香蕉SSUII基因、克隆方法、表达载体及应用

香蕉ssuii基因、克隆方法、表达载体及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及香蕉ssuii基因的克隆、表达特性分析、表达载体构建、对香蕉类胡萝卜素合成的调控作用。


背景技术：

2.类胡萝卜素普遍存在于所有高等植物中，因其为维生素a的前体及能够强力清除单态氧的抗氧化剂而成为人体营养和健康最必需的成分之一，被称为维生素a原。医学研究证明，类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用。当人体类胡萝卜素摄取量不达标时，则会引发相应的疾病，例如维生素a缺乏症(vitamin a deficiency，vad)与微量营养元素缺乏(micronutrient deficiencies，mnds)。世界卫生组织(who)估计，有25万至50万儿童因缺乏维生素a而失明，撒哈拉以南非洲和南亚是vad的高发区。微量营养元素缺乏会造成“隐形饥饿”，导致传染病、精神障碍和视力丧失等残疾的发病率上升，甚至死亡。
3.香蕉(musa spp.)，芭蕉科芭蕉属多年生大型常绿单子叶草本植物，是世界四大水果之一，也是许多发展中国家的主要粮食作物，具有很高的经济价值及营养价值，但常见香蕉品种中类胡萝卜素含量相对匮乏。不同香蕉品种类胡萝卜素含量存在差异，密克罗尼西亚联邦的研究发现，黄色和橙色果肉的香蕉品种含有最高水平的反式β-胡萝卜素。前期的研究发现，目前主要栽培的aaa 型香蕉中类胡萝卜素含量较低，但非主栽品种ttt型的karat香蕉中，成熟香蕉的类胡萝卜素含量高达2230μg/100g，是香蕉主要栽培品种类胡萝卜素含量的100倍以上。
4.高等植物通常有一个短链prenyltransferase(pts)基因家族，heterodimericgeranylgeranyl pyrophosphate synthase small subunit(ssuii)基因属于此家族，是类胡萝卜素合成的前体基因，在类胡萝卜素合成途径中发挥作用的位置极为关键，通过影响下游类胡萝卜素合成相关基因的表达，调控类胡萝卜素合成及积累。
5.通过对比ttt型香蕉和aaa型香蕉的转录组发现，普通aaa型香蕉中只含有一个ssuii基因，而ttt型karat香蕉ssuii基因有三个拷贝。同时实时荧光定量pcr结果表明，ttt型香蕉中的ssuii基因表达量明显高于aaa型及 bb型香蕉的表达量。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种香蕉ssuii基因香蕉ssuii基因，该基因序列具有序列表中seq id no.1所示的核苷酸序列。本发明从香蕉叶片中分离出ssuii 基因的全长cdna，并首次鉴定出ssuii具有促进类胡萝卜素形成的功能。
7.本发明的另一目的在于提供一种香蕉ssuii基因的克隆方法，包括以下步骤：
8.(1)以karat香蕉(musa spp.)为材料，利用ctab法提取总rna：
9.(2)ssuii基因的克隆：
10.(2-1)利用invitrogen公司的superscript iii kit将rna反转录为cdna，作为pcr
模板备用；
11.(2-2)设计全长cdna扩增引物；
12.(2-3)根据引物的tm值进行pcr条件的优化后，进行pcr扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经pcr和酶切鉴定后进行序列测定。
13.进一步地，步骤(1)总rna的提取具体如下：
14.(1-1)取1ml ctab提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；
15.(1-2)称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有ctab提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；
16.(1-3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇24:1，涡旋混合，室温，10000rpm 离心15min；
17.(1-4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤(1-3)；
18.(1-5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8m licl，4℃沉淀过夜；
19.(1-6)4℃，10000rpm离心30min；
20.(1-7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；
21.(1-8)将沉淀溶解在65℃预热的100μl ste中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；
22.(1-9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30min，或-20℃沉淀 2h；
23.(1-10)4℃，10000rpm离心20min；
24.(1-11)沉淀分别用75％的乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20ul rnase-free 水溶解。
25.进一步地，步骤(2-2)中的扩增引物包括5’端引物和3’端引物，序列分别如序列表中的seq id no.2、seq id no.3所示，具体如下：
[0026]5’
端引物:5’cccaatcgtcttctttatcg 3’[0027]3’
端引物:5’actcagccatcagtcaacct 3’。
[0028]
pcr体系及条件为：
[0029][0030]
[0031][0032]
ssuii获得全长的cdna为1309bp，均包括部分起始密码子前的5’utr和终止密码子后的3’utr。开放阅读框部分为1053bp，由此推得3组具有350个氨基酸的一段序列，通过对比发现，氨基酸序列具有一个富含天门冬氨酸的farm结构域(ddxxxxd，“x”为任意氨基酸)，以及两个cxxxc结构域(“x”为任意氨基酸)。将氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的姜黄、稻米籼、铁皮石斛的ssuii蛋白的氨基酸同源性分别为77％、69％、66％。
[0033]
本发明的再一目的在于提供一种香蕉ssuii基因表达载体，利用了所述的香蕉ssuii基因为目的基因的表达载体，具体是香蕉ssuii基因插入到植物表达载体pbi121上，构建成在35s启动子下游含有香蕉ssuii基因的高效表达载体。
[0034]
进一步地，根据已测序的ssu-ii基因序列，设计在5’端加上kpni酶切位点的上游引物p1和在3’端加上xbai酶切位点的下游引物p2，通过pcr反应扩增目的片段，回收pcr产物，经测序无误后再用kpni和xbali双酶切该产物和植物表达载体pbi121，并将酶切获得的含有两个酶切位点的基因和pbi121载体大片段连接获得含有ssuii基因的表达载体。
[0035]
进一步地，所述上游引物p1和下游引物p2的序列分别如序列表中的seqidno.4、seqidno.5所示；
[0036]
具体为上游引物p1：5
’‑
cgggggacgagctcggtacc-3’；
[0037]
下游引物p2：5
’‑
accatggtgtcgactctaga-3’。
[0038]
本发明香蕉ssuii基因在高类胡萝卜素香蕉分子育种技术中的应用。
[0039]
ssu-ii基因在不同基因型香蕉中的表达：
[0040]
利用实时荧光定量pcr测定了不同基因型香蕉叶片中ssuii基因的表达水平，结果显示，在不同基因型香蕉中，ssuii基因表达量有明显不同。其中，ttt基因型香蕉的基因表达含量最高。
[0041]
本发明具有以下的有益效果：
[0042]
本发明通过提取香蕉“musaspp.”总rna，反转录合成cdna，以此为模板，设计特异引物，利用pcr方法获得ssu-ii基因的全长cdna，与peasy-blunt载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆得到香蕉ssu-ii基因，该基因的cdna全长为mt21507为1309bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚a尾巴。利用实时荧光定量pcr测定了不同基因型香蕉ssuii基因的表达水平，证实ttt型karat香蕉中的ssuii基因表达量确高于aaa型以及bb型香蕉。将ssuii基因连接到植物表达载体pbi121上，构建一个新的植物表达载体，命名为pbi121-ssuii。该基因会影响香蕉果实的类胡萝卜素含量的积累，因此ssuii基因的获得，为研究香蕉高类胡萝卜素含量的分子机理和改造低类胡萝卜素香蕉，为香蕉高类胡萝卜素含量育种提供理论依据具有重要的理论及实践意义。
具体实施方式
[0043]
通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可
从商业途径得到。
[0044]
实施例1：香蕉基因的克隆方法
[0045]
1、总rna的提取：
[0046]
(1)取1ml ctab提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；
[0047]
(2)称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有ctab提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；
[0048]
(3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；
[0049]
(4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤(3)；
[0050]
(5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8m licl，4℃沉淀过夜；
[0051]
(6)4℃，10000rpm离心30min；
[0052]
(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；
[0053]
(8)将沉淀溶解在100μl ste(65℃预热)中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；
[0054]
(9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30min，或-20℃沉淀2h；
[0055]
(10)4℃，10000rpm离心20min；
[0056]
(11)沉淀分别用75％的乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20ul rnase-free水溶解。
[0057]
2、ssu-ii基因的克隆及序列分析
[0058]
(1)利用invitrogen公司的superscript iii kit将rna反转录为cdna，作为pcr 模板备用。
[0059]
(2)设计全长cdna扩增引物：
[0060]5’
端引物:5’cccaatcgtcttctttatcg 3’[0061]3’
端引物:5’actcagccatcagtcaacct 3’[0062]
(3)根据引物的tm值进行pcr条件的优化后，按照发明内容一所述的方法进行 pcr扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经pcr和酶切鉴定后进行序列测定。
[0063]
(4)同源检索：利用blast软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。
[0064]
实施例2：香蕉ssuii基因在不同基因型香蕉中的实时荧光定量rt-pcr表达检测
[0065]
提取aaa型、bb型、ttt型香蕉叶片的rna，并反转录cdna，利用实时荧光定量pcr仪对各基因型的cdna模板进实时荧光定量pcr分析。根据 qpcr引物设计原则设计特异引物，内参基因为香蕉musa actin。引物序列如下：
[0066][0067]
以sybr green i作为荧光染料，利用qpcr测定ssuii基因在不同基因型香蕉中的相对表达水平，用2-δδct
法计算ssuii基因在各样品中的相对表达量。反应在quantstudio
tm 3荧光定量pcr仪(thermo fisher scientific)上进行。反应体系为20μl(模板2μl，正反向引物各0.4μl，50
×
rox reference dye2 染料0.4μl，qpcr master mix混合液10μl，灭菌去离子水补齐至20μl)。反应程序为：95℃预变性30s；95℃10s，60℃30s，40个循环。融解曲线采集使用仪器默认程序。
[0068]
实施例3：香蕉ssuii基因植物表达载体pbi121的构建 1、根据分离出的香蕉ssuii
基因的核苷酸序列,设计引物:
[0069]
正向引物：
[0070]
5'-cgggggacgagctcggtacccccaatcgtcttctttatcg-3'
[0071]
反向引物：
[0072]
5'-accatggtgtcgactctagaactcagccatcagtcaacct-3'
[0073]
以总rna反转录的5’race的cdna为模板,进行聚合酶链式反应。
[0074]
2、取5μlpcr产物与peasy-blunt载体进行连接，操作步骤按trans公司产品 peasy-bluntcloningkit说明书进行。然后转化大肠杆菌dh5α菌株，在表面涂异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)和5-溴-4氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x－gal) 的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的lb平板上生长过夜。挑取白色菌落，在lb 液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna,进行序列测定。
[0075]
3、用kpni和xbai两个限制性内切酶将该基因从peasy-blunt载体上切下,与相同酶酶切的pbi121连接。连接产物转化dh5α细胞，然后在含卡那霉素的lb固体平板上培养，对菌落进行pcr鉴定和质粒dna的酶切分析。将构建好的重组子命名为pbi121-ssuii。
[0076]
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。