用于免疫疗法的组合物和方法与流程

用于免疫疗法的组合物和方法
1.本技术要求于2019年11月15日提交的美国临时申请号62/936,176的优先权，其通过引用整体并入。
2.序列表
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背景技术：

4.免疫系统的先天性和适应性装备均利用高度专业化的免疫细胞来巡逻身体，寻找恶性肿瘤的征象。先天性免疫提供第一道防线，并使用诸如非特异性和天然存在的屏障和破坏性肽的机制进行快速应答。自然杀伤(nk)细胞是一类淋巴细胞，是先天性免疫系统的一部分，并且可以使用贮存在其细胞质中的颗粒酶识别和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。
5.适应性免疫对抗原的应答随时间发展并提供持久的免疫。细胞毒性淋巴细胞(ctl)，也称为cd8

t细胞，是适应性免疫应答的一部分，因为它们识别由抗原呈递细胞(apc)呈递的病毒和肿瘤衍生的抗原。ctl通过与apc(诸如树突细胞或巨噬细胞)相互作用而被激活。apc在mhc分子背景下将肿瘤抗原呈递给t细胞表面上的t细胞受体(tcr)。在这种同源相互作用期间，apc提供共刺激信号，其通过细胞毒性机制导致t细胞活化、t细胞增殖以及减少或消除表达抗原的细胞。
6.抗cd112r免疫疗法的施用提供了增加、增强和维持免疫应答的机会。cd112r是主要由t细胞和nk细胞表达的抑制性受体，并与活化性受体cd226竞争结合cd112。cd112与cd112r的相互作用比与cd226的相互作用具有更高的亲和力，从而有效地调节cd226介导的细胞活化。阻断与cd112相互作用的抗cd112r抗体限制cd112r直接下游的抑制性信号传导，同时通过增加cd226与cd112的相互作用来促进更大的免疫细胞活化。在体外研究中，已经显示抗cd112r抗体增加免疫效应细胞的增殖、活化和细胞毒性。
7.在许多癌症组织中检测到cd112r mrna表达，并且基于使用tcga(癌症基因组图谱)数据集的预测分析。它在富含t细胞和nk细胞的肿瘤中表达最强。除了在骨髓细胞上表达外，cd112r配体cd112的表达通常在不同细胞来源的肿瘤细胞上升高。鉴于这些情况，cd112r对肿瘤浸润免疫细胞的接合(engagement)具有负调节在肿瘤微环境内的局部免疫应答的强大潜力。
8.尽管抗cd112r免疫疗法取得了成功，仍需要用于治疗癌症的改良疗法以及用于治疗pd-1/pd-l1抗性的癌症的疗法。用偶联cd112r和cd16的药剂的治疗性治疗提供下调抑制性信号传导的机会，推定该抑制性信号传导在表达cd112r的免疫细胞与肿瘤微环境内肿瘤细胞和/或骨髓细胞上的cd112接合时发生，并且具有增强、增加和维持抗肿瘤免疫应答的潜力。本文提供了用于偶联、同时结合和/或接合cd112r和cd16以治疗癌症的组合物和方法。
9.附图简述
10.图1a显示了肿瘤微环境的示意图。
11.图1b显示了cd112r表达在活化的nk和t细胞上增加。
12.图2显示了cd112r在ct26肿瘤浸润性nk和cd8

t细胞上上调。
13.图3a显示了在nk细胞上偶联cd112r和cd16的克隆35的示意图。
14.图3b显示了用抗cd112r抗体：克隆35(igg1/igg4)、克隆38(igg1/igg4)和克隆44(igg1/igg4)进行的nk活化测定的结果。
15.图4a显示cd112r过表达消除了t细胞活化。
16.图4b显示与同种型对照相比，克隆35增强了t细胞活化。
17.图5a显示了体外nk细胞活性测定的结果。
18.图5b显示了在小鼠igg1(其类似于人igg4)和小鼠igg2a(其类似于人igg1)中施用抗cd112r抗体(克隆46)后的肿瘤体积。
19.图6a显示了抗cd112r活性是nk和t细胞依赖性的。
20.图6b显示用抗cd112r处理的小鼠在再攻击后的免疫记忆。
21.图7a和7b显示了在两个供体中的nk活化测定中与克隆35.4相比的克隆35。
22.图8a-8b显示了用抗cd112r(克隆46)、抗tigit或抗cd112r(克隆46)和抗tigit的组合处理后的颗粒酶b (图8a)和干扰素-γ 百分比(图8b)水平)。
23.图9显示对于migg1/higg4形式的抗cd112r(克隆46)抗体与migg2a/higg1形式，癌症ct26模型中的肿瘤体积。
24.图10a-10b显示了在施用migg2a/higg1形式的克隆46后肿瘤体积变化的体内研究的结果。
25.图11a-11c显示了其他实验的结果，其证明：与higg1同种型对照抗体或对照fab相比，在1μg/ml克隆35或克隆35-fab存在下，4-1bb对与k562细胞共培养的nk细胞的诱导(n＝5个供体)(图11a)，与higg1同种型对照相比，在1μg/ml克隆35、克隆35-igg4或具有igg1突变体(克隆35-n297a)存在下，4-1bb对与k562细胞共培养的nk细胞的诱导(n＝5)(图11b)，以及在2μg/ml抗cd16、抗cd32或migg1对照fab分子存在下，1μg/ml克隆35对与k562细胞共培养后的nk细胞活化的影响(n＝5)。(*p《0.05，**p《0.01；配对t检验)(图11c)。
26.发明实施方案详述
27.i.定义
28.在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。在多项从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅在备选中回指多于一项先前的独立或从属权利要求。术语“包含”、“包括”和“具有”在本文中可以互换使用。
29.术语“cd112r”、“含有pvr相关免疫球蛋白域”、“cd112受体”、“含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白域的蛋白质”、“含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白域”、“nectin-2受体”、“c7orf15”和“跨膜蛋白pvrig”均可互换使用，并且是指天然的人cd112r，除非另有明确说明(例如小鼠cd112r、食蟹猴cd112r等)。该术语包括全长、未加工的cd112r以及在细胞中加工产生的任何形式的cd112r。该术语涵盖人cd112r的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。cd112r基因的外部id包括entrez gene：79037、ensembl：ensg00000213413、omim：617012和uniprotkb：q6dki7。
[0030]“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶物(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。通常可以用解离常数(kd)表示分子x对其配偶物y的亲和力。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，包括本文所述的那些。下文描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
[0031]“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(hvr)中具有一种或多种改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变任选地导致抗体对抗原的亲和力提高。
[0032]
本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
[0033]“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab’、fab
’‑
sh、f(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0034]
在两个或更多个分子之间的相互作用的背景下，本文使用的术语“阻断”是指抑制或阻止所述两个或更多个分子之间的相互作用，其中所述两个或更多个分子之间的相互作用的抑制或阻止在至少一种条件下完全的或几乎完全的。“几乎完全”抑制是约70-99.9％的百分比抑制，而“完全”抑制是100％。例如，如果分子以剂量依赖性方式在某些浓度下完全或几乎完全抑制两个或多个其他分子之间的相互作用，则称该分子“阻断”了此类相互作用。
[0035]
本文使用的术语“癌症”是指表现出异常高水平的增殖和生长的一组细胞。癌症可以是良性的(也称为良性肿瘤)、恶变前的或恶性的。癌细胞可以是实体癌细胞或白血病癌细胞。本文使用的术语“肿瘤”是指包含癌症的一个或多个细胞。本文使用的术语“肿瘤生长”是指由包含癌症的一个或多个细胞的增殖或生长，其导致癌症大小或程度的相应增加。
[0036]“cd16”在本领域中也称为fcγriii，并且经常发现于自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面。
[0037]
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同的来源或物种的抗体。
[0038]
抗体的“类”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。有五种主要的抗体类别：iga、igd、ige、igg和igm，其中的一些可进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
[0039]
与一种或多种另外的治疗剂“联合”施用包括以任何顺序同时(并行)和连续(相继)施用。“同时结合”(及其重复)是指能够在任何一个时间点同时与一个或多个靶标结合的组合物。同时结合不需要在每个时间点同时与一个或多个靶标结合。
[0040]
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
、p
32
、pb
212
和lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗
肿瘤或抗癌剂。
[0041]“效应物功能”是指随抗体同种型变化的归因于抗体fc区的那些生物活性。抗体效应物功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如b细胞受体)；和b细胞活化。
[0042]
药剂(例如药物制剂)的“有效量”，是指以必需的剂量和时间段实现期望治疗性或防治性结果的有效量。
[0043]
本文中的术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少部分的c端区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一些实施方案中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基端。然而，fc区的c端赖氨酸(lys447)可以存在或可以不存在(本段中的编号根据，如kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991中所述eu编号系统，也称为eu索引)。
[0044]“框架”、“框架区”或“fr”是指除了高变区(hvr)残基之外的可变域残基。可变域的fr一般由四个fr域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列通常在vh(或vl)中按以下顺序出现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。
[0045]
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有本文定义的fc区的重链的抗体。
[0046]
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已经引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和由其衍生的子代，不考虑传代次数。子代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，并且可能含有突变。与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代包括在本文中。
[0047]“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0048]
术语“可变区”或“可变域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构，每个域包含四个保守框架区(fr)和三个高变区(hvr)。(参见，例如，kindt et al.kuby immunology,6
th ed.,w.h.freeman and co.,page 91(2007)。)单个vh或vl域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用vh或vl域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补vl或vh域的文库。参见，例如，portolano et al.,j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson et al.,nature 352:624-628(1991)。
[0049]“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白vl或vh框架序列选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列的选择来自可变域序列的亚组。通常，序列亚组是如kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,fifth edition,nih publication 91-3242,bethesda md(1991),vols.1-3中的亚组。在一些实施方案中，对于vl，亚组是如上文kabat等人的kappa i亚组。在一些实施方案中，对于vh，亚组是如上文kabat等人的亚组iii。
[0050]
如本文所用，术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变域的区域中的每一个，它们在序
列上高变的(“互补决定区”或“cdr”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个hvr：三个在vh中(h1、h2、h3)，并且三个在vl中(l1、l2、l3)。
[0051]
在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg1。在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg4。在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg4，其中在丝氨酸228处存在至脯氨酸(s228p)的单一突变。在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg4，其中在丝氨酸228处存在至脯氨酸(s228p)和亮氨酸235至谷氨酸(l235e)的两个突变。人igg1和igg4的序列分别显示在seq id no：40000和40001的序列表中。具有一个或两个突变的人igg4的序列分别显示在40002和40003中。自始至终，在提供抗体或克隆编号的情况下，抗体均是igg1格式。如果抗体或克隆编号附有“.4”，例如“克隆35.4”，则该抗体是具有包含seq id no:40002的恒定区的igg4抗体。文献中s228p突变发生在228位。s
→
p突变发生在克隆35.4中，可能位于229位，但在本文中仍称为s228p。一般而言，本文所述的所有例示抗体均包含人κ轻链。
[0052]“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体，包括但不限于细胞毒性剂。
[0053]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和老鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
[0054]“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳(例如，sds-page、等电聚焦(ief)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相液相hplc)测定。对于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，flatman et al.,j.chromatogr.b 848:79-87(2007)。
[0055]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生产过程中发生，这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相比，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
[0056]“裸抗体”是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
[0057]“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从n端到c端，每条重链均具有可变区(vh)，也称为可变重域或重链可变域，随后是三个恒定域(ch1、ch2和ch3)。类似地，从n端到c端，每条轻链均具有可变区(vl)，也称为可变轻链域或轻链可变域，随后是恒定轻(cl)域。根据其恒定域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配到称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种。
[0058]
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对并引入空
位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑将任何保守替代作为序列同一性的部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序align-2生成％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交在华盛顿特区2055的美国版权局(u.s.copyright office,washington d.c.,20559)，在此以美国版权注册号txu510087登记。align-2程序可从genentech,inc.,south san francisco,california公开获得，或者可以从源代码编译。align-2程序应编译用于unix操作系统，包括数字unix v4.0d。所有序列比较参数均由align-2程序设置并且不改变。
[0059]
在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定氨基酸序列a与、同或针对给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(也可以可替代地表述为与、同或针对给定的氨基酸序列b具有或包含一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)：
[0060]
分数x/y的100倍
[0061]
其中x是序列比对程序align-2在a和b的程序比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中y是b中的氨基酸残基的总数目。将理解氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度，a与b的％氨基酸序列同一性将不等于b与a的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如前一段中所述使用align-2计算机程序获得。
[0062]
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指其形式允许其中所含活性成分的生物活性有效且不含有对将施用该制剂的受试者不可接受地有毒性的额外组分的制备物。
[0063]“药学上可接受的载体”是指药物制剂或组合物中除活性成分外的对受试者无毒性的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0064]
如本文所用，“治疗”(及其语法变体，例如“治疗”或“治疗”)是指试图改变正在治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以用于防治或在临床病理过程中进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0065]
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入其已被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0066]
ii.组合物和方法
[0067]
提供了用于同时接合、偶联或结合cd16和cd112r的方法中的组合物。在一些实施方案中，涵盖用于治疗癌症的方法，包括施用能够同时偶联、接合和/或结合cd112r和cd16的一种或多种组合物。在一些实施方案中，组合物包含一种能够同时结合的药剂。在一些实施方案中，组合物包含一种以上的药剂，所述药剂通过其同时或几乎同时施用而同时结合。
[0068]
在一些实施方案中，组合物是与cd112r和cd16结合的多特异性抗体。在一些实施
方案中，组合物包含两种药剂，其中一种药剂接合、偶联或结合cd112r，并且另一种药剂接合、偶联或结合cd16。
[0069]
在一些实施方案中，提供了用于以下方法的组合物
[0070]
a)通过优先激活nk细胞来治疗癌症；和/或
[0071]
b)增强nk细胞活化；和/或
[0072]
c)增强nk细胞活化而不增强t细胞活化，
[0073]
所述方法包括施用接合、偶联或结合cd16和cd112r的组合物。
[0074]
在一些实施方案中，组合物是多特异性抗体，其中抗体结合至、阻断和/或激活cd16和cd112r。
[0075]
在一些实施方案中，组合物包含cd16激动剂和结合至和/或激活cd112r的试剂。
[0076]
在一些实施方案中，组合物包含抗cd16抗体。
[0077]
在一些实施方案中，组合物包含抗cd112r抗体。
[0078]
在一些实施方案中，组合物包含抗cd16抗体和抗cd112r抗体。
[0079]
1.多特异性抗体
[0080]
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对cd112r，另一种针对cd16。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对cd112r，一种针对cd16，并且另一种独立地选自pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、tim-3、tigit、cd96、pvrl1、pvrl2、pvrl3、pvrl4、cd155、sting、cd47、cd39和il-27中的一个或多个。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位于表达cd112r的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
[0081]
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见milstein and cuello,nature 305:537(1983)),wo 93/08829,and traunecker et al.,embo j.10:3655(1991))和“杵臼(knob-in-hole)”工程(参见，例如，美国专利号5,731,168)。也可以通过以下制备多特异性抗体：工程化改造静电转向效应用于制备抗体fc-异二聚体分子(wo 2009/089004a1)；交联两个或多个抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和brennan et al.,science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，kostelnyet al.,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见，例如，hollinger et al.,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))；和使用单链fv(sfv)二聚体(参见，例如gruber et al.,j.immunol.,152:5368(1994))；和制备例如，如tutt et al.j.immunol.147:60(1991)中所述的三特异性抗体来。
[0082]
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(octopus antibody)”，也包括在本文中(参见例如us 2006/0025576a1)。
[0083]
本文的抗体或片段还包括“双重作用抗体”或“daf”，其包含与cd112r以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如，us 2008/0069820)。
[0084]
2.fc区变体
[0085]
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的fc区，从而生成fc区变体。fc区变体可以包括在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，
替代)的人fc区序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区)。
[0086]
在某些实施方案中，本发明考虑了具有一些但非全部的效应物功能的抗体变体，这使其成为其中抗体在体内的半衰期重要但某些效应物功能(诸如补体和adcc)不必要或有害的应用的期望候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实cdc和/或adcc活性的降低/消减。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定以确保抗体缺乏fcγr结合(因此可能缺乏adcc活性)，但保留fcrn结合能力。介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞则表达fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch and kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中总结了造血细胞上的fcr表达。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如hellstrom,i.et al.proc.nat’l acad.sci.usa 83:7059-7063(1986))和hellstrom,i et al.,proc.nat’l acad.sci.usa 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见bruggemann,m.et al.,j.exp.med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的acti
tm
非放射性细胞毒性测定法(cell technology,inc.mountain view,ca；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega,madison,wi)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如，在诸如如clynes et al.proc.nat’l acad.sci.usa 95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估感兴趣分子的adcc活性。也可以进行c1q结合测定以证实抗体不能结合c1q并因此缺乏cdc活性。参见例如wo 2006/029879和wo 2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定(参见例如gazzano-santoro et al.,j.immunol.methods 202:163(1996)；cragg,m.s.et al.,blood 101:1045-1052(2003)；和cragg,m.s.and m.j.glennie,blood 103:2738-2743(2004))。fcrn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如，petkova,s.b.et al.,int’l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0087]
具有降低的效应物功能的抗体包括具有替代fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个(美国专利号6,737,056)的那些。此类fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有替代的fc突变体，包括具有残基265和297到丙氨酸的替代的所谓“dana”fc突变体(美国专利号7,332,581)。
[0088]
描述了具有改善或减弱的与fcr的结合的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；wo2004/056312，和shields et al.,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)。)
[0089]
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改进adcc的氨基酸替代的fe区，例如，在fe区的位置298、333和/或334处的替代(残基的eu编号)。
[0090]
在一些实施方案中，在fc区中进行改变，导致改变的(即，改善的或减弱的)clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如，如美国专利号6,194,551,wo 99/51642和idusogie et al.j.immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
[0091]
在us2005/0014934a1(hinton等人)中描述了半衰期增加和与新生儿fc受体(fcrn)结合改善的抗体，新生儿fc受体负责将母体igg转移至胎儿(guyer et al.,j.immunol.117:587(1976)和kim et al.,j.immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个替代的fe区，所述替代改善fe区与fcrn的结合。此类fc变体包括在以下fc区残基的一个或多个处具有替代的那些：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、
311、312、317、340、356、360、362，376、378、380、382、413、424或434，例如fc区残基434的替代(例如，美国专利号7,371,826)。
[0092]
涉及fc区变体的其他实例，也参见duncan&winter,nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和wo 94/29351。
[0093]
在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg1。在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg4。在一些实施方案中，根据序列表提供抗体，其中同种型是人igg4，其中在丝氨酸228处存在至脯氨酸(s228p)的单一突变。
[0094]
3.抗体衍生物
[0095]
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知且容易可获得的额外的非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量并且可以是分支或非分支的。连接到抗体上的聚合物的数目可以变化，并且如果附接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于包括但不限于待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于规定的条件下的疗法等考虑来确定。
[0096]
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，该非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性地加热。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(kam et al.,proc.natl.acad.sci.usa 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞但将非蛋白质部分加热到杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度的波长。
[0097]
b.药物制剂
[0098]
提供了所述组合物的药物制剂并且其可以用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，通过将活性成分与一种或多种任选的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂混合以使其具有期望的纯度(remington's pharmaceutical sciences 16th edition,osol,a.ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式制备制剂。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，其包括但不限于：无菌水、缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯，诸如尼泊金甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，诸如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明
质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(baxter international,inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20。在一个方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
[0099]
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
[0100]
本文的制剂或组合物还可以按照正在治疗的特定适应症的需要含有多于一种活性成分，优选地是具有未相互不利影响的互补活性的那些。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
[0101]
可以将活性成分包埋在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊、在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂(macroemulsion)中。此类技术在remington's pharmaceutical sciences 16th edition,osol,a.ed.(1980)中公开。
[0102]
可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半通透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
[0103]
待用于体内施用的制剂或组合物通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜过滤容易地实现无菌。
[0104]
c.治疗性用途和方法
[0105]
提供了用于同时接合、偶联或结合cd16和cd112r的方法中的组合物。在一些实施方案中，涵盖用于治疗癌症的方法，包括施用能够同时偶联、接合和/或结合cd112r和cd16的一种或多种组合物。在一些实施方案中，组合物包含一种能够同时结合的药剂。在一些实施方案中，组合物包含一种以上的药剂，所述药剂通过其同时或几乎同时施用而同时结合。
[0106]
在一些实施方案中，组合物是与cd112r和cd16结合的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含两种药剂，其中一种药剂接合、偶联或结合cd112r，并且另一种药剂接合、偶联或结合cd16。
[0107]
在一些实施方案中，提供了用于以下方法的组合物
[0108]
a)通过优先激活nk细胞来治疗癌症；和/或
[0109]
b)增强nk细胞活化；和/或
[0110]
c)增强nk细胞活化而不增强t细胞活化，
[0111]
所述方法包括施用接合、偶联或结合cd16和cd112r的组合物。
[0112]
在进一步的方面，本发明提供了用于治疗期望阻断cd112r的疾病和/或病症的方法。在一些实施方案中，提供了用于在患有肿瘤的受试者中增强、增加和/或维持抗肿瘤免疫应答的方法，包括施用偶联、接合或阻断cd16和cd112r的一种或多种药剂。在一些实施方案中，肿瘤是癌性的。在一些实施方案中，提供了用于治疗患有癌症的受试者中的癌症的方法，包括施用偶联、接合或阻断cd16和cd112r的一种或多种药剂。
[0113]
本文所述的组合物可以用于例如治疗癌症。在一些实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，包括施用有效量的一种或多种cd16和cd112r接合、偶联或结合组合物。
[0114]
癌症可以是具有实体瘤或血液恶性肿瘤(例如，液体肿瘤)的癌症。
[0115]
用于治疗的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞
状非小细胞肺癌(nsclc)、非鳞状nsclc、胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(rcc))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌症(或癌)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，诸如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的癌症、病毒相关的癌症或病毒来源的癌症(例如，人乳头状瘤病毒(hpv相关或起源肿瘤))，以及衍生自两种主要血细胞谱系中任一种的血液恶性肿瘤，即骨髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生b、t、nk和浆细胞)，诸如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或髓细胞性白血病，诸如急性白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和慢性髓细胞性白血病(cml)、未分化的aml(mo)、成髓细胞白血病(m1)、成髓细胞白血病(m2；细胞成熟)、早幼粒细胞白血病(m3或m3变体[m3v])、粒单核细胞白血病(m4或m4变体伴嗜酸性粒细胞增多[m4e])、单核细胞白血病(m5)、红系白血病(m6)、巨核细胞白血病(m7)、孤立性粒细胞肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤，诸如霍奇金淋巴瘤(hl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、b细胞血液恶性肿瘤，例如b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样b细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(malt)淋巴瘤、间变性(例如ki 1 )大细胞淋巴瘤、成人t细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠t细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、前体t淋巴母细胞淋巴瘤、t淋巴母细胞；和淋巴瘤/白血病(t-lbly/t-all)、外周t细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性病症、真组织细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤(lbl)、淋巴样谱系造血肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞淋巴瘤(dhl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤(ctlc)(也称为蕈样肉芽肿或sezary综合征)和伴有waldenstrom巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(lpl)；骨髓瘤，诸如igg骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、毛细胞淋巴瘤；髓系造血肿瘤、间叶源性肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎癌、中枢和外周神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间叶源性肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、滤泡性甲状腺癌和畸胎癌、淋巴样谱系的造血肿瘤，例如t细胞和b细胞肿瘤，包括但不限于t细胞病症，诸如t前淋巴细胞白血病(t-pll)，包括小细胞和脑状细胞类型；t细胞类型的大颗粒淋巴细胞白血病(lgl)；a/d t-nhl肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后t细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)t细胞淋巴瘤；头颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性髓性淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本文所述的方法还可以用于治疗转移性癌症、不可切除的难治性癌症(例如，对先前的免疫疗法，例如用阻断ctla-4或pd-1抗体难治的癌症)和/或复发性癌症。
[0116]
在某些实施方案中，将本文所述的组合物施用于患有癌症的受试者，其对先前的治疗(例如，使用免疫肿瘤学或免疫疗法药物的先前治疗)表现出不充分的响应或进展。在一些实施方案中，癌症对先前治疗是难治的或抗性的，或者本质上难治性的或抗性的(例如，对pd-1途径拮抗剂是难治的)，或者获得抗性或难治性状态。例如，本文描述的组合物可以单独或联合另一种疗法(例如，抗pd-1通路拮抗剂疗法)施用于对第一疗法没有响应或不充分响应或在治疗(例如抗pd-1途径拮抗剂治疗)后疾病进展的受试者。在其他实施方案中，将本文所述的组合物施用于先前未接受(即，用其治疗)免疫肿瘤剂，例如pd-1途径拮抗剂的受试者。
[0117]
d.组合
[0118]
本发明的组合物可以单独或联合疗法中的其他药剂使用。例如，本发明的组合物可以与至少一种另外的治疗剂共同施用(例如，进一步包括施用第二疗法)。
[0119]
在一些实施方案中，靶向另外的独立抑制途径或其组合具有导致比单一疗法进一步增强的免疫细胞活化的潜力。
[0120]
在一些实施方案中，额外的治疗剂或第二药剂是化疗剂、调理剂、调节性t细胞(“treg”)消减剂、除cd112r之外的靶标的拮抗剂或除cd112r之外的靶标的激动剂。在某些实施方案中，第二药剂是本文所述的化疗剂或任何已知的化疗剂。在一些实施方案中，第二药剂是调理剂，其中调理剂是除抗cd112r抗体之外的靶向癌症或肿瘤细胞的抗体。在一些实施方案中，第二药剂是本文所述的treg消减剂或任何已知的treg消减剂。在一些实施方案中，第二药剂是除cd112r之外的靶标的拮抗剂。在一些实施方案中，第二药剂是除cd112r之外的靶标的激动剂。
[0121]
在一些情况下，第二药剂靶向独立的抑制途径，诸如，例如涉及pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3或tim-3的途径。在一些实施方案中，第二药剂拮抗pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3和tim-3中的一种或多种。用于本文所述的联合疗法的合适拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如单克隆抗体和双特异性抗体)和多价药剂。在一个实施方案中，拮抗剂是融合蛋白，例如，fc融合蛋白，诸如amp-244。在一些实施方案中，pd-1拮抗剂是抗pd-1或抗pd-l1抗体。
[0122]
示例性抗pd-1抗体是纳武单抗(nivolumab)(bms-936558)或包含wo 2006/121168中描述的抗体17d8、2d3、4h1、5c4、7d3、5f4和4a11之一的cdr或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是在wo2012/145493中描述的mk-3475(派姆单抗(lambrolizumab))；在wo2012/145493中描述的amp-514；或pdr001。其他已知的pd-1抗体和其他pd-1抑制剂包括描述于wo 2009/014708、wo 03/099196、wo 2009/114335、wo 2011/066389、wo 2011/161699、wo 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149，以及美国专利公开号2009/0317368中的那些。也可以使用在wo2013/173223中公开的任何抗pd-1抗体。竞争结合和/或结合pd-1上的相同表位的抗pd-1抗体，因为这些抗体之一也可以用于联合治疗。
[0123]
在一些实施方案中，可用于联合疗法的抗pd-ll抗体是bms-936559(在wo 2007/005874和美国专利号7,943,743中称为12a4)，或包含3g10、12a4、10a5、5f8、10h10、1b12、7h1、11e6、12b7和13g4的cdr或可变区，其描述于pct公开wo 07/005874和美国专利号7,943,743中。在某些实施方案中，抗pd-l1抗体是medi4736(也称为度伐鲁单抗(durvalumab)和anti-b7-h1)、mpdl3280a(也称为阿特朱单抗(atezolizumab)和rg7446)、msb0010718c(也称为阿维单抗(avelumab)；wo2013/79174)或rhigm12b7。也可以使用在wo2013/173223、
wo2011/066389、wo2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国公开号2009/145493中公开的任何抗pd-l1抗体。与任何这些抗体竞争和/或结合相同表位的抗pd-l1抗体也可以用于联合治疗。
[0124]
在某些实施方案中，本公开的组合物可以与ctla-4拮抗剂，例如抗ctla-4抗体一起使用。在一个实施方案中，抗ctla-4抗体是选自以下的抗体：(伊匹单抗(ipilimumab)或抗体10d1，描述于pct公开wo 01/14424)、替西木单抗(tremelimumab)(以前称为ticilimumab，cp-675,206)、单克隆或在以下出版物中的任一篇中描述的抗ctla-4抗体：wo98/42752；wo00/37504；美国专利号6,207,156；hurwitz et al.(1998)pro.natl.acad.sci.usa 95(17):10067-10071；camacho et al.(2004)j.clin.oncology 22(145):antibodiestract no.2505(抗体cp-675206)；和mokyr et al.(1998)cancer res.58:5301-5304。也可以使用在wo2013/173223中公开的任何抗ctla-4抗体。
[0125]
在一些实施方案中，本公开的组合物联合lag-3(在本文或其他中也称为lag3)拮抗剂使用。抗lag3抗体的实例包括包含抗体25f7、26h10、25e3、8b7、11f2或17e5的cdr或可变区的抗体，其描述于美国专利公开号us2011/0150892、wo10/19570和wo2014/008218中。在一个实施方案中，抗lag-3抗体是bms-986016。可以使用的其他本领域公认的抗lag-3抗体包括imp731和imp-321，描述于us 2011/007023、wo08/132601和wo09/44273中。与任何这些抗体竞争和/或结合相同表位的抗lag-3抗体也可以用于联合治疗。
[0126]
在一些实施方案中，靶向tigit、cd96和cd112r受体中的两个或更多个相对于抗cd112r单一疗法同时增加cd226介导的信号传导。因此，在一些实施方案中，第二药剂是tigit和/或cd96的拮抗剂。用于本文所述的联合治疗的合适拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如单克隆抗体和双特异性抗体)和多价药剂。
[0127]
在一些实施方案中，pvr基因家族的成员在肿瘤细胞上被上调并且可以表现出内在的促肿瘤特性。靶向pvr基因家族的其他成员联合抗cd112r抗体，导致相对于单一疗法增强的对肿瘤的敏感性。因此，在一些实施方案中，第二药剂是选自pvrl1、pvrl2、pvrl3、pvrl4和cd155的拮抗剂中的一种或多种。用于本文所述的联合治疗的合适拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如单克隆抗体和双特异性抗体)和多价药剂。
[0128]
sting激动剂诱导先天性免疫细胞活化，导致增加的t细胞引发和免疫细胞募集到肿瘤微环境中。靶向sting激动剂联合cd112r具有导致t细胞和nk细胞的募集和活化进一步增加的潜力。
[0129]
增加的抗cd47抗体介导的吞噬作用可以导致巨噬细胞向t细胞呈递癌症衍生抗原的增加。用抗cd47抗体和抗cd112r抗体(诸如本文提供的抗cd112r抗体)的联合治疗提供了增强癌症抗原特异性t细胞应答的机会并且完全涵盖在本文中。
[0130]
腺苷通过免疫细胞上表达的腺苷受体抑制t细胞和nk细胞活化。抗cd39抗体通过阻止三磷酸腺苷(atp)的水解来抑制腺苷的生成。用抗cd39抗体和抗cd112r抗体(诸如本文提供的抗cd112r抗体)的联合治疗提供了通过抑制免疫细胞中腺苷介导的细胞信号传导来进一步增强cd112r治疗的机会。
[0131]
细胞因子可以有效地调节t细胞和nk细胞的活化。il-27是抑制t细胞和nk细胞介导的应答的免疫抑制细胞因子。抗il-27抗体通过限制免疫细胞中的免疫抑制细胞因子信号传导提供了增强cd112r疗法的机会。因此，提供了用抗il-27抗体和抗cd112r抗体(诸如
本文提供的抗cd112r抗体)的联合治疗。
[0132]
本文的组合物也可以在其他治疗模式，例如，手术、化学疗法、放射疗法，或施用生物制剂例如另一种治疗性抗体之前、基本上同时或之后提供。在一些实施方案中，癌症在选自手术、化学疗法和放射疗法或其组合的疗法之后复发或进展。例如，当可能存在微转移的风险时和/或为了降低复发风险，本文所述的cd112r抗体可以作为辅助疗法施用。
[0133]
对于癌症的治疗，组合可以联合一种或多种额外的抗癌剂，诸如化疗剂、生长抑制剂、抗癌疫苗诸如基因疗法疫苗、抗血管生成剂和/或抗赘生组合物施用。
[0134]
在一些实施方案中，抗炎药可以与组合一起施用，诸如固醇或非类固醇抗炎药(nsaid)。在需要与本文所述的cd112r抗体治疗结合或在其之前使异常增殖细胞静止的情况下，也可以将激素和类固醇(包括合成类似物)，诸如17a-炔雌醇(17a-ethinylestradiol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、睾酮(testosterone)、泼尼松(prednisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、睾内酯(testolactone)、甲地孕酮(megestrolacetate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、甲基睾酮(methyl-testosterone)、泼尼松龙(prednisolone)、曲安西龙(triamcinolone)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、羟孕酮(hydroxyprogesterone)、氨格鲁米特(aminoglutethimide)、雌莫司汀(estramustine)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、施用于受试者。当采用本文所述的方法或组合物时，在临床环境中用于调节肿瘤生长或转移的其他药剂，例如抗模拟物，也可以如期望施用。
[0135]
上述此类联合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂或组合物中)和单独施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用另外的一种或多种治疗剂之前、同时和/或之后发生。在一些实施方案中，抗cd112r抗体的施用和另外的治疗剂的施用发生在彼此的约一个月内，或约一、二或三周内，或约一、二、三、四、五或六天内。
[0136]
本发明的组合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括胃肠外、肺内和鼻内，并且如果期望局部治疗，通过病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
[0137]
本发明的组合物可以以符合良好医学实践的方式进行配制、给药和施用。在本文中考虑的因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、个体受试者的临床状况、病症的原因、药剂的递送部位、施用的方法、施用的时间安排，以及医生已知的其他因素。如本文所用，“分剂量”是将单个单位剂量或总日剂量分成两个或多个剂量，例如单个单位剂量的两次或更多次施用。组合物可以作为“分剂量”给药。
[0138]
组合物不需要但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于存在于制剂或组合物中的组合物的量、疾病或治疗的类型以及以上讨论其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％，或以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。在一些实施方案中，组合物以用于立即释放的制剂提供，而另一种药剂被配制用于延长
释放，反之亦然。
[0139]
e.制品
[0140]
在本发明的另一个方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳本身或与另一种组合物组合有效用于治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂可以是抗体。标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选择的病况。此外，该制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含抗体；(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可以用于治疗特定病况的包装插页。可替代地或另外地，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户角度看期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
[0141]
应当理解，任何上述制品可以包括免疫缀合物。
iii.实施例
[0142]
实施例1.
[0143]
cd112r是在nk细胞和t细胞上表达的抑制性受体。cd112r通过与肿瘤细胞上表达的配体，细胞粘附分子cd112(pvrl2)缔合来抑制免疫细胞活化，cd112r与活化受体cd226竞争cd112。cd112与cd112rd结合通过细胞质尾部中基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)诱导下游信号传导，从而抑制效应细胞活化。图1a提供了示意图，并且图1b提供了nk和cd8

t细胞的cd112r表达数据。
[0144]
cd112r表达在鼠肿瘤浸润nk细胞上上调。参见图2。通过流式细胞术在皮下植入ct-26肿瘤的balb/c小鼠中评估来自脾和分离肿瘤的免疫细胞群的cd112r表达。cd112r表达表示为相对于阴性(同种型对照)的倍数。
[0145]
图3a显示了克隆35对nk细胞的治疗活性的模型。通过接合cd16和cd112r两者，克隆35处理促进抗肿瘤活性。图3b举例说明了具有增强fc效应物功能的抗cd112r抗体(higg1 fc、克隆35、克隆38和克隆44)在肿瘤细胞共培养物中产生比fc效应物功能低的抗体(higg4 fc、克隆35.4、克隆38.4和克隆44.4)更强的nk细胞脱粒。特别是，图3b显示了与fc效应物功能低的cd112r抗体相比，在增强的fc效应物功能cd112r抗体存在下，应答于肿瘤细胞的nk细胞介导的脱粒增强。在具有igg1或igg4.1(s228p)同种型的cd112r抗体存在下，将人nk细胞和raji cd112细胞与cd107a pe抗体共培养4小时。共培养后，通过cd107a阳性的nk细胞的频率测定nk细胞脱粒。
[0146]
在图4a中，cd112r的过表达抑制jurkat细胞tcr介导的活化。用cd112r-ires-gfp(jurkatcd112r)或gfp对照载体(jurkat gfp)转导的jurkat细胞与表达膜结合抗cd3 scfv和cd112配体的tcr刺激细胞共培养24小时。通过elisa，通过il-2分泌到上清液中来测量活化。
[0147]
在图4b中，克隆35处理增加了tcr介导的jurkat.cd112r细胞活化。在克隆35或同
种型对照抗体存在下，将过表达cd112r的jurkat细胞与tcr刺激细胞(用膜结合的抗cd3 scfv和cd112配体转导的raji细胞)共培养24小时。通过elisa，通过il-2分泌到上清液中来测量jurkat细胞的活化。
[0148]
图5a显示了克隆35介导的nk细胞活化由cd16阻断部分消除。来自单个供体的pbmc与k562靶细胞、克隆35和阻断cd16(ancell，克隆3g8)、cd32(ancell，克隆7.3)的f(ab’)2抗体或单独的培养基共培养24小时。通过流式细胞术，通过4-1bb表达上调来评估nk细胞活化。
[0149]
图5b显示了与具有低fc效应物功能的相同抗体(小鼠igg1，克隆46.mg1)相比，用具有增强的fc效应物功能的抗cd112r抗体(小鼠igg2a，克隆46)处理的小鼠中的肿瘤生长抑制更强。图表是3次实验的汇总，每组n＝44-45。
[0150]
在nk细胞或cd8 t细胞消减后，在ct26同基因小鼠肿瘤模型中评估了cd112r阻断的体内功效。为了消减nk和cd8 t细胞，分别用asialo-gm1抗体(biolegend；cat#146002；剂量100ul/小鼠；腹膜内)和抗cd8a抗体(bioxcell；cat#be0085；200μg/小鼠；腹膜内)随机化开始每周两次处理小鼠三周。向7周龄的balb/canntac雌性小鼠(taconic biosciences，目录号balb-f)的右胁腹皮下植入在0.1ml 50％geltrex(gibco，目录号a1432-02)和50％rpmi-1640无血清培养基(gibco，目录号a10491-01)中的0.2x106ct26.wt(atcc，目录号crl-2638)。在植入后第4天随机化具有可触及肿瘤的小鼠，并从随机化当天开始用克隆46(抗cd112r小鼠igg2a；12.5mg/kg；腹膜内)每周两次腹膜内处理三周。每2-3天用卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤达到iacuc极限大小(《2000mm3)。肿瘤体积(mm3)计算如下：宽度(mm)x[长度(mm)]2x0.5。结果如图6a所示。该图描绘了每个处理组的平均肿瘤体积作为时间的函数。这些结果表明在nk细胞或cd8 t细胞消减后，抗cd112r的治疗作用显著降低。
[0151]
在抗cd112r处理的小鼠中评估了抗肿瘤免疫，该小鼠表现出对原发性ct26.wt肿瘤攻击的完全响应。对于初次攻击，向7周龄的balb/canntac雌性小鼠(taconic biosciences，目录号balb-f)的右胁腹皮下植入在0.1ml50％geltrex(gibco，目录号a1432-02)和50％rpmi-1640无血清培养基(gibco，目录号a10491-01)中的0.2x106 ct26.wt(atcc，目录号crl-2638)。在植入后第4天随机化具有可触及肿瘤的小鼠，并从随机化当天开始每周两次腹膜内处理三周，如下表1所示。
[0152]
表1:
[0153][0154]
每2-3天用卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤达到iacuc极限大小(《2000mm3)。肿瘤体积(mm3)计算如下：宽度(mm)x[长度(mm)]2x0.5。
[0155]
在植入后第50天没有任何可辨别肿瘤的所有存活小鼠被认为是存活者/完全响应者。通过在左胁腹接种在0.1ml 50％geltrex(gibco，目录号a1432-02)和50％rpmi-1640无血清培养基(gibco，目录号a10491-01)中的1x106ct26.wt细胞(atcc，目录号crl-2638)再
攻击来自抗cd112r处理组的完全响应小鼠(n＝8)，比初次接种剂量增加五倍。作为对照，年龄匹配的未免疫balb/c雌性小鼠(n＝5)也在左胁腹类似地接种了在0.1ml 50％geltrex和50％rpmi-1640无血清培养基中的1x106 ct26.wt细胞。小鼠没有接受任何进一步的处理。每2-3天测量肿瘤体积，直到肿瘤达到iacuc极限大小(《2000mm3)。肿瘤体积(mm3)计算如下：宽度(mm)x[长度(mm)]2x0.5。结果如图6b所示。
[0156]
为了评估cd112r抗体对nk细胞活化的影响，在pbmc-肿瘤细胞共培养物中评估克隆35(higg1)和克隆35.4(higg4)。在与k562靶细胞(慢性髓性白血病细胞系，atcc#ccl-243)，与抗cd112r或同种型对照抗体共培养的来自pbmc的nk细胞上测量了cd137(4-1bb)的上调，cd137先前已经确定为nk细胞活化的标志物(baessler et al.(2010)blood 115(15)；andr
é
et al.(2018)cell 175,1731-1743)。
[0157]
简而言之，在添加靶细胞和抗体之前，将从健康供体的血沉棕黄层中分离的冷冻pbmc解冻、清洗、重悬浮在dmem 10％fbs 1％青霉素-链霉素(d10)中并以每孔5x105个细胞的浓度铺板到96孔平底板中并在37℃下静置4小时。接下来，在第一项实验(图7a)中，抗体在d10中稀释，并以10μg/ml的起始浓度添加到每个孔中，连续稀释10倍。在接下来的实验中(图8c-8d)，将单一浓度(1μg/ml)的抗cd112r或igg1同种型对照抗体添加到每个孔中。对于这两个实验，每个条件一式两份运行。然后收获k562细胞，清洗并重悬浮在d10中，并以每孔5x104个细胞的浓度添加到每个孔中。每个孔的最终体积为200μl。然后将板在37℃下温育16小时。16小时后，将细胞转移至v底板并在pbs 2％fbs中清洗两次。用在pbs 2％fbs中的抗cd3 fitc(biolegend，#300306)、抗nkp46 bv421(biolegend#331914)和抗cd137 apc(biolegend，#309810)在4℃下染色细胞30分钟。随后将细胞清洗两次并重悬浮在pbs 2％fbs中。使用lsrfortessa x-20(bd biosciences)流式细胞仪采集数据，并用flowjo软件(treestar)进行分析。nk细胞活化定义为cd3-nkp46 淋巴细胞门内cd137 细胞的频率。
[0158]
来自两个独立实验的两个个体供体的结果在图7a-7b中呈现。
[0159]
图8显示相对于同种型对照，单剂抗cd112r和抗tigit联合治疗后72小时肿瘤内nk细胞的活化增加。将活化评估为颗粒酶b (图8a)和干扰素-γ (图8b)的分数
[0160]
图9揭示了与用低fc效应物功能工程化改造的相同抗体(小鼠igg1，克隆46.mg1)相比，在用具有增强的fc效应物功能的抗cd112r抗体(小鼠igg2a，克隆46)处理的小鼠中，肿瘤生长抑制更强。图表是3次实验的汇总，每组n＝44-45。在第24天时间点通过mann-whitney检验进行统计分析。
[0161]
图10显示了在用抗cd112r.mg2a处理后排斥ct26肿瘤并且在接种第50天之后没有表现出可触及的肿瘤的小鼠的子集。这些小鼠在再攻击后迅速排斥ct26肿瘤，这表明在荷瘤小鼠中用增强的fc效应物功能cd112r抗体处理导致小鼠子集产生免疫记忆和保护性免疫。
[0162]
实施例2.
[0163]
在一系列随访实验中，评估了在来自其他供体的pbmc中与抗cd112r抗体和抗cd112r fab的多种排列共培养后的nk细胞活化。结果表明，增强的克隆35介导的nk细胞活化在体外测定中需要高fc效应物功能和cd16接合两者(图11a-c)。
[0164]
图11a显示了克隆35介导的nk细胞活化在不存在fc主链(抗体fab)的情况下被部分消除。来自五个供体的pbmc与k562靶细胞，与全长克隆35、克隆35fab、全长同种型对照或
同种型对照fab共培养24小时。通过流式细胞术，通过4-1bb(cd137)表达的上调来评估nk细胞活化。通过配对t检验分析进行统计分析。
[0165]
图11b显示了克隆35介导的nk细胞活化在不存在糖基化fc主链的情况下被部分消除。fc主链在残基297处的糖基化显著增强了igg1抗体与fc受体结合的能力。297位天冬酰胺残基至丙氨酸的工程化突变(n297a)阻止了该残基的糖基化，因此大大降低了抗体fc主链接合fc受体的能力(wang et al,protein cell 2018)。在该实验中，来自五个供体的pbmc与k562靶细胞、克隆35、非糖基化克隆35(克隆35-n297a)、效应物功能低的克隆35(higg4、克隆35.4)或higg1同种型对照抗体共培养24小时。通过流式细胞术，通过4-1bb(cd137)表达的上调来评估nk细胞活化。通过配对t检验分析进行统计分析。
[0166]
图11c显示了克隆35介导的nk细胞活化被cd16阻断部分消除。来自五个供体的pbmc与k562靶细胞、克隆35和阻断cd16(ancell，克隆3g8)、cd32(ancell，克隆7.3)或同种型对照的fab抗体共培养24小时。通过流式细胞术，通过4-1bb(cd137)表达的上调来评估nk细胞活化。通过配对t检验分析进行统计分析。
[0167]
序列表
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]