人，《药物代谢评论(drug metab.rev.)》,22:503-529,1990。其中，据报道，当在用叔丁基氢过氧化物治疗之前腹膜内施用时，七叶亭(6,7-二羟基香豆素)(化合物2)降低肝酶标记物alt(丙氨酸氨基转移酶)和ast(天冬氨酸氨基转移酶)的血清水平。参见，例如，lin等人，《毒理学档案(arch.toxicol.)》,74,467-72,2000。
[0007][0008]
化合物2
[0009]
然而，由于香豆素通常在体内具有较差的生物利用度，并且不在线粒体内显著累积，因此其有效性仍然有限。鉴于此，香豆素通常必须以较高浓度进行使用以清除线粒体活性氧类。
[0010]
美国专利第9,580,452号公开了具有抗动脉粥样硬化效应的式i(下文所示)的三苯基膦阳离子(tpp )偶联的七叶亭。
[0011][0012]
x-＝任何卤素。
[0013]
需要对伤口相关病症和银屑病的改善治疗。


技术实现要素：

[0014]
本发明人已惊讶地发现，式i化合物可用于治疗各种伤口相关疾状和银屑病。在一个优选的实施例中，式i化合物局部施用。
[0015]
一个实施例是式i化合物用于治疗伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹及银屑病中的一种或多种。
[0016][0017]
x-＝任何卤素(如br-或cl-)。
[0018]
在一个优选的实施例中，x-是br-或cl-。在一个更优选的实施例中，x-是br-。
[0019]
另一个实施例是一种在有需要的受试者中治疗伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹、银屑病以及其任何组合的方法。所述方法包括向受试者(优选局部)施用治疗有效量的式i化合物：
[0020][0021]
x-＝任何卤素(如br-或cl-)。
[0022]
在一个优选的实施例中，x-是br-或cl-。在一个更优选的实施例中，x-是br-。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施用治疗有效浓度的式i化合物。
[0023]
在一个实施例中，式i化合物是化合物1：
[0024][0025]
化合物1。
附图说明
[0026]
图1是示出从第1天至第26天基于乳膏的溶媒(溶媒)每天局部施用于糖尿病(db/db)小鼠的皮肤表面上的伤口后的第1、3、6、9、10天和第26天的效果的照片(溶媒对照组)。
[0027]
图2是示出从第1天至第10天每天局部施用于糖尿病(db/db)小鼠的皮肤表面上的伤口的在溶媒中制备的化合物1(0.625％w/w)的第1、3、6、9天和第10天的效果的照片。
[0028]
图3是示出从第1天至第26天每天局部施用于糖尿病(db/db)小鼠的皮肤表面上的伤口的在溶媒中制备的化合物1(2.5％)的第1、3、6、9、10天和第26天的效果的照片。
[0029]
图4a是示出在第0、3、6、9、12和20天，a)在溶媒中制备的化合物1(各浓度为0.625％、1.25％和2.5％)、b)在溶媒中制备的化合物2(2.5％)和c)溶媒局部施用于糖尿病(db/db)小鼠的皮肤表面上的伤口区域上和周围的伤口的效果的照片。图4b是示出上述组
从第0天至第20天(x轴)的时间伤口闭合百分比(y轴)的图。
[0030]
图5是示出在第0天、第10天和第20天，a)在溶媒中制备的化合物1(各浓度为0.625％、1.25％和2.5％)、b)在溶媒中制备的化合物2(2.5％)和c)溶媒局部施用于非糖尿病(c57)小鼠皮肤表面上的伤口的效果和对伤口区域上和周围的毛发生长的效果的照片。
[0031]
图6是示出在第0天、第1-8天和第18天，a)溶媒和b)在溶媒中制备的化合物1(2.5％)局部施用于兔皮肤表面上的手术切口伤口(切口伤口深度为2mm且切口伤口长度为3cm)的效果的照片。
[0032]
图7是示出在治疗后20天，a)溶媒和b)在溶媒中制备的化合物1(2.5％)局部施用于兔皮肤表面上的伤口的效果的照片。
[0033]
图8是示出在第0天、第4天和第7天，局部施用a)溶媒、b)在溶媒中制备的化合物1(0.625％)、c)在溶媒中制备的化合物1(0.625％)和ex-527(6-氯-2,3,4,9-四氢-1h-咔唑-1-甲酰胺，也称为selisitit——一种sirt1抑制剂)(0.025％)的组合和d)在溶媒中制备的ex-527(0.025％)对糖尿病(db/db)小鼠模型中的手术切口伤口的愈合的效果的照片。
[0034]
图9是示出如实例5和表3中所描述，在治疗7天后的第8天测量的皮肤组织的拉伸强度测量值的照片。
[0035]
图10描绘了银屑病模型中红斑、脱皮、皮肤厚度和耳厚度以及体重减轻百分比的银屑病面积和严重度指数(pasi)评分。
[0036]
图11描绘了如实例6中所描述的不同治疗组的代表性小鼠在第0天、第2天、第4天、第6天和第7天的小鼠背部皮肤的表型图像。
[0037]
图12描绘了使用如实例6中所描述的酶联免疫吸附测定(“elisa”)测量的皮肤组织中的促炎性细胞因子il-17和il 23的水平(pg/ml)。
[0038]
图13描绘了如实例6中所描述的不同治疗组的代表性小鼠的背部皮肤的苏木精和曙红(“h&e”)染色(10倍和40倍放大)。
具体实施方式
[0039]
如根据本公开所使用，除非另有说明，否则所有技术和科学术语应理解为具有与所属领域通常理解的相同的含义。除非上下文另有规定，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。除非另外陈述，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明实施例，并且不对权利要求书的范围施加限制。
[0040]
术语“伤口”是指任何对受试者的皮肤组织造成组织内连续性中断的创伤，并且其中皮肤被撕破、刺破或割伤。伤口通常包括例如切口、划伤、裂伤、切伤、割伤、擦伤、穿刺伤口、创伤性皮肤损伤、烧伤和穿透伤口。伤口可以是慢性的，例如，疾病或其它引起组织损伤的慢性伤口，如糖尿病伤口和糖尿病足溃疡、压疮或压力溃疡、静脉腿溃疡；或急性的，例如由事故、损伤或外科手术引起的伤口。医疗程序也可能引起伤口，如皮肤或美容手术程序。
[0041]
术语“疤痕”是指皮肤组织上留下的标记，其中伤口尚未完全愈合，并且纤维结缔组织已经在伤口上和周围发展。这包括在伤口的愈合期间或之后的此类标记或纤维结缔组织的形成。疤痕症状包括例如皮肤疤痕变色(包括发红或色素沉着变化)、红斑、干燥、剥脱或皮肤瘙痒、突出于周围皮肤区域、瘢痕疙瘩形成、month thick bar、疤痕疼痛、疤痕的减少和/或周围组织多血管、柔韧性降低和外观不良(包括疤痕组织块和纹理)。由伤口引起的
疤痕也可以根据本发明治疗。
[0042]
术语“伤口愈合”或“伤口的愈合”是指恢复组织完整性，并且术语可以互换使用。应理解，这些术语可指组织完整性的部分或完全恢复。因此，伤口的治疗是指与伤口愈合过程相关联的一个或多个阶段或过程的促进、改善、进展、加速或以其它方式提升。出于本发明的目的，伤口愈合障碍包括可能损害、抑制、干扰或延迟与伤口愈合相关的一个或多个阶段或过程的促进、改善、进展、加速或以其它方式提升的任何和所有原因、程序。如本文所述的伤口愈合障碍包括由化学治疗剂或抗血管生成药物引起的伤口愈合障碍。
[0043]
本文的术语“治疗有效量”和“治疗有效浓度”是指在组织、系统、动物、个体或人类中引发生物学或医学响应的活性化合物或药剂的量或浓度，包括下列一项或多项：(1)预防、压制或延迟疾病；例如，预防、压制或延迟可能易患疾病、疾状或病症但尚未经历或显示疾病的病理学或症候学的个体的疾病、疾状或病症，(2)抑制疾病；例如，抑制正在经历或显示疾病、疾状或病症的病理学或症候学的个体的疾病、疾状或病症(即，停止病理学和/或症候学的进一步发展)，以及(3)减轻疾病；例如，减轻正在经历或显示疾病、疾状或病症的病理学或症候学的个体的疾病、疾状或病症(即，逆转病理学和/或症候学)。
[0044]
除非另有说明，否则局部组合物中所有活性成分，如化合物1的浓度均以重量百分比计，基于组合物的100％总重量。
[0045]
式i化合物可以如美国专利第9,580,452号中所述制备。
[0046]
下文描述本发明的各种实施例。
[0047]
在一个方面，本发明涉及用于通过局部施用于(例如，皮肤的受累区域或伤口)有需要的受试者治疗选自由以下组成的群组的一种或多种疾状的式i化合物：伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹及银屑病。
[0048][0049]
其中x-是任何卤素(如br-或cl-)。在一个优选的实施例中，x-是br-或cl-。在一个更优选的实施例中，x-是br-。
[0050]
在一个实施例中，本发明涉及用于治疗伤口的式i化合物。
[0051]
在另一个实施例中，本发明涉及用于治疗伤口愈合障碍的式i化合物。
[0052]
在进一步的实施例中，本发明涉及用于治疗伤口上和周围的毛发损失的式i化合物。治疗伤口上和周围的毛发损失的特征可以在于促进和/或加速伤口部位上和周围的毛发生长。
[0053]
在又一个实施例中，本发明涉及用于治疗伤口上和周围的疤痕和/或皱纹的式i化合物。疤痕和/或皱纹的治疗的特征可以在于最小化伤口部位上和周围的疤痕和/或皱纹的出现。
[0054]
待使用根据本文所述实施例中的任一实施例的式i化合物治疗的伤口可以是糖尿病伤口、切口伤口、手术伤口、意外伤口、压力溃疡或褥疮、糖尿病足溃疡、坏疽性脓皮病、烧伤、病变、割伤或其任何组合。
[0055]
在另一个实施例中，本发明涉及用于治疗伤口愈合障碍的式i化合物，其中由于一种或多种药物，如例如免疫抑制剂、化学治疗剂、抗凝血剂、nsaid、血小板聚集抑制剂、抗血管生成药物以及它们的任何组合的同时施用，伤口愈合受到阻碍。
[0056]
在另一个实施例中，本发明涉及用于治疗银屑病的式i化合物。
[0057]
在本文所述的任何用途或方法的优选的实施例中，式i化合物是化合物1:
[0058][0059]
化合物1。
[0060]
在另一个方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹、银屑病或其任何组合的方法。所述方法包括施用(例如，在受累区域局部施加)治疗有效量的式i化合物(如式1的化合物，其中x是br)。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施加治疗有效浓度的式i化合物。
[0061]
在一个实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括向受试者施用(例如，局部施加)治疗有效量的式i化合物(如化合物1)。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施加治疗有效浓度的式i化合物。
[0062]
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的伤口愈合障碍的方法，所述方法包括向受试者施用(例如，局部施加)式i化合物。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施加治疗有效浓度的式i化合物。
[0063]
在进一步的实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的伤口上和周围的毛发损失的方法，其包括向受试者施用(例如，局部施加)式i化合物。治疗伤口上和周围的毛发损失的特征可以在于促进和/或加速伤口部位上和周围的毛发生长。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施加治疗有效浓度的式i化合物。
[0064]
在又一个实施例中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的伤口上和周围的疤痕和/或皱纹的方法，其包括向受试者施用(例如，局部施加)式i化合物。疤痕和/或皱纹的治疗的特征可以在于最小化伤口部位上和周围的疤痕和/或皱纹的出现。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施加治疗有效浓度的式i化合物。
[0065]
在本文所述的治疗伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失或伤口上和周围的疤痕和/或皱纹的方法中的任一方法中，伤口可以是糖尿病伤口、切口伤口、手术伤口、意外伤口、压力溃疡/褥疮、糖尿病足溃疡、坏疽性脓皮病、烧伤、病变或割伤。
[0066]
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗银屑病的方法，其包括向有需要的受试者施用(例如，局部施加)式i化合物。在一个优选的实施例中，所述方法包括在受试者的受累区域局部施加治疗有效浓度的式i化合物(如化合物1)。
[0067]
在本文所述方法中的任一方法的优选的实施例中，式i化合物是化合物1:
[0068][0069]
化合物1。
[0070]
在本文所述实施例中的任一实施例中，伤口存在于受试者的皮肤的表面上。在一个实施例中，受试者是哺乳动物。在一个优选的实施例中，受试者是人类。本文所述的方法可用于人类治疗学和兽药应用中。出于兽医学目的，术语“受试者”包括但不限于农场动物，包括牛、绵羊、猪、马和山羊；伴侣动物，如犬和猫；外来动物和/或动物园动物；实验室动物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠；以及家禽，如鸡、火鸡、鸭和鹅。
[0071]
另一个实施例涉及一种局部组合物和试剂盒，其包含治疗有效浓度或量的式i化合物和任选地药学上可接受的赋形剂。本文所述的组合物可用于治疗伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹、银屑病或其任何组合。
[0072]
在一个实施例中，本发明涉及一种局部组合物，其包含治疗有效量的用于治疗伤口的式i化合物和任选地药学上可接受的赋形剂。
[0073]
在另一个实施例中，本发明涉及一种用于治疗伤口愈合障碍的局部组合物，其包含治疗有效量的式i化合物和任选地药学上可接受的赋形剂。
[0074]
在一个实施例中，本发明涉及一种用于治疗伤口上和周围的毛发损失的局部组合物，其包含治疗有效量的式i化合物和任选地药学上可接受的赋形剂。治疗伤口上和周围的毛发损失的特征可以在于促进和/或加速伤口部位上和周围的毛发生长。
[0075]
在又一个实施例中，本发明涉及一种用于治疗伤口上和周围的疤痕和/或皱纹的局部组合物，其包含治疗有效量的式i化合物和任选地药学上可接受的赋形剂。疤痕和/或皱纹的治疗的特征可以在于最小化伤口部位上和周围的疤痕和/或皱纹的出现。
[0076]
在另一个实施例中，本发明涉及一种用于治疗银屑病的局部组合物，其包含治疗有效量的式i化合物和任选地药学上可接受的赋形剂。
[0077]
在本文所述组合物中的任一组合物的优选的实施例中，式i化合物是化合物1。
[0078]
本文所述局部组合物中的任一局部组合进一步可以包含所属领域的普通技术人员已知的一种或多种合适的药学上可接受的赋形剂。所述组合物可以是局部剂型的形式，例如溶液、凝胶、软膏、乳膏、洗剂、糊剂、喷雾泡沫或气溶胶。式i化合物(如化合物1)可以用适当的药学上可接受的载体或稀释剂制成局部组合物，并且可以配制成半固体或液体形式。
[0079]
根据另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含治疗有效量的式i化合物(例如，呈局部组合物的形式)，和任选地，使用试剂盒的说明书。本文所述的试剂盒可用于治疗伤口、伤口愈合障碍、伤口上和周围的毛发损失、伤口上和周围的疤痕和/或皱纹、银屑病或其任何组合。
[0080]
以下实例用于说明本公开以上描述的具体实施例。它们仅出于解释性目的阐述，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
[0081]
实例
[0082]
一般方法和流程
[0083]
测试化合物的制备：为了在以下实例中进行动物研究，在包含乳化软膏、防腐剂(对氯甲酚)和水的溶媒中制备测试化合物的局部制剂。溶媒没有任何测试化合物。将测试化合物(化合物1和2)通过研磨掺入水性乳膏基质制剂中。根据英国药典程序，使用乳化软膏bp、对氯甲酚(防腐剂)和水制备水性乳膏。对照配制物不含任何活性成分。
[0084]
步骤1：乳化软膏的制备
[0085]
使用乳化蜡、白色软石蜡和液体石蜡制备乳化软膏。在水浴中熔化这些成分并加热至60℃，然后连续搅拌直至变冷。
[0086]
步骤2：阴离子乳化乳膏的制备
[0087]
将乳化软膏在水浴中熔化并加热至60℃，并且将所需量的对氯甲酚溶解于冷水中(氯甲酚在冷水中可溶)，使用温度计检查温度，并将净化水添加到熔化软膏中并连续搅拌直至变冷。
[0088]
步骤3：化合物1和2乳膏配制物的制备
[0089]
将所需量的化合物1或2添加到乳膏中，并用匀浆器混合。在药剂的适当混合之后，将配制物转移到合适的容器中，并在4℃下保存。
[0090]
乳化软膏基质制剂
[0091]
编号成分量(100克)量(20克)1乳化蜡3062白色软石蜡50103液体石蜡204
[0092]
对照配制物
[0093]
编号成分量(20克)1乳化软膏基质制剂6克2对氯甲酚0.02％3净化水13.98克
[0094]
配制物1-2.5％化合物1乳膏
[0095]
编号成分量(20克)1化合物1500mg(2.5％)2乳化软膏基质制剂6克3对氯甲酚0.02％4净化水13.48克
[0096]
配制物2-2.5％化合物2乳膏
[0097]
编号成分量(20克)1化合物2500mg(2.5％)2乳化软膏基质制剂6克3对氯甲酚0.02％4净化水13.48克
[0098]
配制物3-1.25％化合物2乳膏
[0099]
编号成分量(20克)
1化合物2250mg(1.25％)2乳化软膏基质制剂6克3对氯甲酚0.02％4净化水13.73克
[0100]
配制物4
‑‑
0.625％化合物2乳膏
[0101]
编号成分量(20克)1化合物2125mg(0.625％)2乳化软膏基质制剂6克3对氯甲酚0.02％4净化水13.85克
[0102]
实例1：化合物1对糖尿病(db/db)小鼠模型中的伤口区域上和/或周围的糖尿病伤口愈合过程和毛发生长的效果
[0103]
方法：在本研究中，使用db/db品系的小鼠(年龄：13-14周)，因为这种品系更类似于人类的糖尿病伤口愈合。在局部麻醉条件下，使用钻取活组织检查在db/db小鼠的背侧制备1cm2伤口。将动物分为5个组，每组中5只动物，如下所示：
[0104]
组1(n＝5)：用单独的溶媒治疗(糖尿病对照组)。
[0105]
组2(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物2(2.5％)治疗。
[0106]
组3(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物1(0.625％)治疗。
[0107]
组4(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物1(1.25％)治疗。
[0108]
组5(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物1(2.5％)治疗。
[0109]
本研究测试了化合物1的三个浓度，即0.625％、1.25％和2.5％。每天在伤口上施用局部制剂一次，持续12天。使伤口区域的图像可视化，并且在研究的每一天记录伤口区域的测量值。
[0110]
结果：在第26天，糖尿病对照组和组2显示伤口闭合(参见图1和图3)。在第10天，在组3-5中观察到伤口完全闭合(参见图2和图4a和4b(时间伤口闭合百分比))。表1示出了在各组中观察到的伤口愈合百分比。
[0111]
表1.db-db小鼠伤口愈合观察结果
[0112][0113]
实例2：化合物1对非糖尿病c-57小鼠模型中的伤口区域上和/或周围的伤口愈合和毛发生长的效果
[0114]
方法：在本研究中，使用c57bl/6j小鼠品系(年龄:12周)研究伤口愈合过程。使用
钻取活组织检查在c57小鼠的背侧制备1cm2伤口。将动物分为5个组，每组由5只动物组成，如下所示：
[0115]
组6(n＝5)：用单独的溶媒治疗(非糖尿病对照组)。
[0116]
组7(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物2(2.5％)治疗。
[0117]
组8(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物1(0.625％)治疗。
[0118]
组9(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物1(1.25％)治疗。
[0119]
组10(n＝5)：用在溶媒中制备的化合物1(2.5％)治疗。
[0120]
本研究中测试了在溶媒中制备的三个浓度的化合物1，即0.625％、1.25％和2.5％。从伤口产生后12小时开始，每天在伤口上施用局部制剂一次，持续12天。使伤口区域的图像可视化，并且在研究的每一天记录区域测量值。
[0121]
结果：在第14天，非糖尿病对照组和组6显示伤口闭合(参见图5)。从第9天至第12天，在组8-10中观察到伤口完全闭合。表2示出了在各组中观察到的伤口愈合百分比。
[0122]
表2.c57bl/6j小鼠伤口愈合观察结果
[0123][0124][0125]
实例3：化合物1对兔中的切口伤口愈合的效果
[0126]
方法：在本研究中，使用体重在2.0-2.5kg之间的新西兰兔，并将其分为两组；
[0127]
对照组：用单独的溶媒治疗。
[0128]
测试组：用在溶媒中制备的化合物1(2.5％)治疗。
[0129]
在锋利手术刀的帮助下，在脊柱两侧皮肤的整个厚度上各制备2cm的椎旁直切口。在完全止血后，通过以约1cm的间隔等距节点放置的间断缝线来闭合伤口(参见图6)。从受伤日后第0天至第14天，每天对动物进行一次治疗。在研究期间每天拍摄图像。在第7天时移除缝线并观察伤口闭合。
[0130]
结果：将测试组兔与溶媒基质对照组兔在研究期间的每个时间点的伤口闭合进行比较。与未治疗的对照组兔相比，在测试组兔中，在8天内观察到更快的手术伤口愈合。与对照组兔相比，在测试组兔中未观察到手术疤痕。(参见图7)。
[0131]
实例4：化合物1对糖尿病小鼠(db/db)模型中的切口伤口愈合的效果
[0132]
方法：在本研究中，使用db/db品系的小鼠(年龄：12周)。将动物分为四组：
[0133]
组11：用单独的溶媒治疗小鼠对照。
[0134]
组12：用在溶媒中制备的化合物1(0.625％)治疗小鼠。
[0135]
组13：用在溶媒中的化合物1(0.625％)和ex-527(0.025％)治疗小鼠。
[0136]
组14：用在溶媒中的ex-527(0.025％)治疗小鼠。
[0137]
在锋利手术刀的帮助下，在脊柱两侧皮肤的整个厚度上各制备2cm长和1cm深的椎旁直切口在完全止血后，通过以约1cm的间隔等距节点放置的间断缝线来闭合伤口(参见图8)。所有组用相应的测试和对照制剂每天治疗一次，持续7天。在研究的每一天，通过拍照和多普勒成像来拍摄伤口区域的图像。在治疗之前和期间使用透明描图表测量伤口区域，以每4天间隔测量伤口闭合。在第7天时移除缝线，并且观察动物的伤口闭合。
[0138]
结果：与组11、13和14小鼠相比，组12小鼠在7天内显示出切口伤口的完全愈合。(参见图8)。用sirt1抑制剂ex-527(0.025％)与化合物1组合治疗的组13，阻碍了由化合物1诱导的伤口愈合过程。本研究表明化合物1通过增强sirt1活性来诱导伤口愈合。这一结果支持化合物1促进在ex-527的存在下被扰乱的体外血管生成管形成的假设。
[0139]
实例5：治疗7天后在第8天时皮肤组织的拉伸强度的测量
[0140]
方法：每天对新鲜小鼠皮肤进行一次治疗，并在拉伸机的两端之间以100kg的负荷以5mm/分钟的拉伸速度拉伸(图9)。结果显示在表3中。
[0141]
表3.拉伸强度观察结果
[0142]
组-id拉伸强度(n)对照小鼠5.2
±
1.08化合物1(0.625％)55.33
±
1.7化合物1(0.625％) ex527(0.025％)5.7
±
1.62ex527(0.025％)6.03
±
2.51
[0143]
实例6：化合物1的局部施用改善balb/c小鼠中imq诱导的银屑病的效果
[0144]
方法：在本动物研究中测试了化合物1的局部施用用于治疗银屑病的效果。在本研究中，通过在连续6天的时间段内在balb/c小鼠的背部皮肤上施用5％w/w的咪喹莫特(imq)乳膏来诱导银屑病的典型特征，即红斑、脱皮和皮肤厚度。将发展出银屑病样症状的动物用于研究在溶媒中制备的化合物1的功效(如上所述)。在本研究中，使用雄性balb/c小(6至8周龄)。将动物分为8个组，每组由10只动物组成，如下所示：
[0145]
假对照组：假对照：剃光小鼠的背部，并且不给予动物治疗。这一组充当对照。
[0146]
imq对照组：本组中的动物在早上的特定时间用62.5mg市售的咪喹莫特(5％)对剃光的背部进行局部治疗，持续6天(研究的第1-6天)。这一阴性对照组代表由咪喹莫特5％(imq)诱导的典型银屑病模型。
[0147]
imq 溶媒基质组：这一组表示小鼠通过咪喹莫特诱导患有银屑病，随后在12小时后，从研究的第1天至第6天，通过用于制备式i化合物的溶媒对动物剃光的背部进行治疗。
[0148]
imq 丙酸氯倍他索乳膏0.05％：这一组表示小鼠通过咪喹莫特诱导患有银屑病，随后在12小时后，从研究的第1天至第6天，通过市售的丙酸氯倍他索乳膏(0.05％)(20μg/2cm2面积)对动物剃光的背部进行治疗。
[0149]
imq 化合物1(0.313％)组：这一组表示小鼠通过咪喹莫特诱导患有银屑病，然后在12小时后，从研究的第1天至第6天，通过用在溶媒中制备的化合物1(0.313％，其对应于82.6mg/cm2区域)对动物剃光的背部进行治疗。
[0150]
imq 化合物1(0.625％)组：这一组表示小鼠通过咪喹莫特诱导患有银屑病，然后在12小时后，从研究的第1天至第6天，通过用在溶媒中制备的化合物1(0.625％，其对应于
82.6mg/cm2区域)对动物剃光的背部进行治疗。
[0151]
本研究的活动时间表描述于下表4中：
[0152]
表4：活动时间表
[0153]
活动第1至6天第7天体重√√治疗(局部)(imq后12小时)√ 咪喹莫特施用√ 红斑和脱皮评分√√皮肤收集、脾脏、肝重量 √细胞因子(il-17和il-23)评估 √皮肤组织病理学 √
[0154]
组织病理学研究：作为功效研究的一部分，进行组织病理学研究以研究代表不同治疗组的小鼠的皮肤的形态观察结果。在实验结束时，将来自每个组的小鼠的皮肤样品固定在4％多聚甲醛中，并且包埋在石蜡中。从每个石蜡块中，制备4μm厚的切片并将其安装在载玻片上。通过苏木精和曙红对切片进行染色，并拍摄和评估图像。
[0155]
结果：分析了银屑病面积和严重度指数(pasi)评分，以确定含有化合物1的组合物以及适当对照的功效作为研究的一部分。基于临床pasi评分，通过客观评分系统评估皮肤炎症的严重度。红斑(0-4)和脱皮(0-4)独立地评分，其中0-无；1-轻；2-中度；3-明显的；4-非常明显的。累积评分(红斑加脱皮)作为炎症严重度的度量(0-8级)。
[0156]
图10描绘了包括研究期间确定的pasi评分，包括体重、红斑、脱皮和皮肤厚度。每天记录所有小鼠的个体体重。相对于第0天的体重计算体重减轻。阴性对照组代表典型的银屑病疾状，在所有参数方面显示最高的pasi评分。包括用在溶媒中制备的化合物10.313％和0.625％)治疗的组(的治疗组在治疗期内显示pasi评分下降，与阳性对照几乎相似。与imq 化合物1(0.313％)组和阳性对照组相比，imq 化合物1(0.625％)组显示出pasi评分更加降低。基于pasi评分，从治疗组可见的抗银屑病效果与用市售的丙酸氯倍他索乳膏治疗的阳性对照组相当。
[0157]
图11描绘了从第0天至第7天代表研究的不同组的小鼠的图像，即假、阴性对照、阳性对照和用不同浓度的化合物1的制剂处理的治疗组。
[0158]
imq诱导的银屑病模型重现人银屑病病变的特征性生物化学和组织病理学参数。imq乳膏的局部施用增加了在治疗的皮肤组织中的细胞因子(包括il-23和il-17)的水平。在第7天对动物实施安乐死。收集所有动物的脾脏、肝和皮肤组织。称重脾脏和肝组织。使用市售的试剂盒，通过elisa测量il-17和il-23水平。使用elisa分析从不同组小鼠获得的皮肤匀浆，以定量il-17和il-23水平，因为所选的白介素是银屑病的典型炎性标记物。如图12中所示，当与假组相比时，imq组(p《0.01)和imq 溶媒基质组(p《0.001)显示出il-17水平的显著增加。当与阴性对照相比时，在所有治疗组中均观察到il-17水平的降低。当与假对照组相比时，imq组和imq 溶媒基质组显示出il-23水平的显著增加(p《0.01)。当与阴性对照相比时，在包括imq 化合物1(0.313％和0.625％)和imq 氯倍他索(p《0.01)组的治疗组中观察到il-23水平的降低。当与假对照组相比时，imq组显示出白介素水平的显著升高(p《0.01)，其反映了银屑病炎症的发展。
[0159]
研究的阴性对照组(经咪喹莫特处理的动物)在h&e染色时表示典型的银屑病特征：棘皮症、角化不全、角化过度和皮肤浸润。从治疗组小鼠收集的皮肤的类似染色显示表皮增厚降低、角质层增厚降低和真皮浸润数量减少。组织病理学图像在图13中描绘。来自皮肤和耳两者的组织病理学结果显示，由imq诱导的银屑病通过化合物1制剂(0.625％)得到更大减轻，并且与丙酸氯倍他索乳膏的效果相当。