一株高转化萝卜硫苷且产萝卜硫素的副干酪乳杆菌CCFM1221

一株高转化萝卜硫苷且产萝卜硫素的副干酪乳杆菌ccfm1221
技术领域
1.本发明涉及一株高转化萝卜硫苷且产萝卜硫素的副干酪乳杆菌ccfm1221，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.萝卜硫苷，分子式为c
12h23
no
10
s3，是活性物质萝卜硫素(分子式为c6h
11
nos2)的前体，在十字花科蔬菜尤其是西兰花种子或芽苗中含量较高。通常，植物中存在惰性的萝卜硫苷，只有当植物组织受到损伤或应激时，萝卜硫苷会与黑芥子酶反应生成萝卜硫素。
3.萝卜硫素因其多种功效受到人们的广泛关注。研究表明，萝卜硫素具有一定的抗癌作用，尤其是在前列腺癌方面，萝卜硫素能够抑制癌细胞的增殖和分化。萝卜硫素也能通过降低血糖、血脂的方式预防肥胖。此外，萝卜硫素也被研究应用于缓解神经性疾病，例如阿兹海默症、自闭症等。然而，萝卜硫素本身并不稳定，易挥发，且在几乎不在植物中天然存在，因此从植物提取萝卜硫素具有一定的难度。而体外水解萝卜硫苷产生萝卜硫素也受到ph，水分，温度等多种因素的限制。
4.人体通过膳食摄入十字花科等蔬菜，在肠道细菌的作用下，也可代谢萝卜硫苷产生萝卜硫素，但不同的人代谢能力存在显著差异。一项人群实验结果显示，志愿者体内对萝卜硫苷的转化率范围为1.1％～40％，但平均转化率仅10％左右，说明人体对萝卜硫苷的代谢能力并不高。如果促进肠道细菌对萝卜硫苷的转化，更有利于萝卜硫素的生成与消化吸收。
5.目前，已有文献报道一些来自发酵蔬菜的乳酸菌具有代谢萝卜硫苷的能力，比如植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌等，但是代谢产物萝卜硫素的产量不高且随时间的变化而减少，同时也有一些非活性物质腈类的生成。因此，急需找到一株能够高产萝卜硫素的益生菌，并制成益生菌制剂或发酵乳饮，通过膳食补充来促进机体转化萝卜硫苷和萝卜硫素的代谢与吸收。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一株可高产萝卜硫素的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221，并制成益生菌制剂或发酵乳饮，通过膳食补充来促进机体萝卜硫素的代谢与吸收。
7.本发明提供了一株副干酪乳杆菌(lacticaseibacillus paracasei)ccfm1221，分类学名为lacticaseibacillus paracasei，已于2022年3月6日保存至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62269，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
8.所述副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221在显微镜下细胞呈现轻微不规则、圆形末端、非运动的弯曲杆菌，接种于mrs培养基上培养48h后的菌落一般呈乳白色，光滑凸起，直径为0.5-2mm的圆形。
9.本发明还提供了含有所述副干酪乳杆菌ccfm1221的益生菌制剂。
10.在一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌ccfm1221的含量≥1
×
106cfu/g或1
×
106cfu/ml。
11.在一种实施方式中，所述益生菌制剂中还含有萝卜硫苷。
12.在一种实施方式中，所述萝卜硫苷的含量≥40mg/g。
13.在一种实施方式中，所述益生菌制剂的制备方法为：将副干酪乳杆菌ccfm1221以2％～4％的接种量接种于所述mrs培养基中，在37℃条件下厌氧培养24h，离心收集菌体，用ph＝7.0～7.2的磷酸盐缓冲液冲洗2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度10
10
cfu/ml；再将该悬浮液在37℃厌氧条件下培养1h后冷冻干燥制得所述发酵剂。
14.在一种实施方式中，所述冻干保护剂是使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、10g/l l-谷氨酸钠的保护剂。
15.本发明还提供含有所述副干酪乳杆菌ccfm1221的食品、药品、保健品或膳食补充剂。
16.在一种实施方式中，所述食品、药品、保健品或膳食补充剂中还含有萝卜硫苷。
17.在一种实施方式中，所述食品、保健品或膳食补充剂中还含有含萝卜硫苷的组合物；所述组合物包括但不限于蔬菜或蔬菜提取物。
18.在一种实施方式中，所述蔬菜包括但不限于：西兰花、白菜、甘蓝、芥菜中的一种或多种的混合。
19.在一种实施方式中，所述食品、保健品或膳食补充剂中含有副干酪乳杆菌ccfm1221和西兰花种子水提物。
20.本发明还提供一种促进副干酪乳杆菌ccfm1221利用萝卜硫苷生成萝卜硫素的方法，所述方法是将所述副干酪乳杆菌ccfm1221在以酵母粉为氮源的培养基中发酵。
21.在一种实施方式中，所述培养基以萝卜硫苷为碳源。
22.在一种实施方式中，所述培养基的成分含有：萝卜硫苷2.0g/l、酵母粉5g/l、半胱氨酸1g/l、抗坏血酸1g/l。
23.在一种实施方式中，所述发酵是将所述副干酪乳杆菌ccfm1221在30～37℃厌氧培养24～48h。
24.本发明还提供所述副干酪乳杆菌ccfm1221作为发酵微生物用于制备发酵食品或发酵饮品中的应用。
25.在一种实施方式中，所述发酵食品为乳制品、豆制品或者果蔬制品。可选地，所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。可选地，所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱。可选地，所述的果蔬制品是西兰花、甘蓝或圆白菜制品。
26.有益效果：
27.(1)本发明提供了一株副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221，此副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221具有很强的萝卜硫苷代谢能力，代谢萝卜硫素的酶活力为1.95
×
10-4
u/mg蛋白，可转化萝卜硫苷并产生萝卜硫素。与其他菌株相比，此副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221转化萝卜硫苷的能力明显更强。
28.(2)本发明通过优化培养基配方，提高了副干酪乳杆菌ccfm1221利用萝卜硫苷的能力，使萝卜硫苷的转化率提高至38％。
29.生物材料保藏
30.一株副干酪乳杆菌(lacticaseibacillus paracasei)ccfm1221，分类学名为lacticaseibacillus paracasei，已于2022年3月6日保存至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62269，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
31.图1是副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221的菌落形态图。
32.图2是副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)ccfm1221发酵液液相图。
33.图3是萝卜硫苷标准曲线。
34.图4是不同菌株对萝卜硫苷的利用能力。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。下述涉及的萝卜硫苷(产品编号：hy-n4068、cas：21414-41-5)萝卜硫素(产品编号：hy-13755、cas：4478-93-7)购于mce(medchemexpress)公司；西兰花种子水提物购于赣州华汉生物科技有限公司，每g西兰花种子水提物中萝卜硫苷含量(按质量百分比计)为20％；下述实施例中涉及的其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
36.下述实施例中涉及的培养基如下：
37.mrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、琼脂20g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
38.mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
39.改良mrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、萝卜硫苷2g/l、无水乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h20 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温-80 1ml/l、琼脂20g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
40.改良mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、萝卜硫苷2g/l、无水乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h20 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温-80 1ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
41.萝卜硫苷培养基：磷酸盐缓冲液(ph＝7.0)0.05mm、萝卜硫苷2.0g/l、半胱氨酸1g/l、抗坏血酸1g/l。
42.改良萝卜硫苷培养基：磷酸盐缓冲液(ph＝7.0)0.05mm、萝卜硫苷2.0g/l、酵母粉5g/l、半胱氨酸1g/l、抗坏血酸1g/l。
43.下述实施例中涉及的检测方法如下：
44.萝卜硫苷的检测方法：在waters 1525hplc系统中使用紫外(uv))检测器(229nm)分析，使用aq-c18色谱柱(5μm
×
4.6mm
×
150mm)进行分离，在30℃下等度洗脱，流速为1.0ml/min，流动相由95％0.08mol/l磷酸二氢钠溶液和5％甲醇(v/v)。
45.萝卜硫素的检测方法：使用uplc-q exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪
(thermo fisher scientific公司，美国)的二级平行监测(parallet-reaction-monitoting，prm)进行定性、定量分析。色谱柱为waters hss t3色谱柱(1.8μm
×
2.1mm
×
100mm)；柱温为35℃；流动相为：a-0.1％甲酸水，b-乙腈；流速为0.3min/l；进样量为2μl；梯度洗脱：0-3.0min 5％b，3-9min 5％-30％b，9-15min 30％-100％b，15-16min 100％b，16-16.5min 100％-5％b，16.5-20min 5％b。离子源采用hesi源(heated esi)，喷雾电压：3.5kv( )、3.2kv(-)，鞘气体积流量：35μl
·
min-1，离子传输管温度：320℃；辅助气体流量：15μl
·
min-1；辅助气温度：320℃。扫描模式：prm(100-500m/z)；分辨率：35000；采集极性：positive；agc target：5e 5；maximun it：100ms。
46.实施例1：副干酪乳杆菌ccfm1221的筛选、鉴定、观察和保存
47.取0.5g来自健康成人的新鲜粪便样品添加至4.5ml 0.9％生理盐水中进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在添加了0.2％溴甲酚紫的mrs固体改良培养基中，置于37℃厌氧条件下培养24～48h。选取变色圈明显单菌落接种至mrs平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体mrs液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株副干酪乳杆菌ccfm1221。
48.提取菌株ccfm1221的全基因组dna用于16s rdna的扩增，收集扩增后的dna片段用和测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成)，将该序列在ncbi中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌，命名为副干酪乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ccfm1221。
49.蘸取副干酪乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ccfm1221的菌液在mrs固体培养基上划线，于37℃厌氧培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈呈乳白色，光滑凸起，直径为0.5-2mm的圆形(具体可见图1)。
50.实施例2：副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷
51.将冷冻保存的副干酪乳杆菌ccfm1221划线于mrs固体培养基中，在37℃厌氧培养24～48h，再经mrs液体培养基传代2～3次后，以2％～4％的接种量接种于萝卜硫苷培养基在37℃厌氧培养24h。24h后离心保留上清液用于hplc测定萝卜硫苷含量。其中，萝卜硫苷培养基为磷酸盐缓冲液(ph＝7.0)0.05mm、萝卜硫苷2.0g/l、半胱氨酸1g/l、抗坏血酸1g/l。
52.实验结果如图2所示，与未接菌的萝卜硫苷溶液相比，接种副干酪乳杆菌ccfm1221的萝卜硫苷发酵液中峰面积显著减少。副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷含量为未接菌萝卜硫苷溶液与副干酪乳杆菌ccfm1221发酵液的萝卜硫苷含量差值。按照萝卜硫苷标准曲线(图3)计算，得到副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷含量为0.331g/l，转化率约为8.25％。(表1)
53.表1副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷
[0054][0055][0056]
对比例1：菌种代谢萝卜硫苷能力的差异
[0057]
在实施例2的基础上，将副干酪乳杆菌ccfm1221替换为副干酪乳杆菌ccfm1176，植物乳杆菌ccfm1189，鼠李糖乳杆菌ccfm1129。其中，副干酪乳杆菌ccfm1176保藏编号为gdmcc no：61573，公开于公开号为cn113122478a的专利申请文件中，植物乳杆菌ccfm1189保藏编号为gdmcc no：61763，公开于公开号为cn113913330a的专利申请文本中，鼠李糖乳杆菌ccfm1129保藏编号为gdmcc no：61100，公开于公开号为cn112625964a的专利申请文件中。测定不同菌株在萝卜硫苷培养基中于37℃厌氧发酵24h后萝卜硫苷的减少量。
[0058]
实验结果如图4所示，副干酪乳杆菌ccfm1221发酵后萝卜硫苷减少量(0.165
±
0.04)显著高于副干酪乳杆菌ccfm1176(0.101
±
0.03)，植物乳杆菌ccfm1189(0.070
±
0.02)，鼠李糖乳杆菌ccfm1129(0.083
±
0.02)发酵后的萝卜硫苷减少量，说明副干酪乳杆菌ccfm1221具有高转化萝卜硫苷的能力。
[0059]
实施例3：酵母粉促进副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷
[0060]
将冷冻保存的副干酪乳杆菌ccfm1221划线于mrs固体培养基中，在37℃厌氧培养24～48h，再经mrs液体培养基传代2～3次后，以2％～4％的接种量接种于改良萝卜硫苷培养基在37℃厌氧培养24h后，离心保留上清液用于hplc测定萝卜硫苷含量。其中，改良萝卜硫苷培养基为磷酸盐缓冲液(ph＝7.0)0.05mm、萝卜硫苷2.0g/l、酵母粉5g/l、半胱氨酸1g/l、抗坏血酸1g/l。
[0061]
结果如表2可知，改良萝卜硫苷培养基中萝卜硫苷含量为2.0g/l，经过24h副干酪乳杆菌发酵ccfm1221，萝卜硫苷含量减少了0.774g/l，说明副干酪乳杆菌ccfm1221代谢了38.7％的萝卜硫苷。与实施例2相比提高了30％，说明酵母粉能够促进副干酪乳杆菌ccfm1221对萝卜硫苷的代谢。
[0062]
表2副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷
[0063][0064][0065]
对比例2：不同氮源对副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷的影响
[0066]
在实施例3的基础上，将改良萝卜硫苷培养基中酵母粉等量替换成胰蛋白胨，以及酵母粉和胰蛋白胨以质量比1：1的混合物。测定不同氮源的萝卜硫苷培养基中，副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷的能力。
[0067]
结果如表3所示，不含氮源情况下，副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷最少；增加胰蛋白胨作为氮源并不能促进副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷；酵母粉促进副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷且转化最多的萝卜硫苷；酵母粉和胰蛋白胨的1：1混合物虽促进副干酪乳杆菌ccfm1221代谢，但效果不如酵母粉。说明在配制培养基时，可通过添加酵母粉促进副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷。
[0068]
表3不同氮源对副干酪乳杆菌ccfm1221代谢萝卜硫苷的影响
[0069][0070]
实施例4：副干酪乳杆菌在改良mrs培养基中的生长情况
[0071]
将冷冻保存的副干酪乳杆菌ccfm1221划线于mrs固体培养基中，在37℃厌氧培养24～48h，再经mrs液体培养基活化2～3次后，以2％～4％的接种量接种于改良mrs液体培养基中于37℃厌氧环境下静置培养，每隔2h测定培养液的od
600
值和ph，并保留上清液用于hplc检测萝卜硫苷含量。待鼠李糖ccfm1252生长进入稳定期，停止测定。其中，改良mrs培养基中用2g/l萝卜硫苷代替葡萄糖作为唯一碳源。
[0072]
实验结果如表4所示，副干酪乳杆菌ccfm1221能在以萝卜硫苷为唯一碳源的mrs中生长，且大约生长12h进入稳定期，萝卜硫苷含量随时间的延长不断减少，并且没有因为进入菌株生长进入稳定期而停止代谢。
[0073]
表4副干酪乳杆菌在改良mrs培养基中的生长情况
[0074][0075][0076]
实施例5：副干酪乳杆菌产萝卜硫素酶活力的测定
[0077]
将冷冻保存的副干酪乳杆菌ccfm1221划线于mrs固体培养基中，在37℃厌氧培养24～48h，再活化2～3次后，以2％～4％的接种量接种于mrs液体培养基中于37℃厌氧环境下静置培养24h后，取1ml菌液离心收集菌泥，用0.05mm的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.0)重悬菌泥，用45hz超声破碎后，离心得到细胞破碎上清液。于1.5ml离心管中加入100μl 1mm萝卜硫苷，200μl细胞破碎上清液，100μl 1mm抗坏血酸以及600μl 0.05mm的磷酸盐缓冲溶液，在37
℃反应150min后，保留上清液用于萝卜硫素含量和蛋白含量的测定。空白对照以200μl磷酸盐缓冲液代替细胞破碎上清液。定义：37℃下，每分钟转化生成1μmol萝卜硫素的酶量(mg)为1个酶活力单位。
[0078]
实验结果测得反应后上清液中萝卜硫素含量为2.73mg/l，测得细胞破碎上清液中蛋白含量为0.702mg/ml，计算的酶活力为1.95
×
10-4
u/mg。且空白对照中未检测到萝卜硫素的生成，说明副干酪乳杆菌ccfm1221能够代谢萝卜硫苷生成萝卜硫素。
[0079][0080]
实施例6：副干酪乳杆菌ccfm1221制备即食型乳酸菌粉剂
[0081]
将冷冻保存的副干酪乳杆菌ccfm1221划线于mrs固体培养基中，在37℃厌氧培养24～48h，再活化2～3次后，以2％～4％的接种量接种于所述mrs培养基中，在37℃条件下厌氧培养24h，离心收集菌体，用ph＝7.0～7.2的磷酸盐缓冲液冲洗2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度10
10
cfu/ml；再将该悬浮液在37℃厌氧条件下培养1h后冷冻干燥制得副干酪乳杆菌ccfm1221菌粉。
[0082]
其中，冻干保护剂是使用水与保护剂原料混合制备得到含100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、10g/l l-谷氨酸钠的保护剂。
[0083]
可选地，菌粉的制备过程中，可与其他种、属的乳酸菌混合，制备获得混合菌液，再进行冷冻干燥。
[0084]
可选地，将副干酪乳杆菌ccfm1176菌粉与西兰花种子水提物粉混合，得到即食型乳酸菌粉剂。
[0085]
可选地，将副干酪乳杆菌ccfm1176菌粉与低聚果糖、低聚半乳糖、西兰花种子水提物粉混合，得到即食型乳酸菌粉剂；可选地，副干酪乳杆菌ccfm1176菌粉与低聚果糖、低聚半乳糖、西兰花种子水提物粉按照质量比为5:1:1:3的比例混合。
[0086]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。