经修饰的细胞外包膜病毒的制作方法

经修饰的细胞外包膜病毒
1.交叉引用
2.本技术要求2019年10月16日提交的美国临时申请第62/916,035号的权益，该美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
3.通过引用并入
4.本说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请和ncbi登录号均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入，并且如同以其整体阐述。在本文所用的术语与所并入的参考文献中定义的术语之间存在冲突的情况下，以本公开内容的定义为准。
5.概述
6.一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个突变的a34r蛋白或其片段的核酸，其中该至少两个突变处于与野生型痘苗病毒a43r蛋白(seq id no.4)的位置lys119和lys151相对应的位置。在一些实施方案中，处于与位置lys119相对应的位置的突变是lys119glu。在一些实施方案中，处于与位置lys151相对应的位置的突变是lys151glu。在一些实施方案中，处于与野生型痘苗病毒a43r蛋白(seq id no.4)的位置lys119和lys151相对应的位置的至少两个突变分别为lys119glu和lys151glu。
7.一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该至少两个非天然存在的突变位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)内在ph 5带正电荷的氨基酸残基。
8.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该至少两个非天然存在的突变不在野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置110处。
9.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该至少两个非天然存在的突变不在野生型a34r蛋白(seq id no.4)内的天冬氨酸残基处。
10.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该至少两个非天然存在的突变独立地位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)内的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸残基。
11.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该非天然存在的突变在野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys151以外的位置的赖氨酸残基处。
12.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该非天然存在的突变在野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys119处。
13.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个非天然存
在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，该至少两个非天然存在的突变位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)内在ph 5带正电荷的氨基酸残基，其中与不包含至少两个非天然存在的突变的其他方面相同的溶瘤病毒相比，该经修饰的溶瘤痘病毒在病毒噬斑形成测定中产生数目增加的彗星尾型噬斑。
14.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其包含编码包含至少两个非天然存在的突变的a34r蛋白或其片段的核酸，其中如果非天然存在的突变中的任一个在野生型a34r蛋白(seq id no.4)内的位置110处，则编码的氨基酸不是天冬酰胺残基。
15.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其与溶瘤痘病毒的野生型毒株相比显示出对中和抗体的增加的抗性，其中增加的抗性通过在用抗l1 nr-45114抗体或抗vig抗体处理后，病毒噬斑测定中由该经修饰的溶瘤痘病毒或野生型毒株产生的噬斑数来测量，并且其中该经修饰的溶瘤痘病毒产生至少约55,000个噬斑形成单位/ml。
16.另一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，在用中和抗体处理后，该经修饰的溶瘤痘病毒在病毒噬斑测定中产生至少约55,000个噬斑形成单位/ml。
17.在一些实施方案中，中和抗体是抗l1 nr-45114抗体或抗vig抗体。在一些实施方案中，a34r蛋白或其片段还包含野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys151处的突变。在一些实施方案中，在ph 5带正电荷的氨基酸残基是赖氨酸残基。在一些实施方案中，核酸包含与病毒基因vacwr157内的编码序列至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，核酸包含与如seq id no.3列出的核苷酸序列至少约80％同源的核苷酸序列。在一些实施方案中，两个非天然存在的突变中的至少一个位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)的lys119位置。在一些实施方案中，非天然存在的突变在野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys119处。在一些实施方案中，野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys119处的突变为lys119glu。在一些实施方案中，两个非天然存在的突变中的至少一个位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys151处。在一些实施方案中，野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置lys151处的突变为lys151glu。
18.一种实施方案提供了经修饰的溶瘤痘病毒，其表达包含突变lys119glu和lys151glu的a34r蛋白。
19.在一些实施方案中，seq id no.3的位置305-307包含核苷酸gaa或gag。在一些实施方案中，seq id no.3的位置451-453包含核苷酸gaa或gag。在一些实施方案中，与不包含至少两个非天然存在的突变的其他方面相同的溶瘤病毒相比，经修饰的溶瘤痘病毒产生比细胞内成熟病毒形式更大量的细胞外包膜病毒形式。在一些实施方案中，与不包含非天然存在的突变的其他方面相同的溶瘤病毒相比，经修饰的溶瘤痘病毒产生比细胞内成熟病毒形式更大量的细胞外包膜病毒形式。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒还包含外源核酸，该外源核酸编码治疗蛋白或诊断蛋白中的至少一种。在一些实施方案中，外源核酸可编码以下中的至少一种：趋化因子受体、膜相关蛋白、能够降解透明质酸的微生物蛋白、微生物蛋白、socs3、ph-20、hmgb1、pias3、il15、il15-rα、light、itac、分形趋化因子、ccl5、n1l、免疫检查点调节剂、代谢调节蛋白，或其任何组合，诸如包含以上任何组合的融合蛋白(诸如代谢调节蛋白和细胞因子)。在一些实施方案中，外源核酸编码趋化因子受体，其中所述趋化因子受体包括cxcr4和ccr2中的至少一种。在一些实施方案中，外源核酸编码膜相关蛋白。在一些实施方案中，膜相关蛋白包括膜相关透明质酸酶。在一些实施方案中，膜相关
透明质酸酶包括ph-20。在一些实施方案中，ph-20是gpi锚定的。在一些实施方案中，外源核酸编码能够降解透明质酸的微生物蛋白，其中微生物蛋白包括分泌的透明质酸酶。在一些实施方案中，分泌的透明质酸酶包括hysa、lin、sko和rv中的至少一种，或其任何组合。在一些实施方案中，外源核酸编码微生物蛋白。在一些实施方案中，微生物蛋白包括hysa。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒还包含病毒基因组中的修饰，其中该修饰包括b5r基因的突变或缺失。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒还包含病毒基因组中的修饰，其中该修饰包括b5r基因的scr区中的突变或缺失，其中所述scr区包括scr1、scr3、scr4或其任何组合，并且其中所述scr区不包括scr2。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒还包含选自由以下组成的组的病毒基因的突变或缺失：胸苷激酶(tk)、b8r、b18r、b15r、k7r、c6l、k4l、f8l、f9l、f10l、f17r、e1l、e4l、e6r、e8r、e10r、e11l、o2l、i1l、i2l、i3l、i5l、i7l、i8r、g1l、g3l、g4l、g5.5r、g7l、g9r、l1r、l3l、l4r、l5r、j1r、j4r、j6r、h1l、h2r、h3l、h4l、h5r、h6r、d1r、d2l、d3r、d6r、d7r、d8l、d11l、d12l、d13l、a2.5l、a3l、a4l、a5r、a6l、a7l、a9l、a10l、a13l、a14l、a15l、a16l、a17l、a18r、a21l、a24r、a25l、a26l、a27l、a28l、a29l、a30l、a31r、a34r、a42r、a45r、a46r、a52r及其任何组合。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒包含病毒基因a52r的突变或缺失。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒包含(i)编码趋化因子受体的外源核酸，其中趋化因子受体包括cxcr4和ccr2中的至少一种；(ii)编码pias3的外源核酸；(iii)胸苷激酶基因的突变或缺失；(iv)a52r基因的突变或缺失。在一些实施方案中，该病毒适于全身递送。在一些实施方案中，该病毒能够免疫逃避。在一些实施方案中，全身递送包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任何组合。在一些实施方案中，肠胃外施用包括静脉内注射。在一些实施方案中，病毒适于瘤内递送。在一些实施方案中，痘病毒是痘苗病毒。
20.一种实施方案提供了用于工程化溶瘤痘病毒的方法，该方法包括：(i)获得溶瘤痘病毒dna骨架载体，该溶瘤痘病毒dna骨架载体包含根据前述权利要求中任一项的一种或更多种修饰；(ii)进一步修饰溶瘤病毒dna载体以产生工程化dna载体；(iii)用工程化dna载体转染哺乳动物细胞；(iv)在适于病毒复制的条件下培养哺乳动物细胞；以及(v)收获病毒颗粒。
21.在一些实施方案中，哺乳动物细胞包括hela细胞、293细胞、a549细胞或vero细胞。
22.一种实施方案提供了药盒，该药盒包含：溶瘤痘病毒，容器；以及向受试者施用所述溶瘤病毒以治疗与病理性血管生成相关的紊乱的说明。
23.一种实施方案提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的溶瘤痘病毒。
24.一种实施方案提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用包含用经修饰的溶瘤痘病毒感染的患者来源的白细胞的组合物，该经修饰的溶瘤痘病毒表达包含野生型a34蛋白(seq id no.4)的位置119和151处的突变的a34r蛋白，其中该经修饰的溶瘤痘病毒在肿瘤微环境中产生病毒颗粒群体。在一些实施方案中，患者来源的白细胞包括巨噬细胞。在一些实施方案中，患者来源的白细胞包括肿瘤靶向t细胞。在一些实施方案中，病毒颗粒群体中的至少约10％至至少约90％是eev颗粒，如在病毒噬斑测定中测量的。在一些实施方案中，该方法还包括从肿瘤微环境收获eev颗粒以及向受试者静脉内施用该eev颗粒。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒是经修饰的溶瘤痘苗病毒。
25.一种实施方案提供包括用包含至少约10％至至少约90％eev颗粒的经修饰的溶瘤痘病毒群体感染宿主细胞培养物的方法，其中该经修饰的溶瘤痘病毒表达包含野生型a34蛋白(seq id no.4)的位置119和151处的突变的a34r蛋白。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒是经修饰的溶瘤痘苗病毒。
26.一种实施方案提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用经修饰的溶瘤病毒，该经修饰的溶瘤病毒包含编码包含至少两个突变的a34r蛋白或其片段的核酸，其中该至少两个突变位于与野生型痘苗病毒a43r蛋白(seq id no.4)的位置lys119和lys151相对应的位置。在一些实施方案中，处于与野生型痘苗病毒a43r蛋白(seq id no.4)的位置lys119和lys151相对应的位置的至少两个突变分别为lys119glu和lys151glu。
27.一种实施方案提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括向患者施用经修饰的溶瘤病毒，该经修饰的溶瘤病毒包含编码包含至少两个突变的a34r蛋白或其片段的核酸，其中该至少两个突变位于与野生型痘苗病毒a43r蛋白(seq id no.4)的位置lys119和lys151相对应的位置。在一些实施方案中，处于与野生型痘苗病毒a43r蛋白(seq id no.4)的位置lys119和lys151相对应的位置的至少两个突变分别为lys119glu和lys151glu。
28.在一些实施方案中，施用经由瘤内注射、静脉内注射或其组合进行。在一些实施方案中，施用经由瘤内注射、静脉内注射或其组合进行。
29.在一些实施方案中，该方法还包括与溶瘤痘病毒组合施用另外的疗法，其中该另外的疗法包括以下中的至少一种：化学疗法、放射疗法、采用另外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、car t细胞疗法、抗癌剂、免疫调节剂，或其任何组合。
30.在一些实施方案中，另外的疗法包括选自由以下组成的组的免疫调节剂：抗cd33抗体或其抗原结合片段、抗cd11b抗体或其抗原结合片段、cox2抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗ctla4抗体或其抗原结合片段、抗pd-1抗体或其抗原结合片段、抗pd-l1抗体或其抗原结合片段和tlr激动剂。
31.附图简述
32.本公开内容的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
33.图1示出产生用于制造重组病毒文库的dna的示例性组装方案。
34.图2示出由不同的痘苗病毒毒株形成的病毒噬斑彗星尾的比较。
35.图3a-图3b示出使用不同的痘苗病毒毒株进行的中和测定的结果(图3a示出用抗l1 nr-45114抗体处理后的结果，以及图3b示出用抗l1r和vig抗体处理后的结果)。
36.图4示出用不同的痘苗病毒毒株感染后细胞生存力的结果(上图：mc38细胞；下图：hct116细胞)。
37.图5示出不同的痘苗病毒毒株在癌细胞中病毒复制测定的结果(上图：hct116细胞；下图：mc38细胞)。
38.详细描述
39.虽然本文已经示出并描述了本公开内容的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开内容中可以采用本文描述
的本公开内容的实施方案的各种替代方案。旨在以以下权利要求书限定本公开内容的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
40.某些定义
41.本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，而非限制性的。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”可包括复数形式。此外，就术语“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变化形式在详细描述和/或权利要求书中使用的程度而言，这样的术语意图以类似于术语“包含(comprising)”的方式为包含性的。
42.术语“约(about)”或“大约(approximately)”可以意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围之内(这将部分地取决于值如何被测量或确定)，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准差内。在本技术和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应被认为意指该特定值的可接受误差范围，诸如由术语“约”修饰的值的
±
10％。
43.术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用。这些术语都不要求或局限于以卫生保健工作者(例如，医生、注册护士、从业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作人员)的监护(例如，持续的或间歇的)为特征的情形。在一些实施方案中，患者、受试者或个体可以在医疗保健工作者的监护之下。
44.如本文所用的，与特定病毒相关的术语“异源核酸序列”或“外源核酸序列”或“转基因”可指源自除指定病毒之外的来源的核酸序列。
45.如本文所用的，术语“突变”可指缺失、异源核酸的插入、倒位或取代，包括本领域通常理解的消除开放阅读框的突变。
46.如本文所用的，术语“基因”可指编码单个蛋白质或rna的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，其任选地与相关联的调节区诸如启动子、操纵子、终止子等在一起，该调节区可以位于编码序列的上游或下游。
47.如在本文中可互换使用的，术语“突变病毒”和“经修饰的病毒”可指在其基因组中包含一个或更多个突变的病毒，该突变包括但不限于缺失、异源核酸的插入、倒位、取代或其组合。
48.如本文关于病毒使用的术语“天然存在的”可表示该病毒可以在自然界中发现，即，它可以从自然界中的来源分离并且未经有意修饰，例如，野生型病毒。
49.如本文关于病毒核酸序列中或病毒蛋白的氨基酸序列中的一个或更多个突变使用的，术语“非天然存在的”可以指示病毒毒株包含一个或更多个在自然界中无法找到的突变，即，它不能从自然界中的来源分离而是已被有意修饰的。
50.本文提及的术语“抑制”、“减少”或“防止”或这些术语的任何变化可包括任何可测量的降低或完全抑制以实现期望的结果。
51.如本文所用的，“启动子”可以是为控制转录起始和转录速率的核酸序列区域的控制序列。在某些实施方案中，启动子可含有遗传元件，在此处调节蛋白质和分子，诸如rna聚合酶和其他转录因子可以结合。术语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”可意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录起始和/或表达。在某些实施方案中，启动子可以与或者可以不与“增强子”联合使
用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
52.如本文所用的，术语“同源性”可以是两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较目的而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则这些分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。搜索可以确定两个序列之间的同源性。同源性可以在两个序列的整个长度之间或在两个序列的整个长度的部分之间。这两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过公知的方法来完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可描述于karlin,s.和altschul,s.,proc.natl.acad.sci.usa,90-5873-5877(1993)中。如altschul,s.等人,nucleic acids res.,25:3389-3402(1997)中描述的，这样的算法可以并入nblast和xblast程序(2.0版)中。当使用blast和gapped blast程序时，可以使用相应程序(例如，nblast)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以设置为得分＝100，字长＝12，或者可以变化(例如，w＝5或w＝20)。其他实例包括myers和miller,cabios(1989)的算法、advance、adam、blat和fasta。在另一种实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如gcg软件包(accelrys,cambridge,uk)中的gap程序来完成。
53.术语“受试者”可指动物，包括但不限于灵长类(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”和“患者”在本文中提及例如哺乳动物受试者诸如人类受试者时可互换使用。
54.术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”可意在包括减轻或消除紊乱、疾病或状况，或一种或更多种与该紊乱、疾病或状况相关的症状；或减轻或根除该紊乱、疾病或状况的病因本身。合意的治疗效果可包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改进预后。
55.术语“治疗有效量”可指当施用时，可以足以防止所治疗的紊乱、疾病或状况的一种或更多种症状的发展或将其减轻一定程度的化合物的量。术语“治疗有效量”还可指足以引发研究者、兽医、医生或临床医师所寻求的细胞、组织、系统、动物或人类的生物学或医学应答的化合物的量。
56.术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”可指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上来讲，组分可以是“药学上可接受的”。它还可适于与人类和动物的组织或器官接触使用，而没有过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他问题或并发症，对应合理的受益/风险比。
参见remington:the science and practice of pharmacy,第21版；lippincott williams&wilkins:philadelphia,pa,2005；handbook of pharmaceutical excipients,第5版；rowe等人编著,the pharmaceutical press and the american pharmaceutical association:2005；和handbook of pharmaceutical additives,第3版；ash和ash编著,gower publishing company:2007；pharmaceutical preformulation and formulation,gibson编著,crc press llc:boca raton,fl,2004。
57.术语“药物组合物”可指本文公开的化合物与其他化学组分诸如稀释剂或载体的混合物。药物组合物可以有助于将该化合物施用于生物体。本领域存在施用化合物的多种技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和表面(topical)施用。药物组合物也可通过使化合物与无机酸或有机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等反应来获得。
58.如本文所用的，“抗癌剂”可指能够负面地影响受试者中的癌症的药或疗法，例如，通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞中的凋亡、降低癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或次数、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或延长患有癌症的受试者的寿命。抗癌剂的非限制性实例可包括生物制剂(生物疗法)、化疗剂和放疗剂。
59.如本文所用的，术语“溶瘤”可指由病原体，诸如溶瘤病毒，诸如溶瘤痘病毒、诸如溶瘤痘苗病毒，来杀伤癌细胞或肿瘤细胞，例如，该杀伤是通过经由刺激针对所述细胞的免疫应答、凋亡、表达毒性蛋白质、自噬和蛋白质合成的关闭、诱导抗肿瘤免疫或其任何组合来直接裂解所述细胞。由病原体诸如溶瘤痘苗病毒感染的癌细胞或肿瘤细胞的直接裂解可以是该病毒在所述细胞内复制的结果。在某些实例中，术语“溶瘤”可指在不裂解所述细胞的情况下杀伤癌细胞或肿瘤细胞。
60.如本文所用的术语“溶瘤病毒”可指优先感染并杀伤肿瘤细胞的病毒。在某些非限制性情况下，应当理解，溶瘤病毒可通过双重机制促进抗肿瘤应答，所述双重机制不仅依赖于肿瘤细胞的选择性杀伤，而且还依赖于宿主抗肿瘤免疫应答的刺激。
61.在一些实施方案中，溶瘤病毒可以包括但不限于：(i)天然地优先在癌细胞中复制并且通常由于对先天抗病毒信号转导的敏感性提高或对致癌信号转导途径的依赖性而在人类中不致病的病毒；和(ii)经过遗传操作以供使用的病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以包括单纯疱疹病毒(hsv)。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以包括痘病毒。在一些实施方案中，痘病毒可以包括兔痘病毒或痘苗病毒。在一些实施方案中，痘苗病毒可以包括安卡拉毒株、western reserve毒株(wr)或copenhagen毒株的痘苗病毒。在一些实施方案中，痘苗病毒可以包括lister、wyeth、new york city board of health、tian tan、tash kent或ussr毒株。在一些实施方案中，兔痘病毒可以包括黏液瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以是经修饰的。
62.如本文所用的，术语“经修饰的溶瘤病毒”可指包含对其成分的修饰的溶瘤病毒，该修饰诸如但不限于病毒的天然基因组(“骨架”)中的修饰，如病毒基因的突变或缺失、外源核酸的引入、病毒核酸或病毒蛋白质的化学修饰以及外源蛋白质或经修饰的病毒蛋白质向病毒衣壳的引入。通常，溶瘤病毒可以被修饰(也被称为“工程化”)以便获得针对肿瘤细胞的改进的治疗效果。在某些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以是经修饰的痘病毒。
在某些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以是经修饰的痘病毒。
63.在本文中可互换使用的术语“全身递送”和“全身施用”在一些情况下可指将药物、溶瘤病毒或其他物质施用至循环系统内的途径。所述全身施用可包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任何组合。
64.细胞外包膜病毒形式的溶瘤痘苗病毒
65.痘病毒(诸如痘苗病毒)可以以若干种形式存在，包括imv(细胞内成熟病毒；它具有高度抗原性但是稳定的，并且对痘病毒在宿主之间的传播可以是重要的)和eev(细胞外包膜病毒；它在宿主外部可以是不稳定的，但由于宿主细胞来源的外包膜隐藏了病毒，可能增强宿主内部的传播；因此，eev形式可以有助于宿主内痘苗病毒例如溶瘤痘苗病毒的全身传播)。
66.已知不同的痘苗毒株在感染易感细胞后产生不同比例的imv和eev颗粒，其中western reserve(wr)毒株是低eev产生毒株，而痘苗的international health department(ihd)-j毒株(ihd-j)是高eev产生毒株。存在于ihd-j中而不存在于wr中的痘苗基因点突变的一个实例是在a34r蛋白中(k151e)，其由痘苗病毒基因vacwr157编码。含有该突变的源自wr的毒株(wi毒株，其是具有将ihd-j的a34r基因重组到wr的a34r基因基因座的wr病毒)示出增加的eev产生(参见blasco,r.,等人1993jvirol.jun；67(6):3319-25)。
67.在本公开内容的一些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤痘病毒(例如，经修饰的溶瘤痘苗病毒毒株)，其可以包括诸如病毒糖蛋白(例如，a34r蛋白；野生型序列提供于uniprot登录号p24761；seq id no.4)中的非天然存在的突变的修饰，其增强病毒的细胞外包膜病毒(eev)与细胞内成熟病毒(imv)形式的比率。例如，包含病毒糖蛋白(例如，a34r蛋白)中非天然存在的突变的经修饰的溶瘤痘苗病毒毒株可以释放与imv颗粒相比更高量的eev颗粒。
68.在一些实施方案中提供了经修饰的溶瘤痘苗病毒毒株，其可以包含病毒糖蛋白诸如a34r中的两个或更多个非天然存在的突变。突变的a34r蛋白(本文中也称为“wo34”)的示例性氨基酸序列在seq id no.5中提供。
69.在一些实施方案中，两个或更多个非天然存在的突变可以在野生型a34r蛋白(seq id no.4)或其片段内在带正电荷的氨基酸残基(例如，赖氨酸)处，其中带正电荷的氨基酸残基在ph 5带正电荷。在一些实施方案中，两个或更多个非天然存在的突变中的至少一个可以在野生型a34r蛋白(seq id no.4)或其片段内的位置110处。在一些实例中，如果两个或更多个突变中的至少一个在野生型a34r蛋白(seq id no.4)的位置110处，则该位置处的突变的氨基酸不是天冬酰胺。
70.在一些实施方案中，两个或更多个非天然存在的突变不位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)或其片段内的天冬氨酸残基。在一些实施方案中，两个或更多个非天然存在的突变可以独立地位于野生型a34r蛋白(seq id no.4)或其片段内的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸残基。在一些实施方案中，由经修饰的溶瘤痘病毒表达的a34r蛋白或其片段可以包含赖氨酸残基中的非天然存在的突变，其中赖氨酸残基在野生型a34r蛋白(seq id no.4)或其片段的位置lys151以外的位置处。在一些实施方案中，由经修饰的溶瘤痘病毒表达的a34r蛋白或其片段可以包含位置lys119处
的非天然存在的突变。
71.在一些实施方案中，两个或更多个非天然存在的突变可以在野生型a34r蛋白(seq id no.4)或其片段的残基119和151处。在一些实施方案中，位置119处的突变可以是lys119glu(k119e)。在一些实施方案中，位置151处的突变可以是lys151glu(k151e)。
72.在一些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤痘病毒毒株，其可以包含病毒蛋白(诸如血凝素、神经氨酸酶、刺突(s)糖蛋白、e1、e2、gp120、gp160、gp41、gp1、gp2、e(二聚体)、e1或e2)中的突变。
73.在一些情况下，经修饰的溶瘤痘病毒a34r蛋白中的两个或更多个非天然存在的突变可以导致病毒的细胞外包膜病毒(eev)形式与细胞内成熟病毒(imv)形式的比率增加。
74.在一些实施方案中，与在a34r蛋白中不包含两个或更多个非天然存在的突变但在其他方面相同的痘病毒毒株相比，经修饰的溶瘤痘病毒a34r蛋白中的两个或更多个非天然存在的突变可以导致病毒的eev形式与imv形式的比率增加。
75.在一些实施方案中，与由在组织培养中释放较低水平的eev颗粒的痘病毒毒株(例如，在a34r蛋白中不包含至少两个非天然存在的突变的痘苗病毒毒株)在组织培养中形成的大的圆形噬斑相比，本文提供的在a34蛋白中包含至少两个非天然存在的突变的经修饰的痘病毒毒株释放高水平的eev颗粒，如通过组织培养中增加的彗星形成测量的。
76.由在a34r蛋白中包含至少两个非天然存在的突变的本公开内容的经修饰的痘病毒释放的eev颗粒，在一些实施方案中，对抗体(中和抗体)中和和补体毒性有抗性，而imv颗粒对此没有抗性。因此，eev颗粒可以介导体外和体内长距离播散。
77.与imv颗粒相比，eev颗粒还可以具有更高的比感染性(如通过更低的颗粒/pfu比率确定的)。因此，释放更高水平eev颗粒的经修饰的痘病毒毒株可以是用于治疗用途的改进的病毒。
78.在一些实施方案中，某些宿主细胞来源的蛋白可以与eev制品共定位，但不与imv共定位，并且细胞来源的蛋白的量可以取决于宿主细胞系和病毒毒株。例如，研究已表明，与vv ihd-j毒株相比，wr eev含有更多的细胞来源的蛋白(参见van eijl h,hollinshead m,smith gl.the vaccinia virus a36r protein is a type lb membrane protein present on intracellular but not extracellular enveloped virus particles.virology 2000；271:26-36)。在一些情况下，宿主细胞来源的蛋白可以改变eev颗粒的生物学效应。例如，将宿主膜蛋白cd55掺入由在a34r蛋白中包含至少两个非天然存在的突变的wr痘苗病毒毒株释放的eev颗粒表面，可以使它们对补体毒性有抗性。
79.对于痘苗病毒的western reserve(wr)毒株，正常约有1％的病毒颗粒是eev并在产生细胞溶瘤前被释放到培养物上清液中。一些研究已表明，从痘苗的ihd-j毒株释放的eev颗粒可以多50倍(参见blasco r,sisler jr,moss b.dissociation of progeny vaccinia virus from the cell membrane is regulated by a viral envelope glycoprotein:effect of a point mutation in the lectin homology domain of the a34r gene.j virol 1993；67:3319-25；还参见mcintosh aa,smith gl.vaccinia virus glycoprotein a34r is required for infectivity of extracellular enveloped virus.j virol 1996；70:272-81)。
80.在一些实例中，与其他方面相同但不包含含有至少两个非天然存在的突变(例如，
k151e和k119e)的a34r蛋白的痘病毒毒株相比，本公开内容的经修饰的痘病毒(例如，痘苗病毒)毒株可以释放约10倍至约200倍更高水平的eev颗粒。
81.在一些实施方案中，与其他方面相同但不包含含有至少两个非天然存在的突变(例如，k151e和k119e)的a34r蛋白的痘病毒毒株相比，本公开内容的经修饰的痘病毒毒株可释放约10倍至约15倍、约15倍至约20倍、约20倍至约25倍、约25倍至约30倍、约30倍至约35倍、约35倍至约40倍、约40倍至约45倍、约45倍至约50倍、约50倍至约55倍、约55倍至约60倍、约60倍至约65倍、约65倍至约70倍、约75倍至约80倍、约85倍至约90倍、约95倍至约100倍、约100倍至约120倍、约120倍至约140倍、约140倍至约160倍、约160倍至约180倍、约180倍至约200倍更多的eev颗粒。
82.在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的痘苗病毒毒株可以是其中a34r蛋白包含突变k119e和k151e的wr毒株，并且与其他方面相同但不包含含有突变k119e和k151e的a34r蛋白的wr痘苗病毒毒株相比，可以释放约10倍至约15倍、约15倍至约20倍、约20倍至约25倍、约25倍至约30倍、约30倍至约35倍、约35倍至约40倍、约40倍至约45倍、约45倍至约50倍、约50倍至约55倍、约55倍至约60倍、约60倍至约65倍、约65倍至约70倍、约75倍至约80倍、约85倍至约90倍、约95倍至约100倍、约100倍至约120倍、约120倍至约140倍、约140倍至约160倍、约160倍至约180倍、约180倍至约200倍更多的eev颗粒。
83.在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的痘苗病毒毒株可以是其中a34r蛋白包含突变k119e和k151e(wo34)的wr毒株，，并且与wi痘苗病毒毒株相比，可以释放约10倍至约15倍、约15倍至约20倍、约20倍至约25倍、约25倍至约30倍、约30倍至约35倍、约35倍至约40倍、约40倍至约45倍、约45倍至约50倍、约50倍至约55倍、约55倍至约60倍、约60倍至约65倍、约65倍至约70倍、约75倍至约80倍、约85倍至约90倍、约95倍至约100倍、约100倍至约120倍、约120倍至约140倍、约140倍至约160倍、约160倍至约180倍、约180倍至约200倍更多的eev颗粒。
84.在一些情况下，本公开内容的经修饰的痘病毒释放的eev颗粒与imv颗粒相比的增加可以通过进行病毒噬斑测定来确定，其中与在a34r蛋白中不包含两个或更多个突变但其他方面相同的痘病毒相比，在a34r蛋白中包含两个或更多个非天然存在的突变的痘病毒中可以观察到更大数目的彗星尾形成。
85.在一些情况下，与imv颗粒相比eev颗粒释放的增加可以通过进行中和测定来确定，其中用本公开内容的经修饰的痘病毒(例如，痘苗病毒毒株)感染并暴露于中和抗体(诸如抗l1 nr-45114抗体或vig抗体)的细胞可在病毒噬斑测定中测试，并且病毒噬斑形成(例如，以pfu/ml计)可以与适当的对照病毒(例如，在a34r蛋白中不包含至少两个非天然存在的突变的痘苗病毒毒株)相比较。在一些情况下，抗l1可以中和和阻断imv感染。在一些情况下，vig抗体可以阻断vv感染。
86.在一些情况下，与imv颗粒相比eev颗粒释放的增加可以通过观察彗星尾形成的增加来确定。在一些情况下，观察彗星尾形成的增加可以包括对板上由铺板的已知量的病毒产生的彗星尾外观的菌落数目进行计数，并与铺板有另一等效量的病毒的板上的数目进行比较。在一些情况下，彗星形成的增加可以指示eev的量相对于病毒毒株的imv形式的增加。
87.在一些情况下，本公开内容的经修饰的痘病毒毒株可以包含病毒基因组中编码以下的区域中的一个或更多个另外的突变：磷脂酶、激酶、磷酸蛋白、聚合酶、膜蛋白、病毒体
核心蛋白、谷氧还蛋白、dna结合蛋白、rna结合蛋白、imv蛋白、蛋白酶、解旋酶、金属蛋白酶、病毒体结构蛋白、肉豆蔻基蛋白、磷酸酶、肝素结合蛋白、糖蛋白、atp酶、加帽酶、转录因子、前体蛋白、亚单位蛋白、dna解旋酶、棕榈酰基蛋白或受体。
88.在一些情况下，一个或更多个另外的突变可以在痘病毒基因中，诸如痘病毒的tk(胸苷激酶)、b8r、b18r、b15r、k7r、c6l、k4l、f8l、f9l、f10l、f17r、e1l、e4l、e6r、e8r、e10r、e11l、o2l、i1l、i2l、i3l、i5l、i7l、i8r、g1l、g3l、g4l、g5.5r、g7l、g9r、l1r、l3l、l4r、l5r、j1r、j4r、j6r、h1l、h2r、h3l、h4l、h5r、h6r、d1r、d2l、d3r、d6r、d7r、d8l、d11l、d12l、d13l、a2.5l、a3l、a4l、a5r、a6l、a7l、a9l、a10l、a13l、a14l、a15l、a16l、a17l、a18r、a21l、a24r、a25l、a26l、a27l、a28l、a29l、a30l、a31r、a34r、a42r、a45r、a46r、a52r基因。在一些实施方案中，本文还提供了经修饰的溶瘤痘病毒(例如，痘苗病毒)毒株，其可以包含增加病毒的eev形式的非天然存在的突变并还包含可以编码非病毒蛋白(诸如治疗蛋白或诊断蛋白)的外源核酸。由外源核酸编码的蛋白的非限制性实例可以包括soc3、ph-20、hmgb1、pias3、il15、il15-rα、light、itac、分形趋化因子、cxcr4、ccr2、ccl5、n1l、免疫检查点调节剂(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体)、gm-csf、il-12、il-2、ins、epo、env、f8、gcg、ifng、ighg1、f9、gh1、il-2、csf2、tnfrsf1b、alb、plau、ifnb1、csf3、ifna2、fshb、a型肉毒杆菌毒素、阿法西普(alefacept)、胰脂肪酶、抗凝血酶α、阿西莫单抗(arcitumomab)、抗恒河猴(rh)免疫球蛋白g、抗胸腺细胞球蛋白、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿昔单抗(abciximab)、阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、阿巴西普(abatacept)、培加酶(pegademase)、阿西肽(apcitide)、人类血清白蛋白、拉布立酶(rasburicase)、贝伐单抗(bevacizumab)、b型肉毒杆菌毒素、比伐卢定(bivalirudin)、绒毛膜促性腺激素α、培非格司亭(pegfilgrastim)、溶组织梭菌(clostridium histolyticum)胶原酶、非格司亭(filgrastim)、响尾蛇科(crotalidae)多价免疫fab、沙格司亭(sargramostim)、阿法链道酶(dornase alfa)、地尼白介素-白喉毒素连接物(denileukin diftitox)、地高辛免疫fab、阿法依伯汀(epoetin alfa)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、依库丽单抗(eculizumab)、恩夫韦肽(enfuvirtide)、艾塞那肽(exenatide)、依法利珠单抗(efalizumab)、帕利夫明(palifermin)、凝血因子ix、抗血友病因子、促甲状腺素α、促卵泡素β、重组人类凝血因子viia、吉妥单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、加硫酶(galsulfase)、培维索孟(pegvisomant)、伊米苷酶(imiglucerase)、生长激素(somatropin)、胰高血糖素、重组阿糖苷酶β(agalsidase beta)、阿糖脑苷酶(alglucerase)、透明质酸酶、组氨瑞林(histrelin)、丙型肝炎抗原、hiv抗原、乙型肝炎表面抗原、hpv疫苗、透明质酸酶、α-2b干扰素、γ-1b干扰素、胰岛素、拉罗尼酶(laronidase)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、胰岛素、英夫利昔单抗(infliximab)、β-1b干扰素、奥普瑞白介素(oprelvekin)、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、帕尼单抗(panitumumab)、人类免疫球蛋白、西妥昔单抗(cetuximab)、阿达木单抗(adalimumab)、培门冬酶(pegaspargase)、达利珠单抗(daclizumab)、天冬酰胺酶、alfacon-1干扰素、α-n3干扰素、促黄体素α、来匹卢定(lepirudin)、乳糖酶、莫罗单抗(muromonab)、美卡舍明(mecasermin)、那他珠单抗(natalizumab)、诺非妥莫单抗(nofetumomab)、奈西利肽(nesiritide)、奥曲肽(octreotide)、ospa脂蛋白、替奈普酶(tenecteplase)、普兰林肽(pramlintide)、木瓜蛋白酶、尿激酶、阿尼普酶(anistreplase)、屈曲可净α(drotrecogin alfa)、瑞替普酶(reteplase)、贝卡普勒明
(becaplermin)、帕利珠单抗(palivizumab)、阿替普酶(alteplase)、兰尼单抗(ranibizumab)、重组人类骨形态发生蛋白7(rhbmp7)、重组纯化蛋白衍生物(dppd)、链激酶、降钙素、舍莫瑞林(sermorelin)、促胰液素、α-1-蛋白酶抑制剂、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、法索单抗锝(technetium fanolesomab)、特立帕肽(teriparatide)、胰蛋白酶、依那西普(etanercept)及其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。
89.透明质酸(ha)是ecm的重要结构元素，是由重复的二糖单元组成的高分子量直链糖胺聚糖。它可以广泛分布在结缔组织、上皮组织和神经组织中，并且其表达水平可以在许多类型的肿瘤中显著升高。透明质酸酶是催化ha降解的酶家族。迄今为止在人类中鉴定出至少五种功能性透明质酸酶：hyal1、hyal2、hyal3、hyal4和hyal5(也称为ph-20或spam1)，其中ph-20是迄今为止已知的唯一在相对中性ph起作用的酶。在本公开内容的一些实施方案中，将透明质酸酶与其他肿瘤靶向治疗剂(诸如转基因，在本文中也称为外源核酸)组合可以至少通过减少ecm并增强治疗剂在肿瘤内和肿瘤之间的转运来促进经修饰的溶瘤病毒的治疗效果。
90.本文的一些实施方案公开了经修饰的溶瘤病毒，其可包含编码能够降解透明质酸的膜结合蛋白(诸如透明质酸酶)的外源核酸。应当注意，如本文所用的术语“透明质酸酶”可指催化肿瘤中ha的降解的任何酶或其片段，包括但不限于ph-20及其来自其他物种的同源物，以及其他具有类似酶功能的工程化/设计蛋白质。如本文所用的，透明质酸酶可指一类透明质酸降解酶。
91.在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含可以编码是嵌合蛋白的趋化因子受体的外源核酸。其细胞外结构域的至少一部分可以来自促进病毒的肿瘤靶向递送的趋化因子受体，并且其细胞内结构域的至少一部分可以来自促进肿瘤特异性复制、抑制免疫抑制活性或传递一些其他有益效果的趋化因子受体，或者反之亦然。例如，经修饰的溶瘤病毒可以包含编码具有ccr5的细胞内gtp酶结构域以及cxcr4或ccr2的细胞外趋化因子结合结构域的蛋白的核酸。在一些情况下，通过使具有不同功能的结构域组合，人们可以实现经修饰的溶瘤病毒的治疗性能的进一步改进。本公开内容的一种实施方案是，经修饰的溶瘤病毒可以包含可以编码至少一种趋化因子受体的外源核酸。在一些情况下，经修饰的溶瘤病毒可以包含可以编码两种或更多种不同的趋化因子受体的外源核酸，所述两种或更多种不同的趋化因子受体可以由病毒同时表达。可以由本文描述的经修饰的溶瘤病毒同时表达的示例性趋化因子受体包括cxcr4和ccr2。在表达多于一种趋化因子受体的经修饰的溶瘤病毒中，溶瘤病毒的治疗应用可以实现对肿瘤细胞的组合或协同效应。
92.在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含外源性表达cxcr4的核酸。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含外源性表达ccr2的核酸。某些实施方案公开了经修饰的溶瘤病毒，该经修饰的溶瘤痘病毒包含编码cxcr4和ccr2两者的外源核酸，并且两种趋化因子都从同一病毒表达。在某些情况下，通常在肿瘤微环境中表达的cxcl12和/或ccl2可吸引由经修饰的溶瘤病毒感染的表达cxcr4和/或ccr2的淋巴细胞或其他迁移细胞，从而增强经修饰的溶瘤病毒的肿瘤靶向递送。
93.在某些实施方案中，本文描述的经修饰的病毒可以包含一个或更多个外源核酸序列，可替代地称为转基因，其可以产生编码可以调节stat3活性，并因此也可以调节由stat3
调节的基因的活化的剂的mrna。因此，本文提供的某些实例提供了含有外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒，该外源核酸序列可以编码可以调节stat-3介导的基因活化的剂。如本文所用的短语“调节stat3介导的基因活化”可以指其中stat3活性被调节，并且作为结果，由stat3调节的一个或更多个基因的活化也被调节的过程。
94.在某些实施方案中，可以调节stat3介导的基因活化的剂可以是蛋白或其片段。在某些实施方案中，该蛋白或其片段可抑制、减少或最小化stat3活性和stat3介导的基因活化。抑制、减少和/或最小化stat3活性和stat3介导的基因活化的蛋白或其片段可以例如阻断stat3与stat3应答基因启动子区域中的dna结合序列的结合。在另外的实例中，抑制、减少或最小化stat3活性和stat3介导的基因活化的蛋白或其片段可以直接结合stat3蛋白，例如在sh2结构域处。在某些实施方案中，抑制、减少和/或最小化stat3活性的蛋白阻断、防止、减少和/或最小化stat3的磷酸化和/或使stat3去磷酸化。在某些非限制性实施方案中，调节stat3活性的蛋白可以包括磷酸酪氨酸磷酸酶(ptp)、活化的stat的蛋白抑制剂(pias，例如，pias3)和细胞因子信号传导抑制剂(socs)蛋白(例如，soc3)。
95.癌症靶标
96.在本公开内容的实施方案中，提供了通过递送如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒来治疗过度增生性疾病诸如癌症或肿瘤的方法。可以通过如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒来治疗的癌症可包括但不限于黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、腹膜癌、前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、上皮癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma)、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺上皮癌(prostate carcinoma)、肝细胞癌、胆管肉瘤、胰腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、肠型胃腺癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性赘生物和肉瘤。
97.可以通过本公开内容的方法治疗的癌细胞可以包括来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。另外，所述癌症可具体地属于以下组织学类型，但不限于这些组织学类型：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管上皮癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管上皮癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管腺泡状腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病(paget’s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；支持细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质
肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor)；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金症(hodgkin's)；副肉芽肿；恶性小淋巴细胞性淋巴瘤；恶性弥漫性大细胞淋巴瘤；恶性滤泡性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓样白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；以及多毛细胞白血病。在一些情况下，可以使用本公开内容的经修饰的溶瘤病毒，诸如有利于全身递送的经修饰的溶瘤痘病毒，来治疗转移性实体癌。在一些情况下，可以使用有利于全身递送的本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒，来治疗诸如对于瘤内递送治疗剂的目的不可接近或难以接近的实体癌。在一些实例中，可以使用有利于全身递送并且形成增加量的eev的本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒来治疗与游离脂肪酸表达增加相关的癌症。
98.本公开内容还设想了用于抑制或预防任何类型的原发性癌症的局部侵袭或转移或两者的方法。例如，原发性癌症可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在某些实施方案中，原发性癌症可以是肺癌。例如，肺癌可以是非小细胞肺癌。此外，本公开内容可用来预防癌症或治疗癌前病变或恶化前的细胞，包括化生、发育不良和增生。它还可用来抑制不希望但为良性的细胞，诸如鳞状化生、发育不良、良性前列腺增生细胞、增生性病变等。在一些实施方案中，可通过涉及本文讨论的经修饰的溶瘤痘病毒的本公开内容的方法来停止、破坏或延迟向癌症或更严重形式的癌症的进展。
99.此外，可以施用本文公开的经修饰的溶瘤痘病毒，以治疗在肿瘤微环境中具有游离脂肪酸的高生物利用度的肿瘤。在一些情况下，由肥胖患者的肿瘤中的脂肪细胞释放的游离脂肪酸可以供给(feed)肿瘤内经修饰的溶瘤痘病毒并增强其复制以及eev形式的病毒的形成。在非肥胖患者，尤其是患有腹膜癌的患者中，也可以实现这一优点。例如，若干种腹膜癌可以是使用本公开内容的经修饰的溶瘤病毒的疗法的靶标，因为这些癌倾向于在网膜壁中生长并且可以由脂肪细胞供给，并且如上所述，由肿瘤中的脂肪细胞释放的游离脂肪酸可以供给肿瘤内经修饰的溶瘤病毒并增强其复制。本文公开的经修饰的溶瘤痘病毒可以在具有游离脂肪酸的高生物利用度的肿瘤中形成滴度增加的细胞外包膜病毒(eev)。
100.在一些实施方案中，提供了通过施用被如本文公开的经修饰的痘病毒感染的细胞来治疗肿瘤的方法。可以向受试者施用(例如瘤内施用)感染的细胞，由此经修饰的痘病毒
在原位(诸如在肿瘤或肿瘤微环境中)产生含有高百分比eev颗粒(例如，至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更大)的病毒颗粒群体。然后，可以从受试者(诸如从受试者分离的生物样品)收获eev颗粒，并用于随后向受试者的全身递送(例如，静脉内递送)。在一些情况下，这可以增强经修饰的溶瘤病毒在受试者体内的全身播散，并改进治疗结果。
101.治疗方法以及功效和药代动力学测定
102.在一些实施方案中，本公开内容提供了通过施用如本文公开的经修饰的溶瘤痘病毒来治疗受试者的方法。
103.提供了在癌细胞中产生毒性作用的方法，该方法包括向癌细胞施用治疗有效量的如上所述的经修饰的溶瘤痘病毒或含有该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物。本公开内容还提供了抑制第二癌细胞的生长和增殖中的至少一种的方法，该方法包括向第一癌细胞施用如上所述的经修饰的溶瘤痘病毒，使得第一癌细胞被所述病毒感染。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，设想了并非每种癌细胞或肿瘤细胞都在施用治疗有效量的如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒或含有经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物后被感染，并且可以在没有直接感染的情况下抑制未感染细胞的生长。
104.在一些实例中，为了使用本公开内容的方法和组合物来诱导溶瘤、杀伤细胞、抑制生长、抑制转移、降低肿瘤大小以及以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，可以使癌细胞或肿瘤与治疗有效剂量的如本文描述的示例性经修饰的溶瘤痘病毒或含有该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物接触。在某些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒或其药物组合物的有效量可包括足以诱导癌细胞的溶瘤、破坏或裂解，或抑制或减少癌细胞的生长或尺寸的量。例如，癌细胞生长的减慢可以表现为细胞死亡，或包含该细胞的肿瘤的复制速率减慢或生长速率减少，或含有癌细胞的受试者的存活期延长。
105.在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症或肿瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如上所述的经修饰的病毒。这样的方法中的有效量可包括减慢癌症的生长速率或扩散，或延长受试者存活期的量。本公开内容提供了减慢肿瘤生长的方法，该方法可包括向肿瘤施用有效量的如上所述的经修饰的溶瘤痘病毒。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒或其药物组合物的有效量可包括足以诱导肿瘤生长或大小的减缓、抑制或减少的量，并且可包括根除肿瘤。例如，肿瘤生长的减慢可以表现为生长速率减少或含有肿瘤的受试者的存活期延长。
106.本公开内容还提供了确定如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒的感染性或抗肿瘤活性或肿瘤特异性病毒复制量的方法，该方法可包括：(i)向受试者施用单独或与另外的疗法组合的治疗有效量的根据本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒或药物组合物，其还表达萤光素酶报告基因；(ii)在施用该病毒后立即从受试者采集第一生物样品并确定第一生物样品中萤光素酶报告基因的水平；(iii)在步骤(ii)中施用后从受试者采集第二生物样品；并且(iv)检测第二生物样品中萤光素酶报告基因的水平，其中如果在步骤(iii)中萤光素酶的水平高于步骤(ii)，则确定该经修饰的溶瘤痘病毒具有感染性、显示出抗肿瘤活性、表现出肿瘤特异性病毒复制。在步骤(i)中施用后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11
天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月采集第二生物样品。在一些实施方案中，上述方法还可以包括在步骤(i)和(iii)中检测在向受试者施用治疗有效量的本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒，诸如如本文公开的经修饰的溶瘤痘病毒或包含该病毒的药物组合物后从所述受试者采集的血浆样品中一种或更多种测定细胞因子(例如，il-2、il-7、il-8、il-10、ifn-γ、gm-csf、tnf-α、il-6、il-4、il-5和il-13)的水平。在本公开内容的一些实施方案中，与其他方面相同但不包含经修饰的溶瘤痘病毒中的修饰的病毒相比，如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒在上述步骤(ii)和(iv)之间的萤光素酶生物发光的增加更高。用于在施用经修饰的溶瘤痘病毒后检测和监测病毒载量的其他示例性技术包括实时定量pcr。
107.还提供了在施用治疗有效量的根据本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒或含有该痘病毒的药物组合物后监测药代动力学的方法。用于监测药代动力学的示例性方法可包括以下步骤：(i)向受试者施用单独或与另外的疗法组合的治疗有效量的经修饰的溶瘤痘病毒或包含该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物；(ii)在步骤(i)中施用后选自约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟和约240分钟、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月的一个或更多个时间点从受试者采集生物样品，以及(iii)检测在上述时间点采集的生物样品中病毒基因组(或插入病毒基因组内的报告基因，诸如萤光素酶)的量。在一些情况下，在15分钟时间点采集的样品中病毒基因组拷贝/ml可以是最高的，并且进一步地，在240分钟时间点采集的样品可能不包含可检测量的病毒基因组。因此，在一些情况下，在施用后约15分钟可以观察到病毒峰值，并且大部分病毒可在约240分钟(或4小时)后从受试者的系统中清除。在一些情况下，在施用后约15分钟可以观察到第一病毒峰值，并且在随后的时间点(例如，在约30分钟、约45分钟、约60分钟或约90分钟)采集的生物样品中可以观察到第二病毒峰值。在示例性实施方案中，该生物样品可以是血液，并且可通过定量pcr或其他合适的技术来确定每ml中的病毒基因组的量。在一些实例中，在施用后约15分钟可以观察到第一病毒峰值，并且在施用本公开内容的经修饰的溶瘤病毒诸如如本文描述的溶瘤痘病毒后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月后可以观察到第二病毒峰值。
108.在一些情况下，可通过使用报告基因诸如萤光素酶基因来测量经修饰的溶瘤痘病毒的肿瘤选择性复制。在一些实施方案中，可将萤光素酶基因插入病毒的基因组中，并且可以用该病毒感染肿瘤细胞。可以测量感染的肿瘤细胞中的生物发光，以监测肿瘤选择性复制。一些实例显示，与其他方面相同但不包含经修饰的溶瘤病毒中的修饰的溶瘤痘病毒相比，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒中的萤光素酶报告分子生物发光增加。
109.经修饰的溶瘤病毒的递送
110.在一些实施方案中，向受试者施用的本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒的量可以在约103和10
12
个感染性病毒颗粒或噬斑形成单位(pfu)之间，或约105和10
10
个pfu之间，或约105和108个pfu之间，或约108和10
10
个pfu之间。在一些实施方案中，向受试者施用的本公
开内容的经修饰的溶瘤痘病毒的量可以在约103和10
12
个病毒颗粒或噬斑形成单位(pfu)之间，或约105和10
10
pfu之间，或约105和108pfu之间，或约108和10
10
pfu之间。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用：该剂量可以包括约103pfu/剂至约104pfu/剂、约104pfu/剂至约105pfu/剂、约105pfu/剂至约106pfu/剂、约107pfu/剂至约108pfu/剂、约109pfu/剂至约10
10
pfu/剂、约10
10
pfu/剂至约10
11
pfu/剂、约10
11
pfu/剂至约10
12
pfu/剂、约10
12
pfu/剂至约10
13
pfu/剂、约10
13
pfu/剂至约10
14
pfu/剂或约10
14
pfu/剂至约10
15
pfu/剂。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括约2x103pfu/剂、3x103pfu/剂、4x103pfu/剂、5x103pfu/剂、6x103pfu/剂、7x103pfu/剂、8x103pfu/剂、9x103pfu/剂、约104pfu/剂、约2x104pfu/剂、约3x104pfu/剂、约4x104pfu/剂、约5x104pfu/剂、约6x104pfu/剂、约7x104pfu/剂、约8x104pfu/剂、约9x104pfu/剂、约105pfu/剂、2x105pfu/剂、3x105pfu/剂、4x105pfu/剂、5x105pfu/剂、6x105pfu/剂、7x105pfu/剂、8x105pfu/剂、9x105pfu/剂、约106pfu/剂、约2x106pfu/剂、约3x106pfu/剂、约4x106pfu/剂、约5x106pfu/剂、约6x106pfu/剂、约7x106pfu/剂、约8x106pfu/剂、约9x106pfu/剂、约107pfu/剂、约2x107pfu/剂、约3x107pfu/剂、约4x107pfu/剂、约5x107pfu/剂、约6x107pfu/剂、约7x107pfu/剂、约8x107pfu/剂、约9x107pfu/剂、约108pfu/剂、约2x108pfu/剂、约3x108pfu/剂、约4x108pfu/剂、约5x108pfu/剂、约6x108pfu/剂、约7x108pfu/剂、约8x108pfu/剂、约9x108pfu/剂、约109pfu/剂、约2x109pfu/剂、约3x109pfu/剂、约4x109pfu/剂、约5x109pfu/剂、约6x109pfu/剂、约7x109pfu/剂、约8x109pfu/剂、约9x109pfu/剂、约10
10
pfu/剂、约2x10
10
pfu/剂、约3x10
10
pfu/剂、约4x10
10
pfu/剂、约5x10
10
pfu/剂、约6x10
10
pfu/剂、约7x10
10
pfu/剂、约8x10
10
pfu/剂、约9x10
10
pfu/剂、约10
10
pfu/剂、约2x10
10
pfu/剂、约3x10
10
pfu/剂、约4x10
10
pfu/剂、约5x10
10
pfu/剂、约6x10
10
pfu/剂、约7x10
10
pfu/剂、约8x10
10
pfu/剂、约9x10
10
pfu/剂、约10
11
pfu/剂、约2x10
11
pfu/剂、约3x10
11
pfu/剂、约4x10
11
pfu/剂、约5x10
11
pfu/剂、约6x10
11
pfu/剂、约7x10
11
pfu/剂、约8x10
11
pfu/剂、约9x10
11
pfu/剂或约10
12
pfu/剂、约10
12
pfu/剂至约10
13
pfu/剂、约10
13
pfu/剂至约10
14
pfu/剂或约10
14
pfu/剂至约10
15
pfu/剂。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括5x109pfu/剂。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括最多5x109pfu/剂。
111.在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括约103个病毒颗粒/剂至约104个病毒颗粒/剂、约104个病毒颗粒/剂至约105个病毒颗粒/剂、约105个病毒颗粒/剂至约106个病毒颗粒/剂、约107个病毒颗粒/剂至约108个病毒颗粒/剂、约109个病毒颗粒/剂至约10
10
个病毒颗粒/剂、约10
10
个病毒颗粒/剂至约10
11
个病毒颗粒/剂、约10
11
个病毒颗粒/剂至约10
12
个病毒颗粒/剂、约10
12
个病毒颗粒/剂至约10
13
个病毒颗粒/剂、约10
13
个病毒颗粒/剂至约10
14
个病毒颗粒/剂，或10
14
个病毒颗粒/剂至约10
15
个病毒颗粒/剂。
112.在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括约103pfu/kg至约104pfu/kg、约104pfu/kg至约105pfu/kg、约105pfu/kg至约106pfu/kg、约107pfu/kg至约108pfu/kg、约109pfu/kg至约10
10
pfu/kg、约10
10
pfu/kg至约10
11
pfu/kg、约10
11
pfu/kg至约10
12
pfu/kg、约10
12
pfu/kg至约10
13
pfu/kg、约10
13
pfu/kg至约
10
14
pfu/kg或约10
14
pfu/kg至约10
15
pfu/kg。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括约2x103pfu/kg、3x103pfu/kg、4x103pfu/kg、5x103pfu/kg、6x103pfu/kg、7x103pfu/kg、8x103pfu/kg、9x103pfu/kg、约104pfu/kg、约2x104pfu/kg、约3x104pfu/kg、约4x104pfu/kg、约5x104pfu/kg、约6x104pfu/kg、约7x104pfu/kg、约8x104pfu/kg、约9x104pfu/kg、约105pfu/kg、2x105pfu/kg、3x105pfu/kg、4x105pfu/kg、5x105pfu/kg、6x105pfu/kg、7x105pfu/kg、8x105pfu/kg、9x105pfu/kg、约106pfu/kg、约2x106pfu/kg、约3x106pfu/kg、约4x106pfu/kg、约5x106pfu/kg、约6x106pfu/kg、约7x106pfu/kg、约8x106pfu/kg、约9x106pfu/kg、约107pfu/kg、约2x107pfu/kg、约3x107pfu/kg、约4x107pfu/kg、约5x107pfu/kg、约6x107pfu/kg、约7x107pfu/kg、约8x107pfu/kg、约9x107pfu/kg、约108pfu/kg、约2x108pfu/kg、约3x108pfu/kg、约4x108pfu/kg、约5x108pfu/kg、约6x108pfu/kg、约7x108pfu/kg、约8x108pfu/kg、约9x108pfu/kg、约109pfu/kg、约2x109pfu/kg、约3x109pfu/kg、约4x109pfu/kg、约5x109pfu/kg、约6x109pfu/kg、约7x109pfu/kg、约8x109pfu/kg、约9x109pfu/kg、约10
10
pfu/kg、约2x10
10
pfu/kg、约3x10
10
pfu/kg、约4x10
10
pfu/kg、约5x10
10
pfu/kg、约6x10
10
pfu/kg、约7x10
10
pfu/kg、约8x10
10
pfu/kg、约9x10
10
pfu/kg、约10
10
pfu/kg、约2x10
10
pfu/kg、约3x10
10
pfu/kg、约4x10
10
pfu/kg、约5x10
10
pfu/kg、约6x10
10
pfu/kg、约7x10
10
pfu/kg、约8x10
10
pfu/kg、约9x10
10
pfu/kg、约10
11
pfu/kg、约2x10
11
pfu/kg、约3x10
11
pfu/kg、约4x10
11
pfu/kg、约5x10
11
pfu/kg、约6x10
11
pfu/kg、约7x10
11
pfu/kg、约8x10
11
pfu/kg、约9x10
11
pfu/kg或约10
12
pfu/kg、约10
12
pfu/kg至约10
13
pfu/kg、约10
13
pfu/kg至约10
14
pfu/kg或约10
14
pfu/kg至约10
15
pfu/kg。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括5x109pfu/kg。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括最多5x109pfu/kg。
113.在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括约103个病毒颗粒/kg至约104个病毒颗粒/kg、约104个病毒颗粒/kg至约105个病毒颗粒/kg、约105个病毒颗粒/kg至约106个病毒颗粒/kg、约107个病毒颗粒/kg至约108个病毒颗粒/kg、约109个病毒颗粒/kg至约10
10
个病毒颗粒/kg、约10
10
个病毒颗粒/kg至约10
11
个病毒颗粒/kg、约10
11
个病毒颗粒/kg至约10
12
个病毒颗粒/kg、约10
12
个病毒颗粒/kg至约10
13
个病毒颗粒/kg、约10
13
个病毒颗粒/kg至约10
14
个病毒颗粒/kg或约10
14
个病毒颗粒/kg至约10
15
个病毒颗粒/kg。
114.在某些实施方案中，如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒的液体剂型可以包括约103pfu/ml至约104pfu/ml、约104pfu/ml至约105pfu/ml、约105pfu/ml至约106pfu/ml、约107pfu/ml至约108pfu/ml、约109pfu/ml至约10
10
pfu/ml、约10
10
pfu/ml至约10
11
pfu/ml、约10
11
pfu/ml至约10
12
pfu/ml、约10
12
pfu/ml至约10
13
pfu/ml、约10
13
pfu/ml至约10
14
pfu/ml或约10
14
pfu/ml至约10
15
pfu/ml的病毒剂量。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括约2x103pfu/ml、3x103pfu/ml、4x103pfu/ml、5x103pfu/ml、6x103pfu/ml、7x103pfu/ml、8x103pfu/ml、9x103pfu/ml、约104pfu/ml、约2x104pfu/ml、约3x104pfu/ml、约4x104pfu/ml、约5x104pfu/ml、约6x104pfu/ml、约7x104pfu/ml、约8x104pfu/ml、约9x104pfu/ml、约105pfu/ml、2x105pfu/ml、3x105pfu/ml、4x105pfu/ml、5x105pfu/ml、6x105pfu/ml、7x105pfu/ml、8x105pfu/ml、9x105pfu/ml、约106pfu/ml、约
2x106pfu/ml、约3x106pfu/ml、约4x106pfu/ml、约5x106pfu/ml、约6x106pfu/ml、约7x106pfu/ml、约8x106pfu/ml、约9x106pfu/ml、约107pfu/ml、约2x107pfu/ml、约3x107pfu/ml、约4x107pfu/ml、约5x107pfu/ml、约6x107pfu/ml、约7x107pfu/ml、约8x107pfu/ml、约9x107pfu/ml、约108pfu/ml、约2x108pfu/ml、约3x108pfu/ml、约4x108pfu/ml、约5x108pfu/ml、约6x108pfu/ml、约7x108pfu/ml、约8x108pfu/ml、约9x108pfu/ml、约109pfu/ml、约2x109pfu/ml、约3x109pfu/ml、约4x109pfu/ml、约5x109pfu/ml、约6x109pfu/ml、约7x109pfu/ml、约8x109pfu/ml、约9x109pfu/ml、约10
10
pfu/ml、约2x10
10
pfu/ml、约3x10
10
pfu/ml、约4x10
10
pfu/ml、约5x10
10
pfu/ml、约6x10
10
pfu/ml、约7x10
10
pfu/ml、约8x10
10
pfu/ml、约9x10
10
pfu/ml、约10
10
pfu/ml、约2x10
10
pfu/ml、约3x10
10
pfu/ml、约4x10
10
pfu/ml、约5x10
10
pfu/ml、约6x10
10
pfu/ml、约7x10
10
pfu/ml、约8x10
10
pfu/ml、约9x10
10
pfu/ml、约10
11
pfu/ml、约2x10
11
pfu/ml、约3x10
11
pfu/ml、约4x10
11
pfu/ml、约5x10
11
pfu/ml、约6x10
11
pfu/ml、约7x10
11
pfu/ml、约8x10
11
pfu/ml、约9x10
11
pfu/ml或约10
12
pfu/ml、约10
12
pfu/ml至约10
13
pfu/ml、约10
13
pfu/ml至约10
14
pfu/ml或约10
14
pfu/ml至约10
15
pfu/ml。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括5x109pfu/ml。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以包括最多5x109pfu/ml。
115.在一些情况下，在通过注射施用经修饰的溶瘤痘病毒时，剂量可以包括每次注射约103个病毒颗粒、每次注射104个病毒颗粒、每次注射105个病毒颗粒、每次注射106个病毒颗粒、每次注射107个病毒颗粒、每次注射108个病毒颗粒、每次注射109个病毒颗粒、每次注射10
10
个病毒颗粒、每次注射10
11
个病毒颗粒、每次注射10
12
个病毒颗粒、每次注射2x10
12
个病毒颗粒、每次注射10
13
个病毒颗粒、每次注射10
14
个病毒颗粒或每次注射10
15
个病毒颗粒。在另外的情况下，在通过注射施用经修饰的溶瘤痘病毒时，剂量可以包括每次注射约103个感染性病毒颗粒、每次注射104个感染性病毒颗粒、每次注射105个感染性病毒颗粒、每次注射106个感染性病毒颗粒、每次注射107个感染性病毒颗粒、每次注射108个感染性病毒颗粒、每次注射109个感染性病毒颗粒、每次注射10
10
个感染性病毒颗粒、每次注射10
11
个感染性病毒颗粒、每次注射10
12
个感染性病毒颗粒、每次注射2x10
12
个感染性病毒颗粒、每次注射10
13
个感染性病毒颗粒、每次注射10
14
个感染性病毒颗粒或每次注射10
15
个感染性病毒颗粒。在另外的实施方案中，本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒可以以这样的剂量施用，该剂量可以是约103组织培养抑制剂剂量50％(tcid
50
)/kg、3x104tcid
50
/kg、4x104tcid
50
/kg、5x104tcid
50
/kg、3x105tcid
50
/kg、4x105tcid
50
/kg、5x105tcid
50
/kg、3x106tcid
50
/kg、4x106tcid
50
/kg、5x106tcid
50
/kg、3x107tcid
50
/kg、4x107tcid
50
/kg、5x107tcid
50
/kg、3x108tcid
50
/kg、4x108tcid
50
/kg、5x108tcid
50
/kg、3x109tcid
50
/kg、4x109tcid
50
/kg、5x109tcid
50
/kg、3x10
10
tcid
50
/kg、4x10
10
tcid
50
/kg或5x10
10
tcid
50
/kg。注意，本文中10
x
可替代地被表示为1ex。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒可以以一个或更多个剂量施用。在某些实施方案中，该病毒可以以足以诱导肿瘤中至少约20％的细胞、肿瘤中至少约30％的细胞、肿瘤中至少约40％的细胞、肿瘤中至少约50％的细胞、肿瘤中至少约60％的细胞、肿瘤中至少约70％的细胞、肿瘤中至少约80％的细胞或肿瘤中至少约90％的细胞发生溶瘤的量施用。在某些实施方案中，单剂量的病毒可指在1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时或24小时的时间段内向受试者或肿瘤施用的量。在某些实施方案中，剂量可以随
时间或通过单独的注射来扩展。在某些实施方案中，可以向受试者施用多于一个剂量(例如，2个、3个、4个、5个、6个或更多个剂量)的痘病毒，例如，其中第二治疗可以在第一治疗后的1、2、3、4、5、6、7天或周内进行。在某些实施方案中，可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或周的时间段内向受试者施用多于一个剂量的经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，如本文描述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时间段内施用。在某些情况下，如本文描述的溶瘤痘病毒或药物组合物的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在本文公开的方法的一些实施方案中，溶瘤痘病毒或药物组合物可以独立地以用于第一时间段的初始剂量、以用于第二时间段的中间剂量和以用于第三时间段的高剂量施用。在一些实施方案中，初始剂量可以低于中间剂量，并且中间剂量可以低于高剂量。在一些实施方案中，第一时间段、第二时间段和第三时间段可以独立地为约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长。
116.在一些实例中，根据本文描述的任何治疗方法，可以在施用如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒或包含该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物之前、同时和之后使受试者进食碳水化合物减少的饮食，例如，生酮饮食。在某些实施方案中，使受试者进食这样的饮食，该饮食可以包括食用每天少于500克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于400克的碳水化合物、每天少于350克的碳水化合物、每天少于300克的碳水化合物、每天少于250克的碳水化合物、每天少于200克的碳水化合物、每天少于150克的碳水化合物、每天少于100克的碳水化合物、每天少于90克的碳水化合物、每天少于80克的碳水化合物、每天少于70克的碳水化合物、每天少于60克的碳水化合物、每天少于50克的碳水化合物、每天少于40克的碳水化合物、每天少于30克的碳水化合物、每天少于20克的碳水化合物，每天少于10克的碳水化合物。
117.用于将本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒或包含该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物递送至癌细胞或肿瘤细胞的示例性方法可以是经由瘤内注射。然而，也可以使用替代的施用方法，例如，静脉内、经由输注、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、透皮、直肠、尿道内、阴道内、鼻内、鞘内或腹膜内。施用途径可随肿瘤的位置和性质而不同。在某些实施方案中，施用途径可以是牙内、透皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、局部(例如，在肿瘤附近，特别是肿瘤的血管或邻近血管)、经皮(percutaneous)、鞘内、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、通过灌洗或口服。可注射剂量的经修饰的溶瘤痘病毒可以作为团注或作为缓慢输注施用。在某些实施方案中，可以从植入患者中的源向患者施用经修饰的溶瘤痘病毒。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤痘病毒的施用可以通过在选定时间段内连续输注来进行。在一些情况下，如本文描述的溶瘤痘病毒或含有该溶瘤痘病毒的药物组合物可以通过在约15分钟、约30分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约100分钟或约120分钟或更长的时间段内输注而以治疗有效剂量施用。本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒或药物组合物可以以液体剂量施用，其中施用的总体积为约1ml至约
5ml、约5ml至10ml、约15ml至约20ml、约25ml至约30ml、约30ml至约50ml、约50ml至约100ml、约100ml至150ml、约150ml至约200ml、约200ml至约250ml、约250ml至约300ml、约300ml至约350ml、约350ml至约400ml、约400ml至约450ml、约450ml至500ml、约500ml至750ml或约750ml至1000ml。
118.药物组合物
119.含有如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物可以制备成在甘油、液体聚乙二醇以及其任何组合中，在油中，在固体剂型中的溶液、分散体；制备成可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、多聚剂型或其任何组合。在一些实施方案中，如本文描述的药物组合物可包含稳定剂和缓冲液。在一些实施方案中，如本文描述的药物组合物可包含增溶剂，诸如无菌水、tris缓冲液。在一些实施方案中，如本文描述的药物组合物可包含赋形剂。赋形剂可以是handbook of pharmaceutical excipients,american pharmaceutical association(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例可包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
120.在一些实施方案中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例可包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或其组合可以在药物制剂中使用。
121.在一些实施方案中，赋形剂可包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例可包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。抗氧化剂还可以包括但不限于edta、柠檬酸、抗坏血酸、丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene)(bht)、丁基羟基茴香醚(butylated hydroxy anisole)(bha)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和n-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂可包括井冈霉素a(validamycin a)、tl-3、原钒酸钠、氟化钠、n-a-甲苯磺酰-苯丙氨酸-氯甲基酮(n-a-tosyl-phe-chloromethylketone)、n-a-甲苯磺酰-赖氨酸-氯甲基酮(n-a-tosyl-lys-chloromethylketone)、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、二异丙基氟磷酸、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、颗粒酶抑制剂、细胞黏附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
122.在一些实施方案中，如本文描述的药物组合物可包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例可以包括淀粉、预糊化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮(polyvinyloxazolidone)、聚乙烯醇、c
12-c
18
脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖及其组合。药物制剂中可以使用的粘合剂可以选自淀粉，诸如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，诸如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，诸如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(peg)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇，诸如山
二乙酸；1,6-六亚甲基二胺-n,n,n’,n
’‑
四乙酸；n-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-n,n,n’,n
’‑
四乙酸；次氨基三乙酸；次氨基三丙酸；次氨基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂二环[11,11,11]三十五烷六氢溴化物；或三亚乙基四胺-n,n,n’,n”,n
”’
,n
”’‑
六乙酸。
[0129]
还设想了包含本文公开的一种或更多种经修饰的溶瘤病毒和一种或更多种其他抗微生物剂或抗真菌剂的组合产品，所述抗微生物剂或抗真菌剂例如多烯类诸如两性霉素b、两性霉素b脂质复合物(abcd)、脂质体两性霉素b(l-amb)和脂质体制霉菌素，唑类和三唑类诸如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑(posaconazole)等；葡聚糖合酶抑制剂诸如卡泊芬净、米卡芬净(fk463)和v-棘白菌素(ly303366)；灰黄霉素；烯丙胺类，诸如特比萘芬；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文描述的那些。此外，设想了可将肽与表面抗真菌剂组合，诸如与环吡酮胺、卤苯炔醚(haloprogin)、托萘酯、十一碳烯酸盐(undecylenate)、表面制霉菌素、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬和其他表面剂(topical agents)组合。在一些情况下，药物组合物可包含另外的剂。在一些情况下，另外的剂可以以治疗有效量存在于药物组合物中。
[0130]
在普通的储存和使用条件下，如本文描述的药物组合物可包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文描述的药物组合物可不包含防腐剂。适于注射使用的药物形式可包括无菌的水性溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物可以包含载体，该载体是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，和/或植物油，或其任何组合的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散剂的情况下通过维持要求的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。防止微生物作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来产生，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可以通过使用延迟吸收的剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)的组合物来产生。
[0131]
例如，对于以水性溶液的肠胃外施用，如果需要，液体剂型可以被合适地缓冲，并且使液体稀释剂与足够的盐水或葡萄糖等渗。液体剂型特别适于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在1ml至20ml的等渗nacl溶液中，并且添加到100ml至1000ml的液体(例如，碳酸氢钠缓冲盐水)中，或注射到建议的输注部位。
[0132]
在某些实施方案中，可注射无菌溶液可以通过将如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒或包含该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物以所需的量掺入适当的溶剂(该溶剂按需要具有上文列举的各种其他成分)中，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文枚举的那些所需其他成分。本文公开的组合物可以以中性或盐的形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基基团形成的酸加成盐)，并且其是用无机酸诸如例如盐酸或磷酸，或用有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐。与游离羧基基团形成的盐还可以来源于无机碱，诸如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物；和有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制后，药物组合物可以以与剂量制剂相容的方式且以诸如治疗有效的量进行施用。
[0133]
在某些实施方案中，本公开内容的药物组合物可以包含有效量的本文公开的经修饰的溶瘤痘病毒，与药学上可接受的载体组合。本文所用的“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性和/或对其所施用的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例可以包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，诸如油/水乳液，各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的载体的另外的非限制性实例可以包括凝胶、生物可吸收的基质材料、包含经修饰的溶瘤病毒的植入元件或任何其他合适的媒介物、递送或分散工具或材料。这样的载体可以通过常规方法配制，并可以以有效量向受试者施用。
[0134]
产生方法
[0135]
可以通过本领域技术人员已知的方法来产生本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可以在合适的宿主细胞(例如，hela细胞、293细胞或vero细胞)中繁殖，从宿主细胞分离并储存在促进病毒稳定性和完整性的条件下，使得随时间的感染性损失最小化。在一些情况下，产生高百分比eev颗粒的经修饰的溶瘤病毒可以作为溶瘤病毒制造过程中的改进的接种物起作用。在某些示例性方法中，使用细胞堆叠器(cell stack)、滚瓶或灌注生物反应器在宿主细胞中繁殖经修饰的溶瘤痘病毒。在一些实例中，用于纯化经修饰的溶瘤病毒的下游方法可包括过滤(例如，深层过滤、切向流过滤或其组合)、超速离心或色谱捕获。例如，可以通过冷冻或干燥，如通过冻干，来储存经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，在施用之前，储存的经修饰的溶瘤痘病毒可以被重构(如果是干燥储存)，并且在药学上可接受的载体中稀释以进行施用。
[0136]
一些实施方案提供了，与其他方面相同但不包含经修饰的溶瘤病毒中的修饰的病毒相比，如本文描述的经修饰的溶瘤痘病毒在hela细胞和293细胞中表现出更高的滴度。在某些情况下，在经修饰的溶瘤痘病毒中观察到在hela细胞和293细胞中的较高滴度。
[0137]
组合疗法
[0138]
在某些实施方案中，本公开内容的方法包括在一种或更多种另外的疗法之前、之后或与其组合地施用如本文公开的经修饰的溶瘤痘病毒或含有该经修饰的溶瘤痘病毒的药物组合物。所述另外的疗法的实例可包括但不限于化学疗法、放射疗法、采用另外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、抗癌剂或其任何组合。相对于经修饰的痘病毒如溶瘤痘苗病毒的施用，所述另外的疗法可以同时或相继地施用。在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括在一种或更多种抗癌剂或癌症疗法之前、之后或与其组合地施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒。抗癌剂可包括但不限于化疗剂、放疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法可包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括在本公开内容的经修饰的溶瘤病毒之前、之后或与其组合地施用本文公开的经修饰的病毒。经修饰的溶瘤痘病毒诸如经修饰的痘苗病毒与化学疗法的组合实现了协同效应，该协同效应在不包含所述经修饰的溶瘤病毒中的修饰的经修饰的溶瘤病毒中未观察到。上述组合的协同效应可有利地用来降低化学疗法如的剂量。因此，本文公开的使用经修饰的病毒的治疗方法可以减少与化学疗法相关的毒性，例如，对化学疗法响应但在治疗剂量发生副作用的患者。在某些情况下，与单独的化学疗法或单独的溶瘤痘苗病毒相比，协同效应可导致肿瘤生长降低。肿瘤生长的示例性降低可以是约2％至约50％，如约5％、约
10％、约20％、约25％、约35％、约45％或约50％。
[0139]
在某些实施方案中，使用经修饰的溶瘤痘病毒诸如痘苗病毒的治疗可单独使用或与一种或更多种免疫调节剂组合使用。免疫调节剂可包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。在某些实施方案中，免疫调节剂可以能够抑制对经修饰的病毒的先天免疫或适应性免疫。免疫调节剂的非限制性实例包括抗cd33抗体或其可变区(本文中也称为其抗原结合片段)；抗cd11b抗体或其可变区(本文中也称为其抗原结合片段)；cox2抑制剂，例如，塞来昔布(celecoxib)；细胞因子诸如il-12、gm-csf、il-2、ifn3和ifnγ；以及趋化因子诸如mip-1、mcp-1和il-8。在某些实施方案中，免疫调节剂可包括免疫检查点调节剂，例如但不限于抗ctla4、抗pd-1和抗pd-l1和tlr激动剂(例如，聚i:c)。在一些实例中，免疫调节剂可包括免疫检查点抑制剂，如pd-1的拮抗剂(例如，与pd-1结合的拮抗剂抗体)、pd-l1的拮抗剂(例如，与pd-l1结合的拮抗剂抗体)、ctla-4的拮抗剂(例如，与ctla-4结合的拮抗剂抗体)、a2ar的拮抗剂(例如，与a2ar结合的拮抗剂抗体)、b7-h3的拮抗剂(例如，与b7-h3结合的拮抗剂抗体)、b7-h4的拮抗剂(例如，与b7-h4结合的拮抗剂抗体)、btla的拮抗剂(例如，与btla结合的拮抗剂抗体)、ido的拮抗剂(例如，与ido结合的拮抗剂抗体)、kir的拮抗剂(例如，与kir结合的拮抗剂抗体)、lag3的拮抗剂(例如，与lag3结合的拮抗剂抗体)、tim-3的拮抗剂(例如，与tim3结合的拮抗剂抗体)。在一些实施方案中，所述另外的疗法可包括施用免疫检查点调节剂。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是tgn1412。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是nktr-214。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是medi0562。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是medi6469。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是medi6383。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是jtx-2011。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是keytruda(派姆单抗(pembrolizumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是opdivo(纳武单抗(nivolumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是yervoy(伊匹单抗(ipilimumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是替西木单抗(tremelimumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是tecentriq(阿特珠单抗(atezolizumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是mga271。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是吲哚莫德(indoximod)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是艾卡哚司他(epacadostat)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是利瑞鲁单抗(lirilumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是bms-986016。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是mpdl3280a。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是阿维鲁单抗(avelumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是德瓦鲁单抗(durvalumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是medi4736。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是medi4737。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是trx518。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是mk-4166。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是乌瑞芦单抗(urelumab)(bms-663513)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是pf-05082566(pf-2566)。
[0140]
在某些实例中，在所述另外的疗法是放射的情况下，示例性的剂量可以是5,000rad(50gy)至100,000rad(1000gy)，或50,000rad(500gy)，或所述范围内的其他合适的剂量。可选地，放射剂量可以是约30至60gy、约40至约50gy、约40至48gy或约44gy，或所述范围内的其他合适的剂量，其中该剂量例如通过如上所述的剂量学研究来确定。如本文所用的“gy”可指等于100rad的放射的特定吸收剂量的单位。gy是“戈瑞(gray)”的缩写。
[0141]
在某些实例中，在所述另外的疗法是化学疗法的情况下，示例性化疗剂可以包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、肼和三嗪、亚硝基脲(nitrosureas)和金属盐)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷类、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类、色霉素类等)、抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂和其他抗赘生物剂(miscellaneous antineoplastics)(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂和类视黄醇)。示例性化疗剂可以包括但不限于阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博莱霉素白消安白消安注射液卡培他滨n4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素d，cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸阿霉素依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康l-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇phoenix(yttrium90/mx-dtpa)、喷司他丁、卡莫司汀的聚苯丙生20植入物柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨依鲁替尼(ibrutinib)、idelalisib和本妥昔单抗(brentuximab vedotin)。
[0142]
示例性烷化剂可以包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)(aminouracilmustard)(aminouracilmustard)(aminouraciluracil nitrogennitrogen)、氮芥(chlormethine)环磷酰胺(revimmune
tm
)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三亚乙基蜜胺三亚乙基硫
代磷酰胺、替莫唑胺塞替派白消安卡莫司汀洛莫司汀链脲佐菌素和达卡巴嗪另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(又名放线菌素-d，)；美法仑(又名l-pam、l-沙可来新(l-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(又名六甲三聚氰胺(hmm)，)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(又名ccnu，)；顺铂(又名cddp，和-aq)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(又名dtic、dic和咪唑甲酰胺，)；六甲蜜胺(又名六甲三聚氰胺(hmm)，)；异环磷酰胺泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼二氯甲基二乙胺(又名氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和盐酸甲氯乙胺(mechloroethamine hydrochloride)，)；链脲佐菌素塞替派(又名硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、tespa和tspa，)；环磷酰胺)；环磷酰胺和苯达莫司汀hcl
[0143]
示例性蒽环类可以包括但不限于，例如，阿霉素(和)；博莱霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素(daunomycin)和盐酸红比霉素，)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体，)；米托蒽醌(dhad，)；表阿霉素(ellence
tm
)；伊达比星(idamycin)；丝裂霉素c格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)和去乙酰基近灰霉素。
[0144]
示例性长春花生物碱可以包括但不限于酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱(vincaleukoblastine)和vlb，和)和长春瑞滨
[0145]
示例性蛋白酶体抑制剂可以包括但不限于硼替佐米卡非佐米(carfilzomib)(px-171-007、(s)-4-甲基-n-((s)-1-(((s)-4-甲基-1-((r)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-2-((s)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(npi-0052)；柠檬酸伊沙佐米(ixazomib citrate)(mln-9708)；delanzomib(cep-18770)；和o-甲基-n-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-l-丝氨酸-o-甲基-n-[(1s)-2-[(2r)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-l-丝氨酰胺(onx-0912)。
[0146]
如本文所用的，“与......组合”意指将经修饰的痘病毒，诸如如本文描述的溶瘤痘苗病毒或包含该溶瘤痘苗病毒的药物组合物，与另外的疗法如包含一种或更多种剂的另
外的疗法作为治疗方案或计划的一部分施用于受试者。在某些实施方案中，组合使用并不要求在施用前将经修饰的溶瘤病毒与一种或更多种剂物理合并，也不要求其在同一时间范围内施用。例如，非限制性地，经修饰的溶瘤病毒和一种或更多种剂可以同时施用于所治疗的受试者，或者可以同一时间施用或以任何顺序或在不同的时间点相继地施用。
[0147]
在多个实施方案中，所述另外的疗法可以以液体剂型、固体剂型、栓剂、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。在某些实施方案中，所述另外的疗法在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时期内施用。在某些情况下，所述另外的疗法的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在某些实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法可包括向该受试者施用有效量的本公开内容的经修饰的溶瘤痘病毒，例如经修饰的溶瘤痘苗病毒。在某些实施方案中，本公开内容的方法还可包括向受试者施用有效量的一种或更多种剂。例如，非限制性地，该剂可以是如上所述的抗癌剂、免疫调节剂或其任何组合。
[0148]
药盒
[0149]
在实施方案中，本公开内容提供了用于施用经修饰的溶瘤痘病毒诸如如本文描述的经修饰的溶瘤痘苗病毒的药盒。在某些实施方案中，本公开内容的药盒可包括经修饰的溶瘤痘病毒诸如经修饰的溶瘤痘苗病毒或包含如上所述的经修饰的溶瘤痘苗病毒的药物组合物。在某些实施方案中，本公开内容的药盒还可以包含一种或更多种组成部分，诸如使用说明书、装置和另外的试剂，以及用于执行以上公开的方法的组成部分，诸如管、容器和注射器。在某些实施方案中，本公开内容的药盒还可以包含一种或更多种剂，例如，抗癌剂、免疫调节剂或其任何组合中的至少一种，该剂可以与经修饰的病毒组合施用。
[0150]
在某些实施方案中，本公开内容的药盒可包含一个或更多个容纳本文公开的经修饰的病毒的容器。例如，非限制性地，本公开内容的药盒可包含一个或更多个容纳本公开内容的经修饰的溶瘤病毒的容器。
[0151]
在某些实施方案中，本公开内容的药盒可包含使用说明书、用于向受试者施用经修饰的溶瘤病毒的装置或用于向受试者施用另外的剂或化合物的装置。例如，非限制性地，说明书可包括对经修饰的溶瘤病毒和任选地药盒中包含的其他组成部分，以及施用方法的描述，该施用方法包括用于确定受试者的适当状态、适当剂量的方法以及用于施用经修饰的病毒的适当施用方法。说明还可以包括在治疗时间持续期间对受试者进行监测的指南。
[0152]
在某些实施方案中，本公开内容的药盒可包含用于向受试者施用经修饰的溶瘤病毒的装置。本领域已知用于施用药物和药物组合物的多种装置中的任一种可被包含在本文提供的药盒中。例如，非限制性地，这样的装置包括皮下注射针头、静脉注射针头、导管、无针头注射装置、吸入器和液体分配器如滴眼器。在某些实施方案中，将例如通过静脉内注射、瘤内注射、腹膜内注射来全身递送的经修饰的溶瘤病毒可被包含在具有皮下注射针头和注射器的药盒中。
实施例
[0153]
以下实施例进一步说明所描述的实施方案，而非限制本公开内容的范围。
[0154]
实施例1：含有wo34的经修饰的溶瘤痘苗病毒的制备和表征
[0155]
本研究鉴定并表征了痘苗病毒(wr毒株)中新颖的突变，该突变增加了eev颗粒从病毒的释放。eev颗粒能增强病毒的溶瘤潜能(例如，通过增加通过血流的递送和扩散)，并可为痘苗的其他治疗用途(例如，作为疫苗)提供益处。
[0156]
进行wr a34r基因的随机诱变，并且将因此产生的痘苗病毒毒株(在a34r基因中含有多种突变)针对eev颗粒产生进行筛选，以鉴定含有增强高水平eev产生/释放的突变的毒株。鉴定出在a34r中含有k151e突变以及另外的点突变(k119e)的毒株。观察到，在毒株含有a34r中的双重突变(k119e和k151e)(wo34)的情况下，存在eev颗粒产生水平的显著增加。进行的另外的研究表明，当在小鼠模型中在癌症治疗的情况下评估时，含有wo34(a34r双突变体k119e和k151e)的溶瘤毒株显示出增强的治疗效果。
[0157]
用于鉴定wo34的筛选方法
[0158]
使用pcr进行病毒基因vacwr157(本文中也称为a34r基因，其编码a34r蛋白)的随机诱变。使用taq聚合酶在存在核苷酸类似物8-氧代-dgtp和dptp的情况下扩增a34r开放阅读框(orf)。还通过pcr扩增紧邻vacwr157的5’和3’区域。还通过pcr将3’区域与gfp报告物(gfp在5’末端)组装。最后，利用片段之间的短互补区(其通过pcr引物添加)，通过pcr组装5
’‑
诱变的vacwr157和gfp-3’片段。简化的组装示意图在图1中描绘(未示出启动子和引物突出端)。
[0159]
将含有诱变的vacwr157和gfp的侧翼为痘苗病毒dna的5’和3’区域的完全组装的片段纯化，并用于转染143b人类骨肉瘤细胞。然后用痘苗病毒感染转染的细胞，以允许重组驱动产生诱变的vacwr157病毒文库。为了优先选择eev产生增强的突变体，将来自用病毒池感染的烧瓶中的培养基添加到未感染的烧瓶中。在几轮系列感染后分离出克隆噬斑，并通过sanger测序对eev产生增强的a34r中的突变进行表征。
[0160]
观察到所有分离的克隆共享两个错义突变：k119e和k151e，和在f129处的一个沉默突变(seq id no.2)。突变蛋白被命名为wo34(seq id no.2)，并且一个对应的克隆被命名为uid wo0064r.002。在该最初的克隆群组中的gfp报告物侧翼不是loxp位点，并且不能被去除。合成编码wo34的密码子乱序orf(codon-scrambled orf)，并用其克隆含有侧翼为loxp的gfp的转移载体(pwr157-ke.r)。从荧光噬斑筛选出编码wo34的新重组病毒，并且然后用其感染表达cre重组酶的细胞。cre处理后选择缺乏报告物的克隆。
[0161]
表1：a34r基因和蛋白序列
[0162][0163]
含有wo34的eev增强的痘苗病毒形成的病毒噬斑彗星尾
[0164]
将先前滴定的eev增强的痘苗病毒稀释，并置于6孔板中汇合的bs-c-40细胞上。孵育板，并将其保持不受干扰48小时，并且然后用结晶紫对细胞进行染色，以观察由异常eev产生引起的彗星尾形成的差异。结果在图2中示出。如在图2中观察到的，与wi毒株(在wr毒株中有a34r单突变)和wr毒株(未突变的a34r)相比，含有wo34的痘苗病毒毒株显示出增强的彗星尾形成。含有wo34的痘苗病毒毒株的彗星尾形成明显增加。
[0165]
含有wo34的eev增强的痘苗病毒的中和
[0166]
在使用痘苗病毒的不同毒株(含有wo34的痘苗病毒、wi毒株、ihd-j毒株和wr毒株)
的两个独立的实验中，将hela细胞在6孔板中生长至汇合，并用1moi(感染复数)的痘苗病毒毒株来感染。24小时后，取出1ml培养基，并以800g离心。然后取出约500μl的上清液，并用于病毒噬斑测定。在连续稀释过程中，用抗l1 nr-45114抗体或vig处理样品，然后在37℃孵育1小时。然后将稀释液添加到汇合的bs-c-40细胞的6孔板中用于噬斑测定。1.5小时后，用含3％cmc的cm10替换培养基。48小时后，用结晶紫对细胞进行染色，以对病毒噬斑进行计数，来确定hela细胞上清液中的病毒的滴度和中和抗体的阻断能力，如图3a-图3b中示出的(图3a示出用抗l1 nr-45114抗体处理后的病毒噬斑滴度，并且图3b示出用抗l1r抗体和vig抗体处理后的病毒噬斑滴度)。
[0167]
用含有wo34的eev增强的痘苗病毒感染后的细胞生存力
[0168]
在96孔板中，接种hct116或mc38细胞系，并允许其生长至90％汇合。然后用1moi的不同的痘苗病毒毒株(wr毒株、ihd-j毒株、wi毒株、含有wo34的毒株)感染细胞。以24小时间隔每天用来自promega的celltiter 96水性非放射性细胞增殖试剂盒测试细胞生存力。相对生存力通过以下计算：从所有孔去除空白值平均，计算未感染对照组的平均值，然后将各感染孔的相对值计算为(a490/未感染孔的平均值)。结果在图4中示出(上图-mc38细胞；下图-hct116细胞)。
[0169]
含有wo34的eev增强的痘苗病毒在癌细胞中的病毒复制测定
[0170]
在独立的实验中，将hct116或mc38细胞在12孔板上生长到90％的汇合度，在3天的复制测定中每天使用一个板。用1moi的不同的痘苗病毒毒株(wr毒株、ihd-j毒株、wi毒株、含有wo34的毒株)在同一天感染所有板。感染后每24h，在-80℃的冷冻器中冷冻1个板。将板冷冻并解冻2次来破坏细胞，并将裂解产物用于bs-c-40细胞上的病毒噬斑测定。每ml噬斑形成单位在图5中示出(上图为hct116细胞；下图为mc38细胞)。