具有免疫增强活性的包含寡核苷酸的复合体及其用途1.本技术是申请日为2014年9月19日，申请号为201480051586.2，发明名称为“具有免疫增强活性的包含寡核苷酸的复合体及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域：
：2.本发明涉及具有免疫刺激活性的包含寡核苷酸的复合体及其用途。更具体而言，本发明涉及包含具有免疫刺激活性的cpg寡脱氧核苷酸（odn）和β-葡聚糖的复合体及其药物用途。
背景技术：
：：3.cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）是包含免疫刺激cpg基序的短的（约20个碱基对）、单链的合成dna片段，是toll样受体9（tlr9）的有效激动剂，活化树突细胞（dc）和b细胞以产生i型干扰素（ifn）和炎性细胞因子（非专利文件1、2），并且作为对于th1型体液和细胞免疫应答（包括细胞毒性t淋巴细胞（ctl）应答）的佐剂（非专利文件3、4）。因此，cpgodn已假定为针对传染病、癌症、哮喘和花粉症的可能的免疫治疗剂（非专利文件2、5）。4.存在至少四种类型的cpgodn，其每一种具有不同的骨架、序列和免疫刺激特性（非专利文件6）。d（也称为a）型cpgodn通常包含具有磷酸二酯（po）骨架和硫代磷酸酯（ps）多g尾的一个回文cpg基序，其活化类浆细胞dc（pdc）以产生大量的ifn-α，但无法诱导pdc成熟和b细胞活化（非专利文件7、8）。其他三类odn由ps骨架组成。k（也称为b）型cpgodn含有非回文的多cpg基序，并且强烈活化b细胞以产生il-6和pdc以成熟，但几乎不产生ifn-α（非专利文件8、9）。近期，c和p型cpgodn已被开发；这些分别含有一个和两个回文cpg序列，其两个均可以如k型活化b细胞和如d型活化pdc，尽管相比于p型cpgodn，c型cpgodn诱导较弱的ifn-α产生（非专利文件10-12）。许多优秀的k型cpgodn描述于专利文件1中。5.d和p型cpgodn已显示形成高级结构hoogsteen碱基配对以分别形成称为g四联体(tetrad)的平行四倍结构和顺式和反式回文部分之间的沃森克里克碱基配对，其对于通过pdc的活跃的ifn-α产生是必需的（非专利文件12-14）。尽管此类更高级结构似乎对于定位至早期内体和经tlr9的信号传导是必需的，但它们受制于产物多态性、聚集和沉淀，因而阻碍了其临床应用（非专利文件15）。因此，仅k和c型cpgodn通常可用作免疫治疗剂和疫苗佐剂用于人使用（非专利文件16和17）。虽然k型cpgodn在人临床试验中增强靶向传染病和癌症的疫苗的免疫原性（非专利文件6、16），但抗原和k型cpgodn之间的化学和物理结合对于最优佐剂效应是必需的。这些结果表明这四种（k、d、p和c）类型的cpgodn具有优点和缺点，然而开发活化b细胞和pdc两者而无聚集的“一体化（all-in-one）”cpgodn尚未完成。6.裂褶菌多糖（spg），一种来源于裂褶菌(schizophyllumcommune)的可溶性β-1,3-葡聚糖，是在日本被批准作为宫颈癌患者的放疗增强剂的药物，持续最近三十年（非专利文件18）。类似地，香菇多糖（lnt），一种来源于香菇的可溶性β-1,3-葡聚糖，是于1985年批准的药物，且与氟嘧啶药物组合使用，用于无法实施手术的和复发性胃癌患者（非专利文件19、20）。β-1,3-葡聚糖已显示与多脱氧腺苷酸（da）形成作为三链螺旋结构的复合体（非专d.m.cpgdnaasavaccineadjuvant.expertreviewofvaccines10,499-511(2011).非专利文件17：mchutchison,j.g.,等人.phase1b,randomized,double-blind,dose-escalationtrialofcpg10101inpatientswithchronichepatitiscvirus.hepatology46,1341-1349(2007).非专利文件18：okamura,k.,等人.clinicalevaluationofschizophyllancombinedwithirradiationinpatientswithcervicalcancer.arandomizedcontrolledstudy.cancer58,865-872(1986).非专利文件19：oba,k.;kobayashi,m.;matsui,t.;kodera,y.;sakamoto,j.individualpatientbasedmeta-analysisoflentinanforunresectable/recurrentgastriccancer.anticancerres.,2009,29,2739-2746.非专利文件20：nakano,h.;namatame,k.;nemoto,h.;motohashi,h.;nishiyama,k.;kumada,k.amulti-institutionalprospectivestudyoflentinaninadvancedgastriccancerpatientswithunresectableandrecurrentdiseases:effectonprolongationofsurvivalandimprovementofqualityoflife.hepato-gastroenterol.,1999,46,2662-2668.非专利文件21：sakurai,k.,mizu,m.&shinkai,s.polysaccharide-polynucleotidecomplexes.2.complementarypolynucleotidemimicbehaviorofthenaturalpolysaccharideschizophyllaninthemacromolecularcomplexwithsingle-strandedrnaanddna.biomacromolecules2,641-650(2001).非专利文件22：shimada,n.,等人.apolysaccharidecarriertoeffectivelydelivernativephosphodiestercpgdnatoantigen-presentingcells.bioconjugatechemistry18,1280-1286(2007).非专利文件23：koyama,s.,等人.plasmacytoiddendriticcellsdelineateimmunogenicityofinfluenzavaccinesubtypes.sciencetranslationalmedicine2,25ra24(2010).非专利文件24：minari,j.,等人.enhancedcytokinesecretionfromprimarymacrophagesduetodectin-1mediateduptakeofcpgdna/beta-1,3-glucancomplex.bioconjugatechemistry22,9-15(2011)。技术实现要素：13.本发明要解决问题本发明要解决的问题是提供比常规cpg-odn复合体具有更强活性的免疫刺激剂。14.解决问题的方法本发明人已进行大量研究并鉴定了包含在3‘端具有多（da）尾的k型cpgodn(k3)(seqidno:2)和spg的新颖的复合体，即k3-spg。其形成可以完全溶解的高级纳米颗粒。类似地，本发明也已成功生产包含上述k型cpgodn和香菇多糖（lnt）的新颖的复合体k3-lnt。尽管k3-spg和k3-lnt不具有d型cpgodn序列，但它同时具有对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性），和对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞以产生ifn-α的活性）。此外，k3-lnt和k3-spg具有有效的疫苗佐剂活性和，当与抗原一同接种用于免疫时，它们诱导抗原特异性体液免疫和细胞免疫，且的确显示针对rsv病毒和流感病毒的非常有效的感染保护性作用。他们基于这些发现进一步研究并完成本发明。15.因此，本发明提供了以下：[1]包含人源化k型cpg寡脱氧核苷酸和多脱氧腺苷酸的寡脱氧核苷酸，其中所述多脱氧腺苷酸位于人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸的3'侧。[0016][2][1]的寡脱氧核苷酸，其中所述人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸具有不小于10个核苷酸的长度，且包含由下式代表的核苷酸序列：其中中心的cpg基序未甲基化，w是a或t，且n1、n2、n3、n4、n5和n6可以是任何核苷酸。[0017][3][1]或[2]的寡脱氧核苷酸，其中所述人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸由seqidno:1显示的核苷酸序列组成。[0018][4][1]-[3]中任一项的寡脱氧核苷酸，其中所述寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键部分或整体被硫代磷酸酯键取代。[0019][5][4]寡脱氧核苷酸，其中所述寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键整体被硫代磷酸酯键取代。[0020][6][1]-[5]中任一项的寡脱氧核苷酸，其中所述多脱氧腺苷酸具有20-60个核苷酸的长度。[0021][7]包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的复合体。[0022][8][7]的复合体，其中所述β-1,3-葡聚糖是香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖或昆布多糖。[0023][9][8]的复合体，其中所述β-1,3-葡聚糖是香菇多糖、裂褶菌多糖或硬葡聚糖。[0024][10]由以下（i）中所述的寡脱氧核苷酸和（ii）中所述的β-1,3-葡聚糖组成的复合体：（i）寡脱氧核苷酸，其中长度20-60个核苷酸的多脱氧腺苷酸在由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'端结合，且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代（ii）香菇多糖或裂褶菌多糖。[0025][11][7]-[10]中任一项的复合体，其具有三链螺旋结构。[0026][12][7]-[11]中任一项的复合体，其具有活化b细胞以产生il-6的活性和活化树突细胞以产生ifn-α的活性。[0027][13]药物组合物，其包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0028][14][13]的药物组合物，其用于预防或治疗病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染。[0029][15][14]的药物组合物，其用于预防或治疗病毒感染。[0030][16][15]的药物组合物，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0031][17]用于诱导产生i型和/或ii型干扰素的药剂，其包含[7]-[12]中任一项的复合体。[0032][18]免疫刺激剂，其包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0033][19][18]的免疫刺激剂，其为疫苗佐剂。[0034][20]用于病毒感染、癌症、变应性疾病、或细胞内寄生性原生动物或细菌感染的预防剂或治疗剂，其包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0035][21][20]的预防剂或治疗剂，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0036][22][1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体用于生产药物组合物的用途。[0037][23][22]的用途，其中所述药物组合物为用于预防或治疗病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染的药物组合物。[0038][24][23]的用途，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0039][25]用于治疗或预防温血动物中的疾病的方法，其包括向所述温血动物施用药学上有效量的[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0040][26][25]的方法，其中所述疾病为病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染。[0041][27][26]的方法，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0042][28][25]-[27]中任一项的方法，其中所述温血动物是人。[0043][29]在温血动物中诱导保护性免疫反应的方法，其包括向所述温血动物施用药学上有效量的[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0044][30][1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体，其用于治疗或预防病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染。[0045][31][30]的寡脱氧核苷酸或复合体，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0046][32]药物组合物，其包含（a）[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体，和（b）抗原。[0047][33][32]的组合物，其用于诱导针对抗原的免疫反应。[0048][34][33]的组合物，其中所述抗原来源于病原体。[0049][35][34]的组合物，其用于预防或治疗病原体感染。[0050][36][35]的组合物，其中所述病原体是病毒。[0051][37][36]的组合物，其中所述病毒是rs病毒或流感病毒。[0052]发明效果本发明提供具有优秀的免疫刺激活性的寡脱氧核苷酸和包含其的复合体。具体而言，本发明的复合体同时具有针对k型cpgodn独特的免疫刺激活性和针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性。此外，由于本发明的复合体具有强疫苗佐剂活性，当本方面的复合体与抗原一同进行免疫时，刺激抗原特异性体液免疫和细胞免疫两者以提供高度的强感染保护作用。因此，本发明的复合体可用作免疫刺激剂或疫苗佐剂。附图说明[0053]图1显示cpgodn和lnt或spg的络合方法。[0054]图2显示通过pbmc的pan-ifn-α产生。[0055]图3显示从用k3、k3-da40或k3-spg刺激人pbmc产生的细胞因子的概况。[0056]图4显示k3-spg的扫描电子显微镜图像。[0057]图5显示如由动态光散射分析的k3-spg、spg和d35的颗粒大小。[0058]图6显示通过用k3、k3-spg或d35刺激诱导pbmc产生pan-ifn-α、-ifn-α2和ifn-γ。[0059]图7显示由人pbmc产生pan-ifn-α和il-6，其由用k3、k3-da40、k3-spg、cpg21798（p型cpgodn）、cpg21889(p)、cpg2395(c)或m362(c)(0.74、2.2、6.6或20μg/ml)刺激产生。[0060]图8显示k3-spg与含k型cpgodn的内体的共定位。比例尺显示10μm。结果代表至少两个独立实验。[0061]图9显示k3-spg与含d型cpgodn的内体的共定位。比例尺显示10μm。[0062]图10显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0063]图11显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。[0064]图12显示通过用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫诱导的ova特异性cd8t细胞的比例。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0065]图13显示通过用单独的ova、ova k3、ova k3-da40或ova k3-spg免疫诱导的体内ova特异性ctl活性。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0066]图14显示k3-spg的肽疫苗佐剂作用。[0067]图15显示k3-spg的剂量依赖性佐剂作用。[0068]图16显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。免疫时的ova剂量显示在每一图上。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0069]图17显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。免疫时的ova剂量显示在每一图上。[0070]图18显示spg对空（载体）、树突状细胞相关性c型植物血凝素-1(dectin-1)、或树突状细胞相关性c型植物血凝素-2(dectin-2)转染子的结合。[0071]图19显示k3或k3-spg对空（载体）、树突状细胞相关性c型植物血凝素-1、或树突状细胞相关性c型植物血凝素-2转染子的结合。[0072]图20显示c57bl/6j小鼠或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞的tnf-α产生，其通过酵母聚糖耗竭刺激诱导。[0073]图21显示c57bl/6j小鼠或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞的tnf-α产生，其通过spg刺激诱导。[0074]图22显示酵母聚糖耗竭对c57bl/6j小鼠或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞的tnf-α产生的影响，其通过cpgodn刺激诱导。*p《0.05(t-检验)。[0075]图23显示spg对c57bl/6j小鼠的脾细胞的tnf-α产生的影响，其通过cpgodn刺激诱导。[0076]图24显示由k3-spg诱导的细胞因子产生依赖于tlr9。a）由fl-dc的ifn-α产生，b）由脾细胞的il-6和il-20p40产生，c）由fl-dc的ifn-α产生，d）由脾细胞的il-6和il-12p40产生。[0077]图25显示用ova k3-spg免疫的tlr9 / 或tlr9-/-小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0078]图26显示用ova k3-spg免疫的tlr9 / 或tlr9-/-小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0079]图27显示用ova k3-spg免疫tlr9 / 或tlr9-/-小鼠诱导的ova特异性cd8t细胞的比例。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0080]图28显示k3-spg的佐剂作用不依赖于树突状细胞相关性c型植物血凝素-1。a）血清中的抗原特异性抗体滴度。b）由于抗原再刺激的由脾细胞的ifn-γ产生。c）体内诱导的抗原特异性的cd8t细胞的比例。[0081]图29显示用ova k3-spg免疫的树突状细胞相关性c型植物血凝素-1 /-或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1ꢀ‑/-小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。[0082]图30显示用ova k3-spg免疫的树突状细胞相关性c型植物血凝素-1 / 或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1ꢀ‑/-小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。[0083]图31显示用ova k3-spg免疫树突状细胞相关性c型植物血凝素-1 / 或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1-/-小鼠诱导的ova特异性cd8t细胞的比例。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0084]图32显示施用alexa488-k3-spg后1小时时k3-spg在iln表面上的定位。[0085]图33显示施用dq-ova后1小时时ova、marco 细胞和siglec-1 细胞在iln中的定位。[0086]图34显示通过速度（volocity）的图33中的ova与marco 细胞或siglec-1 细胞共定位的分析结果。*p《0.05(t-检验)。[0087]图35显示施用alexa488-k3或alexa488-k3-spg后1小时时k3、k3-spg和marco 细胞在iln中的定位。[0088]图36显示通过速度（volocity）的图35中的k3或k3-spg与marco 细胞共定位的分析结果。*p《0.05(t-检验)。[0089]图37显示用氯膦酸盐脂质体的耗竭实验方案（上图）、血清中抗原特异性抗体滴度（左下图）和通过抗原刺激的细胞因子产生。*p《0.05(t-检验)。[0090]图38显示在施用有k3或k3-spg的c57bl/6j或tlr9-/-小鼠的各种dc中的cd40表达。[0091]图39显示在用sv、wiv或sv k3-spg免疫的小鼠血清中的抗原特异性抗体滴度。[0092]图40显示当用sv、wiv或sv k3-spg免疫随后通过用流感病毒a/p/r8（h1n1）攻击时的体重的时间过程变化（左）和存活曲线（右）。[0093]图41显示在用sv k3或sv k3-spg免疫的食蟹猴（macacafascicularis）血清中的抗原特异性血清抗体滴度的时间过程变化。*p《0.05(t-检验)。[0094]图42显示在用sv k3或sv k3-spg免疫的食蟹猴血清中的抗原特异性血清抗体滴度（在第110周）。[0095]图43显示k3和k3-spg之间的疫苗佐剂作用的比较。[0096]图44显示通过k3、k3-lnt或k3-spg的pan-ifn-a产生的il-6产生。[0097]图45显示接种有添加k3、k3-lnt或k3-spg的rsvf亚单位疫苗的小鼠血清中的rsvf抗原特异性igg抗体滴度。[0098]图46显示接种有添加k3、k3-lnt或k3-spg的rsvf亚单位疫苗的小鼠中由rsvf抗原刺激特异性诱导的细胞因子产生。[0099]图47显示接种有添加k3或k3-lnt或k3-spg的rsvf亚单位疫苗的棉鼠中的rsv感染保护作用。具体实施方式[0100]1.寡脱氧核苷酸本发明提供包含k型cpg寡脱氧核苷酸和多脱氧腺苷酸（da）的寡脱氧核苷酸（下文中称为本发明的寡脱氧核苷酸）。[0101]本发明的寡脱氧核苷酸包括其中修饰磷酸二酯键（例如，一部分或所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代）的寡脱氧核苷酸。[0102]本发明的寡脱氧核苷酸包括药学上可接受的盐。[0103]在本说明书中，寡脱氧核苷酸和odn含义相同。此外，“人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）”和“人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）残基”含义相同，而与结尾处术语“残基”存在与否无关，且可互换使用。此外，多脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylate）和多脱氧腺苷酸（polydeoxyadenosineacid）（残基）含义相同。术语“残基”意指具有更高分子量的化合物的部分结构。本领域技术人员可以容易地从上下文中理解本说明书中的“人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）”是否意指独立分子或具有更高分子量的化合物的部分结构。这同样适用于关于本发明的寡脱氧核苷酸中包含的其他部分结构的术语，诸如“多脱氧腺苷酸”等等。[0104]cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）是含有免疫刺激性非甲基化cpg基序的单链dna且是tlr9激动剂。cpgodn包括4种类型：k型（也称为b型）、d型（也称为a型）、c型和p型，其在骨架、序列和免疫刺激特性上有所不同(advanceddrugdeliveryreviews61,195-204(2009))。其中，本发明寡脱氧核苷酸包含k型cpgodn。[0105]k型cpgodn是具有这样的结构和功能特性的cpgodn，其通常含有非回文、多个非甲基化的cpg基序，活化b细胞以产生il-6，但几乎不诱导由浆细胞样树突细胞（pdc）的ifn-α产生。非甲基化cpg基序是含有至少一个胞嘧啶（c）-鸟嘌呤（g）序列的段的核苷酸序列，其中胞嘧啶-鸟嘌呤序列中胞嘧啶的5-位置未甲基化。在以下解释中，除非另有具体说明，cpg意指非甲基化cpg。因此，本发明的寡脱氧核苷酸通过包含k型cpgodn具有针对k型cpgodn的独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性）。许多人源化的k型cpgodn在相关
技术领域：
：中是已知的(journalofimmunology166,2372-2377(2001);journalofimmunology164,944-953(2000);us8,030,285b2)。[0106]包含在本发明的寡脱氧核苷酸中的k型cpgodn优选是人源化的。“人源化的”意指其具有人tlr9的激动剂活性。因此，本发明的包含k型cpgodn的寡脱氧核苷酸具有对于人的免疫刺激活性，其对于k型cpgodn是独特的（例如，活化人b细胞以产生il-6的活性）。[0107]本发明中优选使用的k型cpgodn具有不小于10个核苷酸的长度，且包含由下式代表的核苷酸序列：其中中心的cpg基序未甲基化，w是a或t，且n1、n2、n3、n4、n5和n6可以是任何核苷酸。[0108]在一个实施方案中，本发明中的k型cpgodn具有不小于10个核苷酸的长度，且包含由上述式代表的核苷酸序列。在上述式中，中心的4个碱基的cpg基序仅需要被包含在10个核苷酸中，且不需要位于上述式中的n3和n4之间。此外，上述式中的n1、n2、n3、n4、n5和n6可以是任何核苷酸，且n1和n2、n2和n3、n3和n4、n4和n5,和n5和n6的至少一种（优选一种）的组合可以形成2碱基cpg基序。当具有4个碱基的上述cpg基序不位于之间时，上述式中心中的4个碱基（第4至第7碱基）中任何2个连续碱基为cpg基序，且其余2个碱基可以是任何核苷酸。[0109]本发明中更优选使用的k型cpgodn包含含有一个或多个cpg基序的非回文结构。本发明中进一步优选使用的k型cpgodn由含有一个或多个cpg基序的非回文结构组成。[0110]人源化的k型cpgodn通常特征在于由tcga或tcgt的4个碱基组成的cpg基序。在许多情况下，4碱基cpg基序的2个或3个包含在人源化的k型cpgodn中。因此，在优选的实施方案中，包含在本发明的寡脱氧核苷酸中的k型cpgodn包含由tcga或tcgt组成的4碱基cpg基序中至少一个、更优选两个或更多、进一步优选2或3个。当k型cpgodn具有4碱基cpg基序中的2个或3个时，这些4碱基cpg基序可以是相同的或不同的，且不特别限定，只要其具有针对人tlr9的激动剂活性。[0111]包含在本发明的寡脱氧核苷酸中的k型cpgodn更优选包含由seqidno:1显示的核苷酸序列。[0112]尽管k型cpgodn的长度没有特别限定只要本发明的寡脱氧核苷酸具有免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选人b细胞）以产生il-6的活性），但其优选长度不多于100个核苷酸（例如，长度10-75个核苷酸）。k型cpgodn的长度更优选长度不多于50个核苷酸（例如长度10-40个核苷酸）。k型cpgodn的长度更优选长度不多于30个核苷酸（例如长度10-25个核苷酸）。k型cpgodn的长度最优选为长度12-25个核苷酸。[0113]尽管多脱氧腺苷酸（da）的长度并无具体限制只要其足以形成与β-1,3-葡聚糖（优选地，香菇多糖或裂褶菌多糖）链的三链螺旋结构，但从形成稳定的三链螺旋结构的方面而言，其通常长度不小于20个核苷酸，优选长度不小于40个核苷酸，进一步优选长度不小于60个核苷酸。理论上，多da不具有长度上限，因为更长的多da与β-1,3-葡聚糖形成更稳定的三链螺旋结构。然而，当其太长时，寡脱氧核苷酸长度在合成时变化。因此，其通常长度不多于100个、优选不多于80个核苷酸。在另一方面，从上述的稳定的三链螺旋结构的形成、以及每单位量的β-1,3-葡聚糖结合的本发明的寡脱氧核苷酸的量中的增加、避免寡脱氧核苷酸合成时长度变化、和络合效率的方面而言，多da的长度优选为长度20-60个核苷酸（具体而言，长度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸），更优选长度30-50个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸），最优选长度30-45个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸）。具体而言，当其不小于30个核苷酸长度时，实现良好的络合效率。包含多da的本发明的寡脱氧核苷酸具有与两个裂褶菌多糖链形成三链螺旋结构的活性。注意多脱氧腺苷酸有时表示为“多（da）”或“多（da）”。[0114]尽管本发明的寡脱氧核苷酸的一个分子可以包含多个k型cpgodn和/或多da，但其优选含有k型cpgodn和多da各一个，最优选由k型cpgodn和多da各一个组成。[0115]本发明的寡脱氧核苷酸特征在于多da位于k型cpgodn的3'侧。通过这种排列，本发明的复合体（下文详述）变得具有针对k型cpgodn独特的免疫刺激活性和针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性。[0116]k型cpgodn和多da可以通过共价键直接连接，或经间隔序列连接。间隔序列意指在两个相邻构成要素之间插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。尽管间隔序列的长度并无具体限定，只要本发明的复合体具有免疫活性（优选地，活化b细胞以产生il-6的活性，和活化树突细胞以产生ifn-α的活性），但其通常长度为1-10个核苷酸，优选长度1-5个核苷酸，更优选长度1-3个核苷酸。最优选地，k型cpgodn和多da通过共价直接连接。[0117]本发明的寡脱氧核苷酸任选除了k型cpgodn、多da和任选的间隔序列外还具有在其5'端和/或3'端的额外的核苷酸序列。尽管额外的核苷酸序列的长度并无具体限定，只要本发明的复合体具有免疫活性（优选地，活化b细胞以产生il-6的活性，和活化树突细胞以产生ifn-α的活性），但其通常长度为1-10个核苷酸，优选长度1-5个核苷酸，更优选长度1-3个核苷酸。[0118]在优选的实施方案中，本发明的寡脱氧核苷酸在5'端和/或3'端不包含此类额外的核苷酸序列。即，本发明的寡脱氧核苷酸优选由k型cpgodn、多da和任选的间隔序列组成，更优选由k型cpgodn和多da组成。[0119]在最优选的实施方案中，本发明的寡脱氧核苷酸由k型cpgodn（具体而言，例如，由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸）和多da组成，其中k型cpgodn位于寡脱氧核苷酸的5'端且多da位于其3'端。具体而言，它是这样的寡脱氧核苷酸，其中长度20-60个核苷酸（更优选地，长度30-50个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸），最优选地，长度30-45个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸））的多da在由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'端结合，例如由seqidno:2或9-12显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸。[0120]本发明的全长寡脱氧核苷酸通常长度30-200个核苷酸，优选长度35-100个核苷酸，更优选长度40-80个核苷酸（具体而言，长度40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸），进一步优选长度50-70个核苷酸（具体而言，长度50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个核苷酸），最优选长度50-65个核苷酸（具体而言，长度50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65个核苷酸）。[0121]本发明的寡脱氧核苷酸可以合适地修饰以对体内降解（例如，由外切核酸酶或内切核酸酶降解）有抗性。优选地，修饰包括硫代磷酸酯修饰和二硫代磷酸酯修饰。即，本发明的寡脱氧核苷酸中的部分或所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键所取代。[0122]优选地，本发明的寡脱氧核苷酸包括硫酸二酯键的修饰，更优选地，磷酸二酯键的修饰是硫代磷酸酯键（即，如wo95/26204中所述，非交联氧原子之一被硫原子取代）。即，本发明的寡脱氧核苷酸中的部分或所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键所取代。[0123]本发明的寡脱氧核苷酸优选包含在k型cpgodn中硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的修饰，更优选地，k型cpgodn中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代。而且，本发明的寡脱氧核苷酸优选包含在多da中硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键，更优选地，多da中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代。进一步优选地，包含人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸和多脱氧腺苷酸的本发明的寡脱氧核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。最优选地，本发明的寡脱氧核苷酸是这样的寡脱氧核苷酸，其中长度20-60个核苷酸（更优选地，长度30-50个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸），最优选地，长度30-45个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸））的多da结合到人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸(例如、seqidno:1)的3'端，且包含在寡脱氧核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代。由于硫代磷酸酯键，本发明的寡脱氧核苷酸预期不仅显示对降解的抗性而且还显示免疫刺激活性的增强（例如，活化b细胞以产生il-6的活性）和cpg-β-1,3-葡聚糖复合体的高产量。在本发明中，硫代磷酸酯键与硫代磷酸酯骨架含义相同，且磷酸二酯键与磷酸骨架含义相同。[0124]本发明的寡脱氧核苷酸包括上述寡脱氧核苷酸的任何药学上可接受的盐、酯、和此类酯的盐。[0125]本发明的寡脱氧核苷酸的药学上可接受的盐的优选实例包括金属盐诸如碱金属盐（例如钠盐、钾盐和锂盐）、碱土金属盐（例如钙盐和镁盐）、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；胺盐诸如无机盐（例如铵盐）和有机盐（例如，叔辛基胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n’‑二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三（羟甲基）氨基甲烷盐）等；无机酸盐诸如卤代氢酸盐（例如，氢氟化物、氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物）、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐诸如链烷磺酸盐（例如，甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐），芳基磺酸盐（例如，苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐）、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；和氨基酸盐如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。[0126]尽管本发明的寡脱氧核苷酸可以采用单链、双链和三链的任何形式，但其优选是单链。[0127]优选分离本发明的寡脱氧核苷酸。“分离的”意指已进行去除除了目标组分外的因子的操作，且寡脱氧核苷酸不处于天然存在的状态。“分离的寡脱氧核苷酸”的纯度（评价目标产物总重量中目标寡脱氧核苷酸的重量百分比）通常不少于70％，优选不少于80％，更优选不少于90％，进一步优选不少于99％。[0128]由于本发明的寡脱氧核苷酸具有优秀的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选人b细胞）以产生il-6的活性），其可用作免疫刺激剂等。此外，由于本发明的寡脱氧核苷酸具有与两个β-1,3-葡聚糖（优选地，香菇多糖、裂褶菌多糖或硬葡聚糖）形成三链螺旋结构的特性，因此其可用于制备下文提及的本发明的复合体。[0129]2.复合体本发明提供包含上述的本发明的寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的复合体（下文称为本发明的复合体）。[0130]由于本发明的上述寡脱氧核苷酸包含k型cpgodn，但其自身显示对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性），且在对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞以产生ifn-α的活性）中是差的。然而，令人惊奇地，它通过与β-1,3-葡聚糖（优选地，香菇多糖或裂褶菌多糖）形成复合体而获得了针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞以产生ifn-α的活性），而不需d型cpgodn的序列。即，本发明的复合体具有对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性）和对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞（优选人浆细胞样树突细胞）以产生ifn-α的活性）两者。[0131]本发明中使用的β-1,3-葡聚糖的实例包括香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖、昆布多糖等。β-1,3-葡聚糖优选是包含许多1,6-吡喃葡萄糖苷分支（侧链率33-40%）的β-1,3-葡聚糖，诸如香菇多糖、裂褶菌多糖和硬葡聚糖，更优选香菇多糖或裂褶菌多糖，最优选香菇多糖。[0132]香菇多糖（lnt）是来源于香菇且具有(c6h10o5)n分子式和约300,000ꢀ–ꢀ700,000的分子量的已知的β-1,3-葡聚糖。尽管它难溶于水、甲醇、乙醇（95）和丙酮，但其可溶于极性有机溶剂（dmso）和氢氧化钠水溶液。[0133]香菇多糖具有增强活化的巨噬细胞、杀伤性t细胞、自然杀伤细胞和抗体依赖性巨噬细胞介导的细胞毒性（admc）活性的作用(hamuro,j.,等人.:immunology,39,551-559,1980,hamuro,j.,等人.:int.j.immunopharmacol.,2,171,1980,herlyn,d.,等人.:gann,76,37-42,1985)。在动物实验中，与化疗剂的组合施用显示对同系肿瘤和自体肿瘤的肿瘤生长抑制作用和延长生命的作用。而且，单独施用香菇多糖显示肿瘤生长抑制作用和延长生命作用。在临床试验中，与喃氟啶口服施用组合使用延长了无法做手术或复发性胃癌患者的存活周期（药品会诊(interview)形式“香菇多糖静脉内注射1mg”ajinomotoco.,inc.），且已在日本获得批准。单独施用香菇多糖的作用目前尚未证实。[0134]裂褶菌多糖（spg）是来源于裂褶菌的已知的可溶β-葡聚糖。spg由β-(1→3)-d-葡聚糖的主链和一个β-(1→6)-d-葡萄糖基侧链/3个葡萄糖组成(tabata,k.,ito,w.,kojima,t.,kawabata,s.和misakia.,ꢀ“carbohydr.res.”,1981,89,1,p.121-135)。spg已实际用作用于妇科癌症的免疫佐剂疗法的肌内注射制剂临床药物有20年或更久(shimizu,chin,hasumi,masubuchi,ꢀ“biotherapy”,1990,4,p.1390hasegawa,ꢀ“oncologyandchemotherapy”,1992,8,p.225)，且体内安全性已得到证实(theresa,m.mcintire和david,a.brant,ꢀ“j.am.chem.soc.”,1998,120,p.6909)。[0135]在本说明书中，“复合体”意指通过经非共价键或共价键诸如静电键、范德华键、氢键、疏水性相互作用等的多个分子结合获得的产物。[0136]本发明的复合体优选展示三链螺旋结构。在优选的实施方案中，形成三链螺旋结构的三个链中，两个为β-1,3-葡聚糖链，且一个为本发明的上述寡脱氧核苷酸中的多脱氧腺苷酸链。复合体可以包含没有形成三链螺旋结构的部分。[0137]本发明的复合体中寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的组成比例可以根据寡脱氧核苷酸中多脱氧腺苷酸的链长度、β-1,3-葡聚糖的长度等而改变。例如，当β-1,3-葡聚糖链和多脱氧腺苷酸的长度相同时，两个β-1,3-葡聚糖链和一个本发明的寡脱氧核苷酸可以结合以形成三链螺旋结构。通常，由于多脱氧腺苷酸的链长度比β-1,3-葡聚糖链长度短，因此本发明的多个寡脱氧核苷酸可以与两个β-1,3-葡聚糖链经多脱氧腺苷酸结合以形成三链螺旋结构（参见图1）。[0138]本发明的复合体是包含人源化的k型cpgodn和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖、昆布多糖）的复合体，优选为由人源化的k型cpgodn和β-1,3-葡聚糖（例如香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖）组成的复合体。更优选地，其是由寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖）组成的复合体（例如，k3-da20-60-lnt、k3-da20-60-spg），在所述寡脱氧核苷酸中长度20-60个核苷酸的多脱氧腺苷酸（具体而言，长度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸）结合到由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'侧，并且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代，进一步优选地，其是由寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖）组成的复合体(例如，k3-da30-50-lnt、k3-da30-50-spg)，在所述寡脱氧核苷酸中长度30-50个核苷酸（具体而言，长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸）的多脱氧腺苷酸结合到由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'侧，并且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代，最优选地，其是由寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖）组成的复合体(k3-da30-45-lnt、k3-da30-45-spg)，在所述寡脱氧核苷酸中长度30-45个核苷酸（具体而言，长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸）的多脱氧腺苷酸结合到由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'侧，并且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。[0139]本发明的复合体的制备方法可以在类似于非专利文件21-24和jp-a-2008-100919中描述的那些条件下进行。即，β-1,3-葡聚糖，其固有地天然存在作为三链螺旋结构，溶解于质子惰性的有机极性溶剂（二甲亚砜（dmso）、乙腈、丙酮等）或含水碱性溶液（氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氢氧化钙等）中以松散为单链。将由此获得的单链β-1,3-葡聚糖的溶液和本发明的寡脱氧核苷酸溶液（水溶液、近似中性ph的缓冲水溶液、或酸性缓冲水溶液，优选地，水溶液或近似中性ph的缓冲水溶液）混合，调整ph至近似中性ph（需要时），且将混合物维持合适时间，例如，5℃下过夜。结果是，两个β-1,3-葡聚糖链和寡脱氧核苷酸中的多da链形成三链螺旋结构，由此可以形成本发明的复合体。所获的复合体可以通过尺寸排阻层析、超滤、透析等进行纯化以去除没有形成复合体的寡脱氧核苷酸。此外，所得的复合体可以通过阴离子交换层析进行纯化以去除未形成复合体的β-1,3-葡聚糖。复合体可以合适地通过上述方法纯化。[0140]本发明的复合体的形成可以通过例如通过cd（圆二色性）谱、通过尺寸排阻层析的uv吸收迁移、凝胶电泳、微芯片电泳、毛细管电泳来测量构象改变，尽管方法并不限于此。[0141]尽管本发明的寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的混合比例可以考虑多da链的长度等而合适地确定，但摩尔比（spg/odn）通常为0.02ꢀ‑ꢀ2.0，优选0.1ꢀ‑ꢀ0.5。在进一步的实施方案中，摩尔比（β-1,3-葡聚糖(lnt等)/odn）例如为0.005ꢀ‑ꢀ1.0，优选0.020ꢀ‑ꢀ0.25。[0142]本发明的复合体的制备方法通过采用cpg-odn和lnt复合体作为实例来解释。lnt溶解于0.05ꢀ‑ꢀ2n优选0.1ꢀ‑ꢀ1.5n的碱性水溶液（例如，0.25n氢氧化钠水溶液），且将混合物静置于1℃ꢀ‑ꢀ40℃持续10hr-4天（例如，室温下静置过夜）以制备单链lnt水溶液（例如，50mg/mllnt水溶液）。将分别制备的上述lnt水溶液和cpg水溶液（例如，100μmcpg水溶液）以0.005-1.0的摩尔比（lnt/odn）混合，随后上述lnt水溶液用缓冲的酸性水溶液（例如nah2po4）中和并在1ꢀ‑ꢀ40℃下保持6hr-4天（例如4℃下过夜）以完成络合。lnt水溶液可以最后添加且混合用于上述络合。复合体的形成可以通过例如通过尺寸排阻层析在监测240-280nm（例如260nm）处吸收时cpgodn向高分子量侧的迁移而确定。[0143]在一个实施方案中，本发明的复合体展示杆形颗粒的形式。颗粒大小等于由用作材料通过展示三链螺旋结构的β-1,3-葡聚糖（例如裂褶菌多糖）天然形成的颗粒大小。平均颗粒大小通常为10-100nm，优选20－50nm。颗粒大小可以通过将复合体溶解于水中并将溶液进行通过使用malverninstrumentszetasizer在80℃下的动态光散射方法而测量。[0144]优选分离本发明的复合体。“分离的复合体”的纯度（目标复合体重量与评价目标产物的总重量的百分比）通常不少于70％，优选不少于80％，更优选不少于90％，进一步优选不少于99％。[0145]由于本发明的复合体具有优秀的免疫刺激活性并具有对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性）和对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞（优选人浆细胞氧树突细胞）以产生ifn-α的活性）两者，因此其可用作免疫刺激剂等。例如，含有k型cpgodn（例如，seqidno:2、11、12）和lnt(k3-lnt)的复合体和含有k型cpgodn（例如，seqidno:2）和spg(k3-spg)的复合体具有诱导炎症应答（pan-ifn-a、il-6等）的能力、增强病毒接种的个体血清中的抗原特异性igg抗体滴度（总igg、igg2c等）的作用、在病毒接种的个体中抗原特异性产生细胞因子（ifn-γ、il2）的能力、和针对病毒的感染保护性作用。k3-lnt还具有在病毒接种的个体中增强th2细胞因子（il-13等）产生的能力。因此，它们可用作新颖的疫苗佐剂候选物。[0146]3.药物组合物本发明提供包含本发明的上述寡脱氧核苷酸或本发明的上述复合体的药物组合物。本发明的药物组合物可以通过根据常规方法配制本发明的上述寡脱氧核苷酸或本发明的上述复合体来获得。本发明的药物组合物包含本发明的寡脱氧核苷酸或复合体和药学上可接受的载体。而且，药物组合物可以进一步包含抗原。此类药物组合物以合适于口服或肠胃外施用的剂型提供。[0147]作为用于肠胃外施用的组合物，例如，使用注射剂、栓剂等，且注射剂可以涵盖剂型诸如静脉内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、滴注剂等。此类注射剂可以根据已知方法制备。注射剂的制备方法包括将上述本发明的寡脱氧核苷酸或复合体溶解或悬浮于通常用于注射的无菌含水溶剂中。作为用于注射的含水溶剂，可以使用例如，蒸馏水；生理盐水；缓冲液诸如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓冲液等；等。此类含水溶剂的ph为例如5-10，优选6-8。制备的注射剂优选填充在合适的安瓿中。[0148]还可以通过将本发明的寡脱氧核苷酸或复合体的悬浮液进行处理诸如真空干燥、冻干等来制备本发明的寡脱氧核苷酸或复合体的粉末制剂。本发明的寡脱氧核苷酸或复合体可以通过以粉剂状态将其保存并使用时在注射用含水溶剂中分散粉剂来使用。[0149]本发明的寡脱氧核苷酸或复合体在药物组合物中的含量通常约为整个药物组合物的0.1ꢀ‑ꢀ100wt%，优选约1ꢀ‑ꢀ99wt%，更优选约1ꢀ‑ꢀ99wt%。[0150]本发明的药物组合物可以包含作为活性成分的单独的本发明的寡脱氧核苷酸或复合体或者本发明的寡脱氧核苷酸或复合体与其他活性成分的组合。[0151]4.药物用途由于本发明的寡脱氧核苷酸和复合体具有优秀的免疫刺激活性，因此本发明的寡脱氧核苷酸、复合体和药物组合物可以用作免疫刺激剂。向哺乳动物（灵长类动物诸如人等，啮齿类动物诸如小鼠等，等）施用本发明的寡脱氧核苷酸、复合体或药物组合物可以诱导哺乳动物中的免疫反应。具体而言，由于本发明的复合体具有d型cpgodn活化特性并且刺激外周血单核细胞产生大量的i型干扰素(pan-ifn-α、ifn-α2等)和ii型干扰素(ifn-γ)，其可用作i型干扰素产生诱导剂、ii型干扰素产生诱导剂或i型和ii型干扰素产生诱导剂。因为本发明的复合体和包含所述复合体的药物组合物诱导产生i型和ii型干扰素，因此它们可用于预防或治疗i型或ii型干扰素或者i型和ii型干扰素两者对其是有效的疾病。i型干扰素对其有效的疾病的实例包括病毒感染（例如丙型肝炎病毒（hcv）、疱疹病毒、乳头瘤病毒、rs病毒、流感病毒等）、癌症等。ii型干扰素对其有效的疾病的实例包括变应性疾病、细胞内寄生性原生动物的感染（利什曼原虫等）、细菌（李斯特菌、结核分枝杆菌）等，等。由于用于rs病毒、流感病毒等的急性病毒感染，因为i型干扰素和ii型干扰素两者增强与病毒消除相关的免疫应答，因此本发明的复合体和包含其的药物组合物预期对于急性病毒感染是有效的。[0152]而且，本发明的寡脱氧核苷酸和复合体，具体而言，本发明的复合体具有强的疫苗佐剂活性，且施用本发明的寡脱氧核苷酸和复合体连同抗原至哺乳动物可以诱导针对该抗原的强免疫反应。因此，本发明还提供诱导针对抗原的免疫反应的组合物，其包含（a）本发明的寡脱氧核苷酸或本发明的复合体，和（b）抗原。具体而言，本发明的复合体强烈诱导针对抗原的体液免疫反应（抗原特异性的抗体产生）和细胞免疫反应（抗原特异性ctl诱导）。因此，本发明的寡脱氧核苷酸、复合体和药物组合物，具体而言本发明的复合体和包含其的药物组合物可用作疫苗佐剂。[0153]在本说明书中，佐剂指促进免疫应答的药物助剂，其是当与抗原施用至活体时非特异性增强针对抗原的免疫应答的物质。[0154]抗原无具体限制只要其具有对于将作为施用对象的哺乳动物（灵长类动物诸如人等，啮齿类动物诸如小鼠等，等）的抗原性，且可以被抗体或细胞毒性t淋巴细胞(ctl、cd8 t细胞)识别为抗原。可以使用成为抗原的任何物质（蛋白、肽、核酸、脂质、碳水化合物和上述物质的修饰（例如修饰引入有缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸（下文称为突变）等））。作为抗原，也可以使用来源于病原体诸如原生动物、真菌、细菌、病毒等的抗原和与癌症或具体疾病相关的抗原。[0155]在本说明书中，“来源于病原体x的抗原a”意指包含抗原a作为病原体x中的构成要素。例如，当抗原a是多肽时，其意指多肽的氨基酸序列存在于由病原体x的基因组编码的蛋白的氨基酸序列中。[0156]来源于病原体的抗原的实例包括病原体本身或其部分，灭活的或减毒的病原体本身或其部分，或引入有对其的突变的修饰等，等等。[0157]当来源于病原体的抗原用作抗原时，诱导针对该抗原的免疫反应，且建立从机体natureimmunology8,39-46(2007))。c57bl/6j小鼠购自nihonclea。所有动物实验根据nationalinstituteofbiomedicalinnovation和osakauniversity动物设施的机构指南进行。以下cpgodn由genedesign,inc合成。[0168]（下划线表示硫代磷酸酯键）。[0169]表1表1alexa488-标记的k3;alexa488-标记的k3-da40;alexa647-标记的k3;alexa647-标记的k3-da40。[0170]具体而言，描述了合成k3-da35(seqidno:12)、k3-da30(seqidno:11)、k3-da25(seqidno:10)和k3-da20(seqidno:9)，除了上述的k3-da40(seqidno:2)之外（表2）。[0171]表2(序列表,seqidno:2)(序列表,seqidno:12)(序列表,seqidno:11)(序列表,seqidno:10)(序列表,seqidno:9)（在上述序列中，s显示核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。）。[0172]通过常规方法固相亚磷酰胺法合成寡脱氧核苷酸(nucleicacidsinchemistryandbiology,3.chemicalsynthesis(1990)编辑g.michaelblackburn和michaelj.gait.oxforduniversitypress)。[0173]表3显示表2中所述的cpgodn的分子量，和在以下条件下通过反相hplc分析的保留时间（柱：waters,x-bridgec182.5μm,4.6x75mm,溶液a:100mm六氟异丙醇、8mm三乙胺，溶液b:甲醇,b%:5%→30%(20min,线性梯度);60℃;1ml/min;260nm)。[0174]表3。[0175]卵清蛋白(ova)购自seikagakukogyo.dq-ova,alexa488-ova,cfse和lipofectamine2000购自invitrogen。hoechst33258、酵母多糖和凝胶多糖购自sigma。耗竭酵母多糖(zymosan-depleted)购自invivogen。氯膦酸盐脂质体购自formumax。流感裂解产物疫苗、福尔马林灭活的完整病毒（wiv）和纯化的流感病毒（h1n1）如前所述制备(koyama,s.,等人.,sciencetranslationalmedicine2,25ra24(2010))。[0176]cpgodn和spg的络合（图1）将7.22mgk3-da40溶解在水中（3.7ml）。将spg(15mg,mitsuisugarco.,ltd.)溶解在0.25nnaoh(1ml)中。加入1ml体积的330mmnah2po4至dna溶液，随后将spg溶液加入到dna/nah2po4溶液并在4℃下保持过夜以完成络合。摩尔比(mspg/mdna)保持为0.27。复合体的形成通过微芯片电泳仪确定(shimadzu:multina)。[0177]cpgodn和lnt的络合（图1）将香菇多糖(lnt:ajinomotoco.,inc.,lotno.:2d8x1)溶解在0.25nnaoh至50mg/ml，并将混合物在室温下静置过夜。将各种cpgodn（表2、3）溶解在注射用水中至100mm。将lnt溶液和各种cpg水溶液(k3-da20(seqidno:9)、k3-da25(seqidno:10)、k3-da30(seqidno:11)、k3-da35(seqidno:12)、k3-da40(seqidno:2))以表4中显示ng/ml)培养7天产生。将细胞以1ꢀ×ꢀ107细胞/ml的浓度铺板。bmdm通过用小鼠m-csf(peprotech)(20ng/ml)培养7天产生。这些细胞保持在完全rpmi中。[0183]细胞内分布（图8和9）将bmdm以5ꢀ×107细胞/ml铺板并用alexa488-k3(1μm)加alexa647-k3-spg(1μm)或alexa488-d35(1μm)加alexa647-k3-spg(1μm)刺激3小时。用hoechst33258染色细胞30min以将核显像，随后固定细胞并使用荧光显微镜分析。[0184]免疫将6周龄的c57bl/6j、tlr9缺陷的和树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷的小鼠在第0和10天在尾基部施用：ova(0.1、1、10、或100μg);ova(0.37、1.1、3.3、或10μg)和k3(538pmol);ova(0.37、1.1、3.3、或10μg)和k3-da40(538pmol);或ova(0.37、1.1、3.3、或10μg)和k3-spg(538pmol)。对于其他实验，将6周龄的c57bl/6j小鼠在第0和10天在尾基部施用：单独的裂解疫苗(0.1μg)；裂解疫苗加k3(538pmol)；或裂解疫苗加k3-spg(538pmol)。在第17天抽血并且通过elisa测量抗原特异性血清抗体滴度（图10、15a、16、25、28a、29和43a)。在第17天收集小鼠脾并通过上述方法制备脾细胞。将细胞用以下再次刺激：ova257-264(ova257):siinfekl(10μg/ml);ova323-339(ova323):isqavhaahaeineagr(10μg/ml);完全ova蛋白(ova)(10μg/ml);np260-283(np260):arsalilrgsvahksclpacvygp(10μg/ml);或裂解疫苗(10μg/ml)持续24或48小时。将上清液进行小鼠ifn-γ的elisa（图11、15b、17、26、28b、30和43b）。对于四聚体测定，将脾细胞用h-2kbova四聚体(mbl)、抗-cd8α(kt15)、抗-tcrβ(h57-597)、抗-cd62l(mel-14)、和抗-cd44(im7)抗体和7-aad染色。通过facs确定ova四聚体 cd44 cd8α tcrβ 细胞数(图12、15c、27、28c和31)。[0185]体外ctl测定（图13）将六周龄c57bl/6j小鼠在第0天在尾基部施用：ova(100μg);ova加k3(3.3μg);ova加k3-da40(3.3μg);或ova和k3-spg(3.3μg)。[0186]免疫后7天时，初生的c57bl/6j脾细胞用不同浓度的cfse(5或0.5μm)在37℃下标记10min。将以高浓度的染色的细胞用ova257(10μg/ml)在37℃下脉冲(pulsed)90min。用培养基洗涤两次后，将标记的细胞混合并通过静脉内施用转移至经免疫的小鼠。转移后24天，收集脾细胞并通过facs测量cfse标记的细胞的百分比。[0187]肽免疫c57bl/6j小鼠用以下免疫：ova257(10μg);ova257加k3(10μg);ova257加k3-da40(10μg);或ova257加k3-spg(10μg)。[0188]免疫后7天，制备脾细胞并用h-2kbova四聚体、抗-cd8α、抗-tcrβ、抗-cd62l、和抗-cd44抗体染色。ova四聚体 cd44 cd8α tcrβ 细胞数通过facs分析(图14左）。制备的脾细胞体外用ova257(10μg/ml)加golgiplug再刺激4小时。细胞用抗-ifn-γ、抗-cd8α和抗-cd3e抗体染色，且ifn-γ cd8α cd3e 细胞数通过facs确定（图14右）。[0189]转染和树突状细胞相关性c型植物血凝素-1结合测定（图18和19）使用lipofectamine2000用空的、树突状细胞相关性c型植物血凝素-1或树突状细胞相关性c型植物血凝素-2表达质粒转染hek293细胞。转染后48小时，将细胞用fitc-spg(0.5μm)、alexa488-标记的k3-da40(0.5μm)或alexa488-标记的k3-spg(0.5μm)在37℃下处理60min。处理后，收获细胞并通过facs分析spg或cpgodn阳性细胞。[0190]免疫细胞的刺激（图20、21、22、23和24）将来自c57bl/6j、tlr9缺陷的或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞和fl-dc用以下刺激24小时：k3-spg(0.014、0.03、0.04、0.08、0.12、0.25、0.37、0.74、1.1、2.2、3.3、6.7、10、或20μg/ml)、酵母多糖(3.7、11.1、33.3、或100μg/ml)、凝胶多糖、耗竭的酵母多糖、或spg。在其他实验中，来自c57bl/6j或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞用以下刺激：耗竭的酵母多糖(100、33.3、或11.1μg/ml)或spg(100、33.3、或11.1μg/ml)，具有或不具有d35(1μm)，持续24小时。将上清液进行对ifn-α(pbl)、il-6(r&d)、il-12p40(r&d)、il-12p70(r&d)和bioplex(bio-rad)的elisa。[0191]免疫组织化学（图32）将c57bl/6j小鼠在尾基部施用：dq-ova(10μg);alexa488-k3-spg(10μg);alexa647-k3-spg(10μg);或dq-ova加alexa647-k3-spg(10μg)。[0192]收集iln后，使用恒冷切片机(cryostat)制备冷冻切片。将冷冻切片用4％低聚甲醛固定10min并与抗-siglec-1(moma-1)、抗-marco(ed31)、抗-cd3e(145-2c11)、或抗-cd11c(n418)抗体孵育。通过imagej分析成像结果。[0193]双光子显微镜（图33和35）c57bl/6j、tlr9-缺陷的或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1-缺陷的小鼠用dq-ova(10μg)、alexa488-k3(10μg)、或alexa488-k3-spg(10μg)在尾基部施用。iln收集前30min，将小鼠用抗-pe-marco或抗-pe-siglec-1抗体在尾基部施用。施用抗原或佐剂后1小时时，收集iln并制备用于使用双光子显微镜(olympus)的成像分析。使用速度共定位分析计算pearson相关性。[0194]抗原和佐剂的体内分布（图34和36）将c57bl/6j小鼠在尾基部施用：alexa647-k3(538pmol);alexa647-k3-spg(538pmol);alexa488-ova(10μg);alexa488-ova加k3(10μg);alexa488-ova加k3-spg(10μg);dq-ova(10μg);dq-ova加alexa647-k3(538pmol);或dq-ova加alexa647-k3-spg(538pmol)。[0195]施用后24小时，收集iln。为了制备单细胞悬浮液，将iln与胶原蛋白酶d（1mg/ml）和dnasei（0.1mg/ml）在37℃下孵育30min。将制备的细胞与抗b220(ra3-6b2)、抗cd8α(56-6.7)和抗-cd11c抗体孵育以分离不同的dc群。通过facs分析ova和cpgodn的细胞摄取。[0196]氯膦酸盐脂质体注射（图37）免疫前5天或2天在尾基部向六周龄c57bl/6j小鼠施用氯膦酸盐脂质体。在第0天在尾基部用ova加k3-spg免疫小鼠。在第8天收集血液和脾，并通过elisa测量血清抗体滴度和t细胞应答。[0197]体内dc活化的研究（图38）用k3(10μg)或k3-spg(10μg)向尾基部对c57bl/6j或tlr9缺陷小鼠施用。施用后24小时，通过上述方法制备iln。将细胞用抗cd11c、抗mpdca-1(jf05-1c2.4.1)、抗cd8α、和抗cd40(3/23)抗体孵育，随后通过facs分析。[0198]针对流感病毒感染的防御应答的研究将六周龄c57bl/6j小鼠用以下施用：裂解疫苗(0.1μg)；裂解疫苗加k3-spg(10μg);或wiv(0.2μg)在第0和14天。免疫后2周，通过elisa测量血清抗体滴度（图39）并用2.3ꢀ×ꢀ103pfu(10ld50)的流感病毒a/pr/8/34鼻内攻击小鼠。监测攻击小鼠的体重改变和死亡率持续20天(图40)。[0199]食蟹猴的疫苗模型（图41和42）将食蟹猴在第0和14天皮下施用：流感裂解疫苗(5μg)加k3(5nmol)，或裂解疫苗和k3-spg(5nmol)在-2、2、4、6、8、110周收集血样，并通过elisa测量血清抗体滴度。[0200]统计学分析组间的统计学显著(p《0.05)使用student'st检验或mann-whitneyu检验来确定。[0201][结果]1）k3-spg的杆形纳米大小颗粒获得k和d型cpgodn的双重特性。[0202]cpgodn和spg之间的更好的络合效率需要如图1中所示的经变性-复性程序的对于在5'和3'端的多da40的ps骨架的额外序列(shimada,n.,等人.,bioconjugatechemistry18,1280-1286(2007);minari,j.,等人.,bioconjugatechemistry22,9-15(2011))。在通过人源化的cpgodn形成复合体的优化过程中，本发明人检查了cpgodn的5'和3'端的免疫刺激影响。5’‑k3-da40-3’而不是5’‑da40-k3-3’与spg活化的人外周血单核细胞(pbmc)络合以产生大量的ifn-α，尽管络合效率是可比较的（图2和3）。k3、k3-da40和da40-k3，其能够活化人pbmc以产生其他细胞因子，诸如il-6，无法产生ifn-α（图2和3）。这些结果表明5'-cpg比3'-cpg作为新颖的tlr9激动剂是更期望的。[0203]k3-spg的鉴定和定量通过扫描电子显微镜（sem）和动态光散射(dls)来进行。k3-spg具有杆样结构，与之前报道中可见的一致(bae,a.h.,等人.,carbohydrateresearch339,251-258(2004))（图4）。其似乎为具有30nm的平均直径的可溶性单体纳米颗粒，与spg本身相当且比d型cpgodn(d35)更小（图5）(klein,d.c.等人.,ultramicroscopy110,689-693(2010);costa,l.t.,等人.,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications313,1065-1072(2004))。[0204]考虑到k3-spg形成纳米颗粒，将k3-spg的免疫刺激活性与c、d和p型cpgodn比较。用k3-spg刺激pbmc产生更大量的ifn-α和ifn-γ，且以比由d35（图6）、p和c型cpgodn（图7）诱导的那些更低的浓度。这些结果表明k3-spg获得d型cpgodn的特征，而没有丧失k型的特征，这是因为这些ifn已知是d型特异性的细胞因子(krug,a.,等人.,europeanjournalofimmunology31,2154-2163(2001);verthelyi,d.等人.,journalofimmunology166,2372-2377(2001);gursel,m.等人.,journalofleukocytebiology71,813-820(2002))。为了理解k和d型cpgodn的双功能，本发明人分析了k3-spg在骨髓来源的巨噬细胞中的胞内定位。k3-spg不仅与包含k型cpgodn的内体而且与包含d型cpgodn的内体共定位（图8和9），如c型cpgodn(guiducci,c.,等人.,thejournalofexperimentalmedicine203,1999-2008(2006))，表明k3-spg可以转导经k和d型cpgodn的内体介导的先天免疫信号传递途径。这些结果强烈表明k3-spg形成纳米大小的高级和完全溶解的颗粒，并且发现这种“一体化”k3-spg展示比任何其他cpgodn和先前已知的cpg-spg复合体更有效的活性和与其不同的特征。[0205]2）k3-spg是诱导针对蛋白抗原的有效ctl应答无需缀合的有效疫苗佐剂。[0206]本发明人在鼠免疫模型中比较了k3、k3-da40和k3-spg的佐剂作用。当用单独的ova、或ova与每一k3来源的佐剂免疫野生型小鼠时，k3-spg诱导比由k3诱导的显著更高的体液免疫应答（图10）和更强的t细胞应答（图11）。值得注意的是，四聚体测定揭示ova特异性cd8t细胞显著更高的数目（图12）。还观察到针对共施用的蛋白抗原而无任何共价缀合的非常强的体内ctl活性（图13）。由k3-spg的这种强ctl诱导通过肽接种而再现（图14），且是剂量依赖性的（图15）。k3-spg的抗原节约能力如此有效以致于使用百分之一的ova抗原的量实现了相当的抗体和cd4t细胞应答（图16和17）。这些结果明确地表明k3-spg是比单独的k3更卓越的佐剂。[0207]3）spg是可溶性树突状细胞相关性c型植物血凝素-1配体，但不是树突状细胞相关性c型植物血凝素-1激动剂。[0208]检查了树突状细胞相关性c型植物血凝素-1在细胞摄入spg和k3-spg及随后被其活化中的作用，因为树突状细胞相关性c型植物血凝素-1已显示是β-葡聚糖诸如酵母多糖trendsinimmunology33,66-70(2012))。使用常规荧光显微镜的组织学分析没有合适地揭示整个iln表面；此外，这些巨噬细胞难于分离用于流式细胞术分析(aoshi,t.,等人.,europeanjournalofimmunology39,417-425(2009);gray,e.e.&cyster,j.g.,journalofinnateimmunity4,424-436(2012))。因此，使用双光子显微镜成像分析来阐明离体的抗原和k3-spg的分布。注射抗marco和抗siglec-1抗体后，将特异性巨噬细胞显像。当通过双光子显微镜在注射后1小时监测iln时，ova和k3-spg与marco 而非siglec-1 巨噬细胞共定位（图33和35）。之前报道表明免疫复合体和灭活的流感病毒被siglec-1 巨噬细胞捕获以诱导体液免疫应答(gonzalez,s.f.,等人.,natureimmunology11,427-434(2010);suzuki,k.等人.,thejournalofexperimentalmedicine206,1485-1493(2009))。如由速度共定位分析所验证的，分布模式与iln中的marco 巨噬细胞的分布模式完美匹配，但不与siglec-1 巨噬细胞共定位（图34和36）。相反，相比于k3-spg，k3在marco 和siglec-1 区域之间更广泛地分布（图35和36）。此外，tlr9缺陷和树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠显示相当的k3-spg共定位。为了确定这些巨噬细胞对k3-spg佐剂作用的贡献，检查了注射氯膦酸盐脂质体进入尾基部后巨噬细胞和dc的不同的恢复动力学。注射后，巨噬细胞在第2天完全耗竭。这些细胞没有恢复持续至少一周，而dc到第5天大部分恢复，如之前所报道的(aoshi,t.,等人.,immunity29,476-486(2008))。当巨噬细胞和dc均耗竭时，免疫应答显著抑制（图37；cloꢀ‑d2）。仅巨噬细胞而不是dc耗竭且免疫应答与未处理的小鼠中的那些相当（图37；clo–d5）。这将表明尽管ova和k3-spg在注射后主要被iln中的marco 巨噬细胞捕获，但巨噬细胞诱导适应性免疫应答。换言之，k3-spg的佐剂作用很大程度上依赖于dc群。[0214]6）k3-spg在体内靶向且强烈活化携带抗原的dc群。[0215]本发明人的发现表明尽管很大比例的纳米颗粒k3-spg在注射后被iln中的marco 巨噬细胞摄取，但佐剂作用似乎被dc所控制。聚焦于iln中被dc群的抗原和佐剂摄取。注射后24小时，通过流式细胞术分析dc群的抗原和佐剂摄取。三个dc亚群(pdcs,cd8α dcs和cd8α-dcs)中cpg阳性频率在k3-spg注射后比用k3注射后显著增加。相反，ova阳性dc频率在k3和k3-spg注射后相当。当聚焦于抗原和佐剂阳性的dc时，对于k3-spg相对于k3存在实质增加。iln中的pdc和cd8α dcs均被k3-spg而非k3在注射后24小时强烈活化，且这完全依赖于tlr9（图38）。这些结果表明pdcs和cd8α dcs有限捕获纳米颗粒k3-spg而非非颗粒k3用于成熟，和实施佐剂作用。[0216]7）k3-spg是鼠和非人灵长类动物模型中用于流感疫苗的有效佐剂。[0217]通过使用在小鼠和非人灵长类动物中的更多临床相关的流感接种模型来检查k3-spg的佐剂作用。当用醚处理的血凝素抗原富集的无病毒体的裂解疫苗（sv）加所示佐剂免疫小鼠时，当比较抗体应答和t细胞应答时，k3-spg证实比k3更优秀的佐剂作用（图43）。更重要的是，sv加k3-spg免疫导致100倍更高的抗体应答，甚至与用完全（病毒体）灭活疫苗（wiv）(0.2μg/小鼠)（图39）接种相比时，所述灭活疫苗包含病毒rna作为内置佐剂(builtinadjuvant)(koyama,s.,等人.,sciencetranslationalmedicine2,25ra24(2010))。用sv(0.1μg/小鼠)和k3-spg免疫的小鼠展示比wiv免疫的小鼠更低的体重降低（图40）。显著地，k3-spg赋予针对致死的pr8病毒攻击100％的保护，而以该剂量仅10％的wiv接种的小鼠存活（图40）。这些结果强烈支持这一概念，即k3-spg作为鼠模型中蛋白或基于蛋白的疫苗的有效佐剂起效，促使本发明人扩展这一发现至使用食蟹猴的非人灵长类动物模型。每组三只食蟹猴用sv加k3或k3-spg在第0和14天免疫。血清抗体滴度随后监测持续8周。sv加k3-spg诱导在免疫后2周时显著更高的抗体滴度，且滴度水平保持高位持续至少再6周（图41）。免疫后2年（110周）时，k3-spg组比k3组具有显著更高的抗体滴度（图42和43）。总之，这些结果表明k3-spg在非人灵长类动物模型中是卓越的疫苗佐剂。[0218]8）使用人pbmc的k3-lnt和k3-spg复合体的炎症应答诱导能力的研究。[0219]使用人pbmc(lonza,目录号cc-2702,批次号0000396517)，评价单独的k3(k3-da30、k3-da35、k3-da40)、k3-lnt复合体(k3-da30-lnt、k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-lnt)诱导pan-ifn-a(hifna)和il-6(hil-6)的产生的能力。[0220]结果显示于图44中。当以低剂量刺激时，相比于单独的k3，用k3-spg（其为k3和spg的复合体）和k3-lnt（其为k3和lnt的复合体）的pan-ifn-a和il-6的产生更高。此外，由具有不同da尾长度（da30、da35、da40）的k3-lnt诱导的炎症细胞因子可生产性被指出可能几乎相同。此外，当比较k3-spg和k3-lnt的炎症细胞因子可生产性时，k3-lnt的pan-ifn-a产生的可诱导性被指出可能比k3-spg的更高。另一方面，k3-spg和k3-lnt发现在il-6产生中相等。[0221]9）用添加有k3-lnt和k3-spg复合体的rsvf亚单位疫苗接种的小鼠血清中的rsvf抗原特异性igg抗体滴度。[0222]将7周龄的c57bl/6小鼠在尾基部用rsvf抗原(0.5μg)和各种佐剂(10μg)(单独的k3(k3-da30、k3-da35、k3-da40)、k3-lnt复合体(k3-da30-lnt、k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-spg)、磷酸铝(alumphosphate))每只小鼠以2周间隔免疫两次。最终免疫后一周时，回收外周血并制备血清，其用作评价样品。使用elisa方法测量血清中结合rsvf疫苗抗原的抗体的滴度。如图45中所示，rsvf抗原特异性总igg诱导相比于单独的rsvf抗原接种组（f）通过添加佐剂而得到增强，其表明单独的k3(f k3-da30、f k3-da35、f k3-da40)、k3-lnt(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(f k3-da40-spg)和磷酸铝(f alum)的佐剂作用可能是相同的。在接种由磷酸铝(f alum)的小鼠组中，其为th2佐剂，发现igg1子类诱导能力比单独的rsvf抗原接种组更高。另一方面，结果显示接种有单独的k3(f k3-da30、f k3-da35、f k3-da40)、k3-lnt(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)、k3-spg(f k3-da40-spg)的免疫组在igg2c子类抗体中比用磷酸铝(f alum)的组更高，其表明k3-lnt复合体可以是如k3-spg的th1佐剂。[0223]10）用添加有k3-lnt和k3-spg复合体的rsvf亚单位疫苗接种的小鼠中的rsvf抗原特异性细胞因子产生能力。[0224]将7周龄的c57bl/6小鼠在尾基部用rsvf抗原(0.5μg)和各种佐剂(10μg)(单独的k3(k3-da30、k3-da35、k3-da40)、k3-lnt(k3-da30-lnt、k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-spg)、磷酸铝(alumphosphate))每只小鼠以2周间隔免疫两次。最终免疫后一周时，回收脾，并制备脾细胞。将接种在96孔培养板中的脾细胞用mhci类限制性表位肽、mhcii类限制性表位肽和rsvf抗原的疫苗抗原蛋白刺激，并培养24小时或48小时。通过细胞因子elisa方法并使用培养上清液作为样品评价rsvf特异性细胞因子产生能力。在该研究中，评价三类细胞因子（ifn-g，其为th1细胞因子；il-2，其产生自活化的t细胞；和il-3，其为th2细胞因子）。[0225]结果是，如图46中所示，表明对ifn-g产生和il-2产生的rsvf抗原特异性诱导的增强作用在k3-lnt(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)和k3-spg(f k3-da40-spg)中是相同的。在磷酸铝佐剂（th2佐剂）接种组（f alum）中，ifn-g产生低于通过任何刺激的检测限水平。另一方面，il-13产生增强作用在磷酸铝（th2佐剂）接种组中高而在k3-spg（th1佐剂）接种组中低。有趣的是，在k3-lnt接种组(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)中，对il-13产生的增强作用相比于相同的th1佐剂（k3-spg）接种组(f k3-da40-spg)高。因此，这表明k3-lnt复合体具有除了由k3-spg具有的高th1应答增强作用外的th2应答增强能力。[0226]11）用添加有k3-lnt和k3-spg的rsvf亚单位疫苗接种的棉鼠中针对rsv感染的保护性作用。[0227]将6至7周龄的棉鼠在尾基部用rsvf抗原(1μg)和各种佐剂(10μg)(k3-lnt(k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-spg)、磷酸铝(alumphosphate))每只小鼠以2周间隔免疫两次。最终免疫后两周时，将棉鼠通过经鼻接种用rsv血清型a（长链）进行攻击，并在3天后测量肺内病毒量。synagis（帕利珠单抗）施用组在攻击感染前一天肌内施用有synagis（2.5mg/kg），且以如上相同方式评价感染保护性能力。攻击感染前立即在麻醉下从大鼠的颈静脉收集血液样品并使用所获血清研究中和抗体滴度。[0228]肺内病毒量的结果显示于图47的左侧，且中和抗体滴度的结果显示于该图右侧。肺内病毒量的结果揭示在pbs施用组中观察到约105pfu/肺的病毒量，而在施用添加有磷酸铝的rsvf疫苗（f alum）的组中抑制至低约100倍的病毒量（平均值）。另一方面，诱导保护免于感染的活性也在添加k3-spg的疫苗施用组(f k3-da40-spg)中观察到。添加k3-lnt的疫苗组(f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)显示对感染的最佳保护作用，因此表明成为新颖的疫苗佐剂候选的可能性，其相比于磷酸铝和k3-spg有助于高感染防御能力。[0229]至于中和抗体诱导能力，在添加磷酸铝的疫苗施用组（f alum）中观察到等于synagis的血液中的中和能力。另一方面由于在k3-spg添加的疫苗施用组(f k3-da40-spg)中的4只大鼠中的3只中几乎没有诱导中和抗体，因此认为k3-spg产生的感染保护作用源自中和抗体不依赖的机制。此外，由于相比于k3-spg，在k3-lnt施用组(f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)发现高中和抗体，因此表明k3-lnt佐剂可以具有与k3-spg的不同的特性，例如，th2应答增强能力。[0230]产业实用性本发明提供具有优秀的免疫刺激活性的寡脱氧核苷酸和包含其的复合体。具体而言，本发明的复合体同时具有针对k型cpgodn独特的免疫刺激活性和针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性。此外，k3-spg和k3-lnt具有强疫苗佐剂活性，并且用k3-spg或k3-lnt连同抗原的免疫刺激抗原特异性体液免疫和细胞免疫两者。因此，本发明的复合体可用作药物领域中的免疫刺激剂或疫苗佐剂。[0231]本技术基于在日本提交的专利申请号2013-196206（申请日：2013年9月20日），其内容完整并入本文。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：2.本发明涉及具有免疫刺激活性的包含寡核苷酸的复合体及其用途。更具体而言，本发明涉及包含具有免疫刺激活性的cpg寡脱氧核苷酸（odn）和β-葡聚糖的复合体及其药物用途。
背景技术：
：：3.cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）是包含免疫刺激cpg基序的短的（约20个碱基对）、单链的合成dna片段，是toll样受体9（tlr9）的有效激动剂，活化树突细胞（dc）和b细胞以产生i型干扰素（ifn）和炎性细胞因子（非专利文件1、2），并且作为对于th1型体液和细胞免疫应答（包括细胞毒性t淋巴细胞（ctl）应答）的佐剂（非专利文件3、4）。因此，cpgodn已假定为针对传染病、癌症、哮喘和花粉症的可能的免疫治疗剂（非专利文件2、5）。4.存在至少四种类型的cpgodn，其每一种具有不同的骨架、序列和免疫刺激特性（非专利文件6）。d（也称为a）型cpgodn通常包含具有磷酸二酯（po）骨架和硫代磷酸酯（ps）多g尾的一个回文cpg基序，其活化类浆细胞dc（pdc）以产生大量的ifn-α，但无法诱导pdc成熟和b细胞活化（非专利文件7、8）。其他三类odn由ps骨架组成。k（也称为b）型cpgodn含有非回文的多cpg基序，并且强烈活化b细胞以产生il-6和pdc以成熟，但几乎不产生ifn-α（非专利文件8、9）。近期，c和p型cpgodn已被开发；这些分别含有一个和两个回文cpg序列，其两个均可以如k型活化b细胞和如d型活化pdc，尽管相比于p型cpgodn，c型cpgodn诱导较弱的ifn-α产生（非专利文件10-12）。许多优秀的k型cpgodn描述于专利文件1中。5.d和p型cpgodn已显示形成高级结构hoogsteen碱基配对以分别形成称为g四联体(tetrad)的平行四倍结构和顺式和反式回文部分之间的沃森克里克碱基配对，其对于通过pdc的活跃的ifn-α产生是必需的（非专利文件12-14）。尽管此类更高级结构似乎对于定位至早期内体和经tlr9的信号传导是必需的，但它们受制于产物多态性、聚集和沉淀，因而阻碍了其临床应用（非专利文件15）。因此，仅k和c型cpgodn通常可用作免疫治疗剂和疫苗佐剂用于人使用（非专利文件16和17）。虽然k型cpgodn在人临床试验中增强靶向传染病和癌症的疫苗的免疫原性（非专利文件6、16），但抗原和k型cpgodn之间的化学和物理结合对于最优佐剂效应是必需的。这些结果表明这四种（k、d、p和c）类型的cpgodn具有优点和缺点，然而开发活化b细胞和pdc两者而无聚集的“一体化（all-in-one）”cpgodn尚未完成。6.裂褶菌多糖（spg），一种来源于裂褶菌(schizophyllumcommune)的可溶性β-1,3-葡聚糖，是在日本被批准作为宫颈癌患者的放疗增强剂的药物，持续最近三十年（非专利文件18）。类似地，香菇多糖（lnt），一种来源于香菇的可溶性β-1,3-葡聚糖，是于1985年批准的药物，且与氟嘧啶药物组合使用，用于无法实施手术的和复发性胃癌患者（非专利文件19、20）。β-1,3-葡聚糖已显示与多脱氧腺苷酸（da）形成作为三链螺旋结构的复合体（非专d.m.cpgdnaasavaccineadjuvant.expertreviewofvaccines10,499-511(2011).非专利文件17：mchutchison,j.g.,等人.phase1b,randomized,double-blind,dose-escalationtrialofcpg10101inpatientswithchronichepatitiscvirus.hepatology46,1341-1349(2007).非专利文件18：okamura,k.,等人.clinicalevaluationofschizophyllancombinedwithirradiationinpatientswithcervicalcancer.arandomizedcontrolledstudy.cancer58,865-872(1986).非专利文件19：oba,k.;kobayashi,m.;matsui,t.;kodera,y.;sakamoto,j.individualpatientbasedmeta-analysisoflentinanforunresectable/recurrentgastriccancer.anticancerres.,2009,29,2739-2746.非专利文件20：nakano,h.;namatame,k.;nemoto,h.;motohashi,h.;nishiyama,k.;kumada,k.amulti-institutionalprospectivestudyoflentinaninadvancedgastriccancerpatientswithunresectableandrecurrentdiseases:effectonprolongationofsurvivalandimprovementofqualityoflife.hepato-gastroenterol.,1999,46,2662-2668.非专利文件21：sakurai,k.,mizu,m.&shinkai,s.polysaccharide-polynucleotidecomplexes.2.complementarypolynucleotidemimicbehaviorofthenaturalpolysaccharideschizophyllaninthemacromolecularcomplexwithsingle-strandedrnaanddna.biomacromolecules2,641-650(2001).非专利文件22：shimada,n.,等人.apolysaccharidecarriertoeffectivelydelivernativephosphodiestercpgdnatoantigen-presentingcells.bioconjugatechemistry18,1280-1286(2007).非专利文件23：koyama,s.,等人.plasmacytoiddendriticcellsdelineateimmunogenicityofinfluenzavaccinesubtypes.sciencetranslationalmedicine2,25ra24(2010).非专利文件24：minari,j.,等人.enhancedcytokinesecretionfromprimarymacrophagesduetodectin-1mediateduptakeofcpgdna/beta-1,3-glucancomplex.bioconjugatechemistry22,9-15(2011)。技术实现要素：13.本发明要解决问题本发明要解决的问题是提供比常规cpg-odn复合体具有更强活性的免疫刺激剂。14.解决问题的方法本发明人已进行大量研究并鉴定了包含在3‘端具有多（da）尾的k型cpgodn(k3)(seqidno:2)和spg的新颖的复合体，即k3-spg。其形成可以完全溶解的高级纳米颗粒。类似地，本发明也已成功生产包含上述k型cpgodn和香菇多糖（lnt）的新颖的复合体k3-lnt。尽管k3-spg和k3-lnt不具有d型cpgodn序列，但它同时具有对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性），和对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞以产生ifn-α的活性）。此外，k3-lnt和k3-spg具有有效的疫苗佐剂活性和，当与抗原一同接种用于免疫时，它们诱导抗原特异性体液免疫和细胞免疫，且的确显示针对rsv病毒和流感病毒的非常有效的感染保护性作用。他们基于这些发现进一步研究并完成本发明。15.因此，本发明提供了以下：[1]包含人源化k型cpg寡脱氧核苷酸和多脱氧腺苷酸的寡脱氧核苷酸，其中所述多脱氧腺苷酸位于人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸的3'侧。[0016][2][1]的寡脱氧核苷酸，其中所述人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸具有不小于10个核苷酸的长度，且包含由下式代表的核苷酸序列：其中中心的cpg基序未甲基化，w是a或t，且n1、n2、n3、n4、n5和n6可以是任何核苷酸。[0017][3][1]或[2]的寡脱氧核苷酸，其中所述人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸由seqidno:1显示的核苷酸序列组成。[0018][4][1]-[3]中任一项的寡脱氧核苷酸，其中所述寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键部分或整体被硫代磷酸酯键取代。[0019][5][4]寡脱氧核苷酸，其中所述寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键整体被硫代磷酸酯键取代。[0020][6][1]-[5]中任一项的寡脱氧核苷酸，其中所述多脱氧腺苷酸具有20-60个核苷酸的长度。[0021][7]包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的复合体。[0022][8][7]的复合体，其中所述β-1,3-葡聚糖是香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖或昆布多糖。[0023][9][8]的复合体，其中所述β-1,3-葡聚糖是香菇多糖、裂褶菌多糖或硬葡聚糖。[0024][10]由以下（i）中所述的寡脱氧核苷酸和（ii）中所述的β-1,3-葡聚糖组成的复合体：（i）寡脱氧核苷酸，其中长度20-60个核苷酸的多脱氧腺苷酸在由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'端结合，且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代（ii）香菇多糖或裂褶菌多糖。[0025][11][7]-[10]中任一项的复合体，其具有三链螺旋结构。[0026][12][7]-[11]中任一项的复合体，其具有活化b细胞以产生il-6的活性和活化树突细胞以产生ifn-α的活性。[0027][13]药物组合物，其包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0028][14][13]的药物组合物，其用于预防或治疗病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染。[0029][15][14]的药物组合物，其用于预防或治疗病毒感染。[0030][16][15]的药物组合物，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0031][17]用于诱导产生i型和/或ii型干扰素的药剂，其包含[7]-[12]中任一项的复合体。[0032][18]免疫刺激剂，其包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0033][19][18]的免疫刺激剂，其为疫苗佐剂。[0034][20]用于病毒感染、癌症、变应性疾病、或细胞内寄生性原生动物或细菌感染的预防剂或治疗剂，其包含[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0035][21][20]的预防剂或治疗剂，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0036][22][1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体用于生产药物组合物的用途。[0037][23][22]的用途，其中所述药物组合物为用于预防或治疗病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染的药物组合物。[0038][24][23]的用途，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0039][25]用于治疗或预防温血动物中的疾病的方法，其包括向所述温血动物施用药学上有效量的[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0040][26][25]的方法，其中所述疾病为病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染。[0041][27][26]的方法，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0042][28][25]-[27]中任一项的方法，其中所述温血动物是人。[0043][29]在温血动物中诱导保护性免疫反应的方法，其包括向所述温血动物施用药学上有效量的[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体。[0044][30][1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体，其用于治疗或预防病毒感染、癌症、变应性疾病或细胞内寄生性原生动物或细菌感染。[0045][31][30]的寡脱氧核苷酸或复合体，其中所述病毒感染是rs病毒或流感病毒感染。[0046][32]药物组合物，其包含（a）[1]-[6]中任一项的寡脱氧核苷酸或[7]-[12]中任一项的复合体，和（b）抗原。[0047][33][32]的组合物，其用于诱导针对抗原的免疫反应。[0048][34][33]的组合物，其中所述抗原来源于病原体。[0049][35][34]的组合物，其用于预防或治疗病原体感染。[0050][36][35]的组合物，其中所述病原体是病毒。[0051][37][36]的组合物，其中所述病毒是rs病毒或流感病毒。[0052]发明效果本发明提供具有优秀的免疫刺激活性的寡脱氧核苷酸和包含其的复合体。具体而言，本发明的复合体同时具有针对k型cpgodn独特的免疫刺激活性和针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性。此外，由于本发明的复合体具有强疫苗佐剂活性，当本方面的复合体与抗原一同进行免疫时，刺激抗原特异性体液免疫和细胞免疫两者以提供高度的强感染保护作用。因此，本发明的复合体可用作免疫刺激剂或疫苗佐剂。附图说明[0053]图1显示cpgodn和lnt或spg的络合方法。[0054]图2显示通过pbmc的pan-ifn-α产生。[0055]图3显示从用k3、k3-da40或k3-spg刺激人pbmc产生的细胞因子的概况。[0056]图4显示k3-spg的扫描电子显微镜图像。[0057]图5显示如由动态光散射分析的k3-spg、spg和d35的颗粒大小。[0058]图6显示通过用k3、k3-spg或d35刺激诱导pbmc产生pan-ifn-α、-ifn-α2和ifn-γ。[0059]图7显示由人pbmc产生pan-ifn-α和il-6，其由用k3、k3-da40、k3-spg、cpg21798（p型cpgodn）、cpg21889(p)、cpg2395(c)或m362(c)(0.74、2.2、6.6或20μg/ml)刺激产生。[0060]图8显示k3-spg与含k型cpgodn的内体的共定位。比例尺显示10μm。结果代表至少两个独立实验。[0061]图9显示k3-spg与含d型cpgodn的内体的共定位。比例尺显示10μm。[0062]图10显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0063]图11显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。[0064]图12显示通过用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫诱导的ova特异性cd8t细胞的比例。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0065]图13显示通过用单独的ova、ova k3、ova k3-da40或ova k3-spg免疫诱导的体内ova特异性ctl活性。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0066]图14显示k3-spg的肽疫苗佐剂作用。[0067]图15显示k3-spg的剂量依赖性佐剂作用。[0068]图16显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。免疫时的ova剂量显示在每一图上。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0069]图17显示用单独的ova、ova k3或ova k3-spg免疫的小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。免疫时的ova剂量显示在每一图上。[0070]图18显示spg对空（载体）、树突状细胞相关性c型植物血凝素-1(dectin-1)、或树突状细胞相关性c型植物血凝素-2(dectin-2)转染子的结合。[0071]图19显示k3或k3-spg对空（载体）、树突状细胞相关性c型植物血凝素-1、或树突状细胞相关性c型植物血凝素-2转染子的结合。[0072]图20显示c57bl/6j小鼠或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞的tnf-α产生，其通过酵母聚糖耗竭刺激诱导。[0073]图21显示c57bl/6j小鼠或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞的tnf-α产生，其通过spg刺激诱导。[0074]图22显示酵母聚糖耗竭对c57bl/6j小鼠或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞的tnf-α产生的影响，其通过cpgodn刺激诱导。*p《0.05(t-检验)。[0075]图23显示spg对c57bl/6j小鼠的脾细胞的tnf-α产生的影响，其通过cpgodn刺激诱导。[0076]图24显示由k3-spg诱导的细胞因子产生依赖于tlr9。a）由fl-dc的ifn-α产生，b）由脾细胞的il-6和il-20p40产生，c）由fl-dc的ifn-α产生，d）由脾细胞的il-6和il-12p40产生。[0077]图25显示用ova k3-spg免疫的tlr9 / 或tlr9-/-小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0078]图26显示用ova k3-spg免疫的tlr9 / 或tlr9-/-小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0079]图27显示用ova k3-spg免疫tlr9 / 或tlr9-/-小鼠诱导的ova特异性cd8t细胞的比例。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0080]图28显示k3-spg的佐剂作用不依赖于树突状细胞相关性c型植物血凝素-1。a）血清中的抗原特异性抗体滴度。b）由于抗原再刺激的由脾细胞的ifn-γ产生。c）体内诱导的抗原特异性的cd8t细胞的比例。[0081]图29显示用ova k3-spg免疫的树突状细胞相关性c型植物血凝素-1 /-或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1ꢀ‑/-小鼠的抗原特异性血清抗体滴度。[0082]图30显示用ova k3-spg免疫的树突状细胞相关性c型植物血凝素-1 / 或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1ꢀ‑/-小鼠的脾细胞的ifnγ产生，其通过用抗原再刺激诱导。[0083]图31显示用ova k3-spg免疫树突状细胞相关性c型植物血凝素-1 / 或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1-/-小鼠诱导的ova特异性cd8t细胞的比例。*p《0.05(mann-whitneyu检验)。[0084]图32显示施用alexa488-k3-spg后1小时时k3-spg在iln表面上的定位。[0085]图33显示施用dq-ova后1小时时ova、marco 细胞和siglec-1 细胞在iln中的定位。[0086]图34显示通过速度（volocity）的图33中的ova与marco 细胞或siglec-1 细胞共定位的分析结果。*p《0.05(t-检验)。[0087]图35显示施用alexa488-k3或alexa488-k3-spg后1小时时k3、k3-spg和marco 细胞在iln中的定位。[0088]图36显示通过速度（volocity）的图35中的k3或k3-spg与marco 细胞共定位的分析结果。*p《0.05(t-检验)。[0089]图37显示用氯膦酸盐脂质体的耗竭实验方案（上图）、血清中抗原特异性抗体滴度（左下图）和通过抗原刺激的细胞因子产生。*p《0.05(t-检验)。[0090]图38显示在施用有k3或k3-spg的c57bl/6j或tlr9-/-小鼠的各种dc中的cd40表达。[0091]图39显示在用sv、wiv或sv k3-spg免疫的小鼠血清中的抗原特异性抗体滴度。[0092]图40显示当用sv、wiv或sv k3-spg免疫随后通过用流感病毒a/p/r8（h1n1）攻击时的体重的时间过程变化（左）和存活曲线（右）。[0093]图41显示在用sv k3或sv k3-spg免疫的食蟹猴（macacafascicularis）血清中的抗原特异性血清抗体滴度的时间过程变化。*p《0.05(t-检验)。[0094]图42显示在用sv k3或sv k3-spg免疫的食蟹猴血清中的抗原特异性血清抗体滴度（在第110周）。[0095]图43显示k3和k3-spg之间的疫苗佐剂作用的比较。[0096]图44显示通过k3、k3-lnt或k3-spg的pan-ifn-a产生的il-6产生。[0097]图45显示接种有添加k3、k3-lnt或k3-spg的rsvf亚单位疫苗的小鼠血清中的rsvf抗原特异性igg抗体滴度。[0098]图46显示接种有添加k3、k3-lnt或k3-spg的rsvf亚单位疫苗的小鼠中由rsvf抗原刺激特异性诱导的细胞因子产生。[0099]图47显示接种有添加k3或k3-lnt或k3-spg的rsvf亚单位疫苗的棉鼠中的rsv感染保护作用。具体实施方式[0100]1.寡脱氧核苷酸本发明提供包含k型cpg寡脱氧核苷酸和多脱氧腺苷酸（da）的寡脱氧核苷酸（下文中称为本发明的寡脱氧核苷酸）。[0101]本发明的寡脱氧核苷酸包括其中修饰磷酸二酯键（例如，一部分或所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代）的寡脱氧核苷酸。[0102]本发明的寡脱氧核苷酸包括药学上可接受的盐。[0103]在本说明书中，寡脱氧核苷酸和odn含义相同。此外，“人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）”和“人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）残基”含义相同，而与结尾处术语“残基”存在与否无关，且可互换使用。此外，多脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylate）和多脱氧腺苷酸（polydeoxyadenosineacid）（残基）含义相同。术语“残基”意指具有更高分子量的化合物的部分结构。本领域技术人员可以容易地从上下文中理解本说明书中的“人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）”是否意指独立分子或具有更高分子量的化合物的部分结构。这同样适用于关于本发明的寡脱氧核苷酸中包含的其他部分结构的术语，诸如“多脱氧腺苷酸”等等。[0104]cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）是含有免疫刺激性非甲基化cpg基序的单链dna且是tlr9激动剂。cpgodn包括4种类型：k型（也称为b型）、d型（也称为a型）、c型和p型，其在骨架、序列和免疫刺激特性上有所不同(advanceddrugdeliveryreviews61,195-204(2009))。其中，本发明寡脱氧核苷酸包含k型cpgodn。[0105]k型cpgodn是具有这样的结构和功能特性的cpgodn，其通常含有非回文、多个非甲基化的cpg基序，活化b细胞以产生il-6，但几乎不诱导由浆细胞样树突细胞（pdc）的ifn-α产生。非甲基化cpg基序是含有至少一个胞嘧啶（c）-鸟嘌呤（g）序列的段的核苷酸序列，其中胞嘧啶-鸟嘌呤序列中胞嘧啶的5-位置未甲基化。在以下解释中，除非另有具体说明，cpg意指非甲基化cpg。因此，本发明的寡脱氧核苷酸通过包含k型cpgodn具有针对k型cpgodn的独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性）。许多人源化的k型cpgodn在相关
技术领域：
：中是已知的(journalofimmunology166,2372-2377(2001);journalofimmunology164,944-953(2000);us8,030,285b2)。[0106]包含在本发明的寡脱氧核苷酸中的k型cpgodn优选是人源化的。“人源化的”意指其具有人tlr9的激动剂活性。因此，本发明的包含k型cpgodn的寡脱氧核苷酸具有对于人的免疫刺激活性，其对于k型cpgodn是独特的（例如，活化人b细胞以产生il-6的活性）。[0107]本发明中优选使用的k型cpgodn具有不小于10个核苷酸的长度，且包含由下式代表的核苷酸序列：其中中心的cpg基序未甲基化，w是a或t，且n1、n2、n3、n4、n5和n6可以是任何核苷酸。[0108]在一个实施方案中，本发明中的k型cpgodn具有不小于10个核苷酸的长度，且包含由上述式代表的核苷酸序列。在上述式中，中心的4个碱基的cpg基序仅需要被包含在10个核苷酸中，且不需要位于上述式中的n3和n4之间。此外，上述式中的n1、n2、n3、n4、n5和n6可以是任何核苷酸，且n1和n2、n2和n3、n3和n4、n4和n5,和n5和n6的至少一种（优选一种）的组合可以形成2碱基cpg基序。当具有4个碱基的上述cpg基序不位于之间时，上述式中心中的4个碱基（第4至第7碱基）中任何2个连续碱基为cpg基序，且其余2个碱基可以是任何核苷酸。[0109]本发明中更优选使用的k型cpgodn包含含有一个或多个cpg基序的非回文结构。本发明中进一步优选使用的k型cpgodn由含有一个或多个cpg基序的非回文结构组成。[0110]人源化的k型cpgodn通常特征在于由tcga或tcgt的4个碱基组成的cpg基序。在许多情况下，4碱基cpg基序的2个或3个包含在人源化的k型cpgodn中。因此，在优选的实施方案中，包含在本发明的寡脱氧核苷酸中的k型cpgodn包含由tcga或tcgt组成的4碱基cpg基序中至少一个、更优选两个或更多、进一步优选2或3个。当k型cpgodn具有4碱基cpg基序中的2个或3个时，这些4碱基cpg基序可以是相同的或不同的，且不特别限定，只要其具有针对人tlr9的激动剂活性。[0111]包含在本发明的寡脱氧核苷酸中的k型cpgodn更优选包含由seqidno:1显示的核苷酸序列。[0112]尽管k型cpgodn的长度没有特别限定只要本发明的寡脱氧核苷酸具有免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选人b细胞）以产生il-6的活性），但其优选长度不多于100个核苷酸（例如，长度10-75个核苷酸）。k型cpgodn的长度更优选长度不多于50个核苷酸（例如长度10-40个核苷酸）。k型cpgodn的长度更优选长度不多于30个核苷酸（例如长度10-25个核苷酸）。k型cpgodn的长度最优选为长度12-25个核苷酸。[0113]尽管多脱氧腺苷酸（da）的长度并无具体限制只要其足以形成与β-1,3-葡聚糖（优选地，香菇多糖或裂褶菌多糖）链的三链螺旋结构，但从形成稳定的三链螺旋结构的方面而言，其通常长度不小于20个核苷酸，优选长度不小于40个核苷酸，进一步优选长度不小于60个核苷酸。理论上，多da不具有长度上限，因为更长的多da与β-1,3-葡聚糖形成更稳定的三链螺旋结构。然而，当其太长时，寡脱氧核苷酸长度在合成时变化。因此，其通常长度不多于100个、优选不多于80个核苷酸。在另一方面，从上述的稳定的三链螺旋结构的形成、以及每单位量的β-1,3-葡聚糖结合的本发明的寡脱氧核苷酸的量中的增加、避免寡脱氧核苷酸合成时长度变化、和络合效率的方面而言，多da的长度优选为长度20-60个核苷酸（具体而言，长度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸），更优选长度30-50个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸），最优选长度30-45个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸）。具体而言，当其不小于30个核苷酸长度时，实现良好的络合效率。包含多da的本发明的寡脱氧核苷酸具有与两个裂褶菌多糖链形成三链螺旋结构的活性。注意多脱氧腺苷酸有时表示为“多（da）”或“多（da）”。[0114]尽管本发明的寡脱氧核苷酸的一个分子可以包含多个k型cpgodn和/或多da，但其优选含有k型cpgodn和多da各一个，最优选由k型cpgodn和多da各一个组成。[0115]本发明的寡脱氧核苷酸特征在于多da位于k型cpgodn的3'侧。通过这种排列，本发明的复合体（下文详述）变得具有针对k型cpgodn独特的免疫刺激活性和针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性。[0116]k型cpgodn和多da可以通过共价键直接连接，或经间隔序列连接。间隔序列意指在两个相邻构成要素之间插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。尽管间隔序列的长度并无具体限定，只要本发明的复合体具有免疫活性（优选地，活化b细胞以产生il-6的活性，和活化树突细胞以产生ifn-α的活性），但其通常长度为1-10个核苷酸，优选长度1-5个核苷酸，更优选长度1-3个核苷酸。最优选地，k型cpgodn和多da通过共价直接连接。[0117]本发明的寡脱氧核苷酸任选除了k型cpgodn、多da和任选的间隔序列外还具有在其5'端和/或3'端的额外的核苷酸序列。尽管额外的核苷酸序列的长度并无具体限定，只要本发明的复合体具有免疫活性（优选地，活化b细胞以产生il-6的活性，和活化树突细胞以产生ifn-α的活性），但其通常长度为1-10个核苷酸，优选长度1-5个核苷酸，更优选长度1-3个核苷酸。[0118]在优选的实施方案中，本发明的寡脱氧核苷酸在5'端和/或3'端不包含此类额外的核苷酸序列。即，本发明的寡脱氧核苷酸优选由k型cpgodn、多da和任选的间隔序列组成，更优选由k型cpgodn和多da组成。[0119]在最优选的实施方案中，本发明的寡脱氧核苷酸由k型cpgodn（具体而言，例如，由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸）和多da组成，其中k型cpgodn位于寡脱氧核苷酸的5'端且多da位于其3'端。具体而言，它是这样的寡脱氧核苷酸，其中长度20-60个核苷酸（更优选地，长度30-50个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸），最优选地，长度30-45个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸））的多da在由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'端结合，例如由seqidno:2或9-12显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸。[0120]本发明的全长寡脱氧核苷酸通常长度30-200个核苷酸，优选长度35-100个核苷酸，更优选长度40-80个核苷酸（具体而言，长度40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸），进一步优选长度50-70个核苷酸（具体而言，长度50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个核苷酸），最优选长度50-65个核苷酸（具体而言，长度50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65个核苷酸）。[0121]本发明的寡脱氧核苷酸可以合适地修饰以对体内降解（例如，由外切核酸酶或内切核酸酶降解）有抗性。优选地，修饰包括硫代磷酸酯修饰和二硫代磷酸酯修饰。即，本发明的寡脱氧核苷酸中的部分或所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键所取代。[0122]优选地，本发明的寡脱氧核苷酸包括硫酸二酯键的修饰，更优选地，磷酸二酯键的修饰是硫代磷酸酯键（即，如wo95/26204中所述，非交联氧原子之一被硫原子取代）。即，本发明的寡脱氧核苷酸中的部分或所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键所取代。[0123]本发明的寡脱氧核苷酸优选包含在k型cpgodn中硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的修饰，更优选地，k型cpgodn中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代。而且，本发明的寡脱氧核苷酸优选包含在多da中硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键，更优选地，多da中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代。进一步优选地，包含人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸和多脱氧腺苷酸的本发明的寡脱氧核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。最优选地，本发明的寡脱氧核苷酸是这样的寡脱氧核苷酸，其中长度20-60个核苷酸（更优选地，长度30-50个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸），最优选地，长度30-45个核苷酸（长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸））的多da结合到人源化的k型cpg寡脱氧核苷酸(例如、seqidno:1)的3'端，且包含在寡脱氧核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键所取代。由于硫代磷酸酯键，本发明的寡脱氧核苷酸预期不仅显示对降解的抗性而且还显示免疫刺激活性的增强（例如，活化b细胞以产生il-6的活性）和cpg-β-1,3-葡聚糖复合体的高产量。在本发明中，硫代磷酸酯键与硫代磷酸酯骨架含义相同，且磷酸二酯键与磷酸骨架含义相同。[0124]本发明的寡脱氧核苷酸包括上述寡脱氧核苷酸的任何药学上可接受的盐、酯、和此类酯的盐。[0125]本发明的寡脱氧核苷酸的药学上可接受的盐的优选实例包括金属盐诸如碱金属盐（例如钠盐、钾盐和锂盐）、碱土金属盐（例如钙盐和镁盐）、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；胺盐诸如无机盐（例如铵盐）和有机盐（例如，叔辛基胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n’‑二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三（羟甲基）氨基甲烷盐）等；无机酸盐诸如卤代氢酸盐（例如，氢氟化物、氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物）、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐诸如链烷磺酸盐（例如，甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐），芳基磺酸盐（例如，苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐）、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；和氨基酸盐如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。[0126]尽管本发明的寡脱氧核苷酸可以采用单链、双链和三链的任何形式，但其优选是单链。[0127]优选分离本发明的寡脱氧核苷酸。“分离的”意指已进行去除除了目标组分外的因子的操作，且寡脱氧核苷酸不处于天然存在的状态。“分离的寡脱氧核苷酸”的纯度（评价目标产物总重量中目标寡脱氧核苷酸的重量百分比）通常不少于70％，优选不少于80％，更优选不少于90％，进一步优选不少于99％。[0128]由于本发明的寡脱氧核苷酸具有优秀的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选人b细胞）以产生il-6的活性），其可用作免疫刺激剂等。此外，由于本发明的寡脱氧核苷酸具有与两个β-1,3-葡聚糖（优选地，香菇多糖、裂褶菌多糖或硬葡聚糖）形成三链螺旋结构的特性，因此其可用于制备下文提及的本发明的复合体。[0129]2.复合体本发明提供包含上述的本发明的寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的复合体（下文称为本发明的复合体）。[0130]由于本发明的上述寡脱氧核苷酸包含k型cpgodn，但其自身显示对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性），且在对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞以产生ifn-α的活性）中是差的。然而，令人惊奇地，它通过与β-1,3-葡聚糖（优选地，香菇多糖或裂褶菌多糖）形成复合体而获得了针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞以产生ifn-α的活性），而不需d型cpgodn的序列。即，本发明的复合体具有对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性）和对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞（优选人浆细胞样树突细胞）以产生ifn-α的活性）两者。[0131]本发明中使用的β-1,3-葡聚糖的实例包括香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖、昆布多糖等。β-1,3-葡聚糖优选是包含许多1,6-吡喃葡萄糖苷分支（侧链率33-40%）的β-1,3-葡聚糖，诸如香菇多糖、裂褶菌多糖和硬葡聚糖，更优选香菇多糖或裂褶菌多糖，最优选香菇多糖。[0132]香菇多糖（lnt）是来源于香菇且具有(c6h10o5)n分子式和约300,000ꢀ–ꢀ700,000的分子量的已知的β-1,3-葡聚糖。尽管它难溶于水、甲醇、乙醇（95）和丙酮，但其可溶于极性有机溶剂（dmso）和氢氧化钠水溶液。[0133]香菇多糖具有增强活化的巨噬细胞、杀伤性t细胞、自然杀伤细胞和抗体依赖性巨噬细胞介导的细胞毒性（admc）活性的作用(hamuro,j.,等人.:immunology,39,551-559,1980,hamuro,j.,等人.:int.j.immunopharmacol.,2,171,1980,herlyn,d.,等人.:gann,76,37-42,1985)。在动物实验中，与化疗剂的组合施用显示对同系肿瘤和自体肿瘤的肿瘤生长抑制作用和延长生命的作用。而且，单独施用香菇多糖显示肿瘤生长抑制作用和延长生命作用。在临床试验中，与喃氟啶口服施用组合使用延长了无法做手术或复发性胃癌患者的存活周期（药品会诊(interview)形式“香菇多糖静脉内注射1mg”ajinomotoco.,inc.），且已在日本获得批准。单独施用香菇多糖的作用目前尚未证实。[0134]裂褶菌多糖（spg）是来源于裂褶菌的已知的可溶β-葡聚糖。spg由β-(1→3)-d-葡聚糖的主链和一个β-(1→6)-d-葡萄糖基侧链/3个葡萄糖组成(tabata,k.,ito,w.,kojima,t.,kawabata,s.和misakia.,ꢀ“carbohydr.res.”,1981,89,1,p.121-135)。spg已实际用作用于妇科癌症的免疫佐剂疗法的肌内注射制剂临床药物有20年或更久(shimizu,chin,hasumi,masubuchi,ꢀ“biotherapy”,1990,4,p.1390hasegawa,ꢀ“oncologyandchemotherapy”,1992,8,p.225)，且体内安全性已得到证实(theresa,m.mcintire和david,a.brant,ꢀ“j.am.chem.soc.”,1998,120,p.6909)。[0135]在本说明书中，“复合体”意指通过经非共价键或共价键诸如静电键、范德华键、氢键、疏水性相互作用等的多个分子结合获得的产物。[0136]本发明的复合体优选展示三链螺旋结构。在优选的实施方案中，形成三链螺旋结构的三个链中，两个为β-1,3-葡聚糖链，且一个为本发明的上述寡脱氧核苷酸中的多脱氧腺苷酸链。复合体可以包含没有形成三链螺旋结构的部分。[0137]本发明的复合体中寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的组成比例可以根据寡脱氧核苷酸中多脱氧腺苷酸的链长度、β-1,3-葡聚糖的长度等而改变。例如，当β-1,3-葡聚糖链和多脱氧腺苷酸的长度相同时，两个β-1,3-葡聚糖链和一个本发明的寡脱氧核苷酸可以结合以形成三链螺旋结构。通常，由于多脱氧腺苷酸的链长度比β-1,3-葡聚糖链长度短，因此本发明的多个寡脱氧核苷酸可以与两个β-1,3-葡聚糖链经多脱氧腺苷酸结合以形成三链螺旋结构（参见图1）。[0138]本发明的复合体是包含人源化的k型cpgodn和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖、昆布多糖）的复合体，优选为由人源化的k型cpgodn和β-1,3-葡聚糖（例如香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖）组成的复合体。更优选地，其是由寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖）组成的复合体（例如，k3-da20-60-lnt、k3-da20-60-spg），在所述寡脱氧核苷酸中长度20-60个核苷酸的多脱氧腺苷酸（具体而言，长度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸）结合到由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'侧，并且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代，进一步优选地，其是由寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖）组成的复合体(例如，k3-da30-50-lnt、k3-da30-50-spg)，在所述寡脱氧核苷酸中长度30-50个核苷酸（具体而言，长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸）的多脱氧腺苷酸结合到由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'侧，并且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代，最优选地，其是由寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖（例如，香菇多糖、裂褶菌多糖）组成的复合体(k3-da30-45-lnt、k3-da30-45-spg)，在所述寡脱氧核苷酸中长度30-45个核苷酸（具体而言，长度30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸）的多脱氧腺苷酸结合到由seqidno:1显示的核苷酸序列组成的寡脱氧核苷酸的3'侧，并且所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。[0139]本发明的复合体的制备方法可以在类似于非专利文件21-24和jp-a-2008-100919中描述的那些条件下进行。即，β-1,3-葡聚糖，其固有地天然存在作为三链螺旋结构，溶解于质子惰性的有机极性溶剂（二甲亚砜（dmso）、乙腈、丙酮等）或含水碱性溶液（氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氢氧化钙等）中以松散为单链。将由此获得的单链β-1,3-葡聚糖的溶液和本发明的寡脱氧核苷酸溶液（水溶液、近似中性ph的缓冲水溶液、或酸性缓冲水溶液，优选地，水溶液或近似中性ph的缓冲水溶液）混合，调整ph至近似中性ph（需要时），且将混合物维持合适时间，例如，5℃下过夜。结果是，两个β-1,3-葡聚糖链和寡脱氧核苷酸中的多da链形成三链螺旋结构，由此可以形成本发明的复合体。所获的复合体可以通过尺寸排阻层析、超滤、透析等进行纯化以去除没有形成复合体的寡脱氧核苷酸。此外，所得的复合体可以通过阴离子交换层析进行纯化以去除未形成复合体的β-1,3-葡聚糖。复合体可以合适地通过上述方法纯化。[0140]本发明的复合体的形成可以通过例如通过cd（圆二色性）谱、通过尺寸排阻层析的uv吸收迁移、凝胶电泳、微芯片电泳、毛细管电泳来测量构象改变，尽管方法并不限于此。[0141]尽管本发明的寡脱氧核苷酸和β-1,3-葡聚糖的混合比例可以考虑多da链的长度等而合适地确定，但摩尔比（spg/odn）通常为0.02ꢀ‑ꢀ2.0，优选0.1ꢀ‑ꢀ0.5。在进一步的实施方案中，摩尔比（β-1,3-葡聚糖(lnt等)/odn）例如为0.005ꢀ‑ꢀ1.0，优选0.020ꢀ‑ꢀ0.25。[0142]本发明的复合体的制备方法通过采用cpg-odn和lnt复合体作为实例来解释。lnt溶解于0.05ꢀ‑ꢀ2n优选0.1ꢀ‑ꢀ1.5n的碱性水溶液（例如，0.25n氢氧化钠水溶液），且将混合物静置于1℃ꢀ‑ꢀ40℃持续10hr-4天（例如，室温下静置过夜）以制备单链lnt水溶液（例如，50mg/mllnt水溶液）。将分别制备的上述lnt水溶液和cpg水溶液（例如，100μmcpg水溶液）以0.005-1.0的摩尔比（lnt/odn）混合，随后上述lnt水溶液用缓冲的酸性水溶液（例如nah2po4）中和并在1ꢀ‑ꢀ40℃下保持6hr-4天（例如4℃下过夜）以完成络合。lnt水溶液可以最后添加且混合用于上述络合。复合体的形成可以通过例如通过尺寸排阻层析在监测240-280nm（例如260nm）处吸收时cpgodn向高分子量侧的迁移而确定。[0143]在一个实施方案中，本发明的复合体展示杆形颗粒的形式。颗粒大小等于由用作材料通过展示三链螺旋结构的β-1,3-葡聚糖（例如裂褶菌多糖）天然形成的颗粒大小。平均颗粒大小通常为10-100nm，优选20－50nm。颗粒大小可以通过将复合体溶解于水中并将溶液进行通过使用malverninstrumentszetasizer在80℃下的动态光散射方法而测量。[0144]优选分离本发明的复合体。“分离的复合体”的纯度（目标复合体重量与评价目标产物的总重量的百分比）通常不少于70％，优选不少于80％，更优选不少于90％，进一步优选不少于99％。[0145]由于本发明的复合体具有优秀的免疫刺激活性并具有对于k型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化b细胞（优选地，人b细胞）以产生il-6的活性）和对于d型cpgodn独特的免疫刺激活性（例如，活化浆细胞样树突细胞（优选人浆细胞氧树突细胞）以产生ifn-α的活性）两者，因此其可用作免疫刺激剂等。例如，含有k型cpgodn（例如，seqidno:2、11、12）和lnt(k3-lnt)的复合体和含有k型cpgodn（例如，seqidno:2）和spg(k3-spg)的复合体具有诱导炎症应答（pan-ifn-a、il-6等）的能力、增强病毒接种的个体血清中的抗原特异性igg抗体滴度（总igg、igg2c等）的作用、在病毒接种的个体中抗原特异性产生细胞因子（ifn-γ、il2）的能力、和针对病毒的感染保护性作用。k3-lnt还具有在病毒接种的个体中增强th2细胞因子（il-13等）产生的能力。因此，它们可用作新颖的疫苗佐剂候选物。[0146]3.药物组合物本发明提供包含本发明的上述寡脱氧核苷酸或本发明的上述复合体的药物组合物。本发明的药物组合物可以通过根据常规方法配制本发明的上述寡脱氧核苷酸或本发明的上述复合体来获得。本发明的药物组合物包含本发明的寡脱氧核苷酸或复合体和药学上可接受的载体。而且，药物组合物可以进一步包含抗原。此类药物组合物以合适于口服或肠胃外施用的剂型提供。[0147]作为用于肠胃外施用的组合物，例如，使用注射剂、栓剂等，且注射剂可以涵盖剂型诸如静脉内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、滴注剂等。此类注射剂可以根据已知方法制备。注射剂的制备方法包括将上述本发明的寡脱氧核苷酸或复合体溶解或悬浮于通常用于注射的无菌含水溶剂中。作为用于注射的含水溶剂，可以使用例如，蒸馏水；生理盐水；缓冲液诸如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓冲液等；等。此类含水溶剂的ph为例如5-10，优选6-8。制备的注射剂优选填充在合适的安瓿中。[0148]还可以通过将本发明的寡脱氧核苷酸或复合体的悬浮液进行处理诸如真空干燥、冻干等来制备本发明的寡脱氧核苷酸或复合体的粉末制剂。本发明的寡脱氧核苷酸或复合体可以通过以粉剂状态将其保存并使用时在注射用含水溶剂中分散粉剂来使用。[0149]本发明的寡脱氧核苷酸或复合体在药物组合物中的含量通常约为整个药物组合物的0.1ꢀ‑ꢀ100wt%，优选约1ꢀ‑ꢀ99wt%，更优选约1ꢀ‑ꢀ99wt%。[0150]本发明的药物组合物可以包含作为活性成分的单独的本发明的寡脱氧核苷酸或复合体或者本发明的寡脱氧核苷酸或复合体与其他活性成分的组合。[0151]4.药物用途由于本发明的寡脱氧核苷酸和复合体具有优秀的免疫刺激活性，因此本发明的寡脱氧核苷酸、复合体和药物组合物可以用作免疫刺激剂。向哺乳动物（灵长类动物诸如人等，啮齿类动物诸如小鼠等，等）施用本发明的寡脱氧核苷酸、复合体或药物组合物可以诱导哺乳动物中的免疫反应。具体而言，由于本发明的复合体具有d型cpgodn活化特性并且刺激外周血单核细胞产生大量的i型干扰素(pan-ifn-α、ifn-α2等)和ii型干扰素(ifn-γ)，其可用作i型干扰素产生诱导剂、ii型干扰素产生诱导剂或i型和ii型干扰素产生诱导剂。因为本发明的复合体和包含所述复合体的药物组合物诱导产生i型和ii型干扰素，因此它们可用于预防或治疗i型或ii型干扰素或者i型和ii型干扰素两者对其是有效的疾病。i型干扰素对其有效的疾病的实例包括病毒感染（例如丙型肝炎病毒（hcv）、疱疹病毒、乳头瘤病毒、rs病毒、流感病毒等）、癌症等。ii型干扰素对其有效的疾病的实例包括变应性疾病、细胞内寄生性原生动物的感染（利什曼原虫等）、细菌（李斯特菌、结核分枝杆菌）等，等。由于用于rs病毒、流感病毒等的急性病毒感染，因为i型干扰素和ii型干扰素两者增强与病毒消除相关的免疫应答，因此本发明的复合体和包含其的药物组合物预期对于急性病毒感染是有效的。[0152]而且，本发明的寡脱氧核苷酸和复合体，具体而言，本发明的复合体具有强的疫苗佐剂活性，且施用本发明的寡脱氧核苷酸和复合体连同抗原至哺乳动物可以诱导针对该抗原的强免疫反应。因此，本发明还提供诱导针对抗原的免疫反应的组合物，其包含（a）本发明的寡脱氧核苷酸或本发明的复合体，和（b）抗原。具体而言，本发明的复合体强烈诱导针对抗原的体液免疫反应（抗原特异性的抗体产生）和细胞免疫反应（抗原特异性ctl诱导）。因此，本发明的寡脱氧核苷酸、复合体和药物组合物，具体而言本发明的复合体和包含其的药物组合物可用作疫苗佐剂。[0153]在本说明书中，佐剂指促进免疫应答的药物助剂，其是当与抗原施用至活体时非特异性增强针对抗原的免疫应答的物质。[0154]抗原无具体限制只要其具有对于将作为施用对象的哺乳动物（灵长类动物诸如人等，啮齿类动物诸如小鼠等，等）的抗原性，且可以被抗体或细胞毒性t淋巴细胞(ctl、cd8 t细胞)识别为抗原。可以使用成为抗原的任何物质（蛋白、肽、核酸、脂质、碳水化合物和上述物质的修饰（例如修饰引入有缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸（下文称为突变）等））。作为抗原，也可以使用来源于病原体诸如原生动物、真菌、细菌、病毒等的抗原和与癌症或具体疾病相关的抗原。[0155]在本说明书中，“来源于病原体x的抗原a”意指包含抗原a作为病原体x中的构成要素。例如，当抗原a是多肽时，其意指多肽的氨基酸序列存在于由病原体x的基因组编码的蛋白的氨基酸序列中。[0156]来源于病原体的抗原的实例包括病原体本身或其部分，灭活的或减毒的病原体本身或其部分，或引入有对其的突变的修饰等，等等。[0157]当来源于病原体的抗原用作抗原时，诱导针对该抗原的免疫反应，且建立从机体natureimmunology8,39-46(2007))。c57bl/6j小鼠购自nihonclea。所有动物实验根据nationalinstituteofbiomedicalinnovation和osakauniversity动物设施的机构指南进行。以下cpgodn由genedesign,inc合成。[0168]（下划线表示硫代磷酸酯键）。[0169]表1表1alexa488-标记的k3;alexa488-标记的k3-da40;alexa647-标记的k3;alexa647-标记的k3-da40。[0170]具体而言，描述了合成k3-da35(seqidno:12)、k3-da30(seqidno:11)、k3-da25(seqidno:10)和k3-da20(seqidno:9)，除了上述的k3-da40(seqidno:2)之外（表2）。[0171]表2(序列表,seqidno:2)(序列表,seqidno:12)(序列表,seqidno:11)(序列表,seqidno:10)(序列表,seqidno:9)（在上述序列中，s显示核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。）。[0172]通过常规方法固相亚磷酰胺法合成寡脱氧核苷酸(nucleicacidsinchemistryandbiology,3.chemicalsynthesis(1990)编辑g.michaelblackburn和michaelj.gait.oxforduniversitypress)。[0173]表3显示表2中所述的cpgodn的分子量，和在以下条件下通过反相hplc分析的保留时间（柱：waters,x-bridgec182.5μm,4.6x75mm,溶液a:100mm六氟异丙醇、8mm三乙胺，溶液b:甲醇,b%:5%→30%(20min,线性梯度);60℃;1ml/min;260nm)。[0174]表3。[0175]卵清蛋白(ova)购自seikagakukogyo.dq-ova,alexa488-ova,cfse和lipofectamine2000购自invitrogen。hoechst33258、酵母多糖和凝胶多糖购自sigma。耗竭酵母多糖(zymosan-depleted)购自invivogen。氯膦酸盐脂质体购自formumax。流感裂解产物疫苗、福尔马林灭活的完整病毒（wiv）和纯化的流感病毒（h1n1）如前所述制备(koyama,s.,等人.,sciencetranslationalmedicine2,25ra24(2010))。[0176]cpgodn和spg的络合（图1）将7.22mgk3-da40溶解在水中（3.7ml）。将spg(15mg,mitsuisugarco.,ltd.)溶解在0.25nnaoh(1ml)中。加入1ml体积的330mmnah2po4至dna溶液，随后将spg溶液加入到dna/nah2po4溶液并在4℃下保持过夜以完成络合。摩尔比(mspg/mdna)保持为0.27。复合体的形成通过微芯片电泳仪确定(shimadzu:multina)。[0177]cpgodn和lnt的络合（图1）将香菇多糖(lnt:ajinomotoco.,inc.,lotno.:2d8x1)溶解在0.25nnaoh至50mg/ml，并将混合物在室温下静置过夜。将各种cpgodn（表2、3）溶解在注射用水中至100mm。将lnt溶液和各种cpg水溶液(k3-da20(seqidno:9)、k3-da25(seqidno:10)、k3-da30(seqidno:11)、k3-da35(seqidno:12)、k3-da40(seqidno:2))以表4中显示ng/ml)培养7天产生。将细胞以1ꢀ×ꢀ107细胞/ml的浓度铺板。bmdm通过用小鼠m-csf(peprotech)(20ng/ml)培养7天产生。这些细胞保持在完全rpmi中。[0183]细胞内分布（图8和9）将bmdm以5ꢀ×107细胞/ml铺板并用alexa488-k3(1μm)加alexa647-k3-spg(1μm)或alexa488-d35(1μm)加alexa647-k3-spg(1μm)刺激3小时。用hoechst33258染色细胞30min以将核显像，随后固定细胞并使用荧光显微镜分析。[0184]免疫将6周龄的c57bl/6j、tlr9缺陷的和树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷的小鼠在第0和10天在尾基部施用：ova(0.1、1、10、或100μg);ova(0.37、1.1、3.3、或10μg)和k3(538pmol);ova(0.37、1.1、3.3、或10μg)和k3-da40(538pmol);或ova(0.37、1.1、3.3、或10μg)和k3-spg(538pmol)。对于其他实验，将6周龄的c57bl/6j小鼠在第0和10天在尾基部施用：单独的裂解疫苗(0.1μg)；裂解疫苗加k3(538pmol)；或裂解疫苗加k3-spg(538pmol)。在第17天抽血并且通过elisa测量抗原特异性血清抗体滴度（图10、15a、16、25、28a、29和43a)。在第17天收集小鼠脾并通过上述方法制备脾细胞。将细胞用以下再次刺激：ova257-264(ova257):siinfekl(10μg/ml);ova323-339(ova323):isqavhaahaeineagr(10μg/ml);完全ova蛋白(ova)(10μg/ml);np260-283(np260):arsalilrgsvahksclpacvygp(10μg/ml);或裂解疫苗(10μg/ml)持续24或48小时。将上清液进行小鼠ifn-γ的elisa（图11、15b、17、26、28b、30和43b）。对于四聚体测定，将脾细胞用h-2kbova四聚体(mbl)、抗-cd8α(kt15)、抗-tcrβ(h57-597)、抗-cd62l(mel-14)、和抗-cd44(im7)抗体和7-aad染色。通过facs确定ova四聚体 cd44 cd8α tcrβ 细胞数(图12、15c、27、28c和31)。[0185]体外ctl测定（图13）将六周龄c57bl/6j小鼠在第0天在尾基部施用：ova(100μg);ova加k3(3.3μg);ova加k3-da40(3.3μg);或ova和k3-spg(3.3μg)。[0186]免疫后7天时，初生的c57bl/6j脾细胞用不同浓度的cfse(5或0.5μm)在37℃下标记10min。将以高浓度的染色的细胞用ova257(10μg/ml)在37℃下脉冲(pulsed)90min。用培养基洗涤两次后，将标记的细胞混合并通过静脉内施用转移至经免疫的小鼠。转移后24天，收集脾细胞并通过facs测量cfse标记的细胞的百分比。[0187]肽免疫c57bl/6j小鼠用以下免疫：ova257(10μg);ova257加k3(10μg);ova257加k3-da40(10μg);或ova257加k3-spg(10μg)。[0188]免疫后7天，制备脾细胞并用h-2kbova四聚体、抗-cd8α、抗-tcrβ、抗-cd62l、和抗-cd44抗体染色。ova四聚体 cd44 cd8α tcrβ 细胞数通过facs分析(图14左）。制备的脾细胞体外用ova257(10μg/ml)加golgiplug再刺激4小时。细胞用抗-ifn-γ、抗-cd8α和抗-cd3e抗体染色，且ifn-γ cd8α cd3e 细胞数通过facs确定（图14右）。[0189]转染和树突状细胞相关性c型植物血凝素-1结合测定（图18和19）使用lipofectamine2000用空的、树突状细胞相关性c型植物血凝素-1或树突状细胞相关性c型植物血凝素-2表达质粒转染hek293细胞。转染后48小时，将细胞用fitc-spg(0.5μm)、alexa488-标记的k3-da40(0.5μm)或alexa488-标记的k3-spg(0.5μm)在37℃下处理60min。处理后，收获细胞并通过facs分析spg或cpgodn阳性细胞。[0190]免疫细胞的刺激（图20、21、22、23和24）将来自c57bl/6j、tlr9缺陷的或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞和fl-dc用以下刺激24小时：k3-spg(0.014、0.03、0.04、0.08、0.12、0.25、0.37、0.74、1.1、2.2、3.3、6.7、10、或20μg/ml)、酵母多糖(3.7、11.1、33.3、或100μg/ml)、凝胶多糖、耗竭的酵母多糖、或spg。在其他实验中，来自c57bl/6j或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠的脾细胞用以下刺激：耗竭的酵母多糖(100、33.3、或11.1μg/ml)或spg(100、33.3、或11.1μg/ml)，具有或不具有d35(1μm)，持续24小时。将上清液进行对ifn-α(pbl)、il-6(r&d)、il-12p40(r&d)、il-12p70(r&d)和bioplex(bio-rad)的elisa。[0191]免疫组织化学（图32）将c57bl/6j小鼠在尾基部施用：dq-ova(10μg);alexa488-k3-spg(10μg);alexa647-k3-spg(10μg);或dq-ova加alexa647-k3-spg(10μg)。[0192]收集iln后，使用恒冷切片机(cryostat)制备冷冻切片。将冷冻切片用4％低聚甲醛固定10min并与抗-siglec-1(moma-1)、抗-marco(ed31)、抗-cd3e(145-2c11)、或抗-cd11c(n418)抗体孵育。通过imagej分析成像结果。[0193]双光子显微镜（图33和35）c57bl/6j、tlr9-缺陷的或树突状细胞相关性c型植物血凝素-1-缺陷的小鼠用dq-ova(10μg)、alexa488-k3(10μg)、或alexa488-k3-spg(10μg)在尾基部施用。iln收集前30min，将小鼠用抗-pe-marco或抗-pe-siglec-1抗体在尾基部施用。施用抗原或佐剂后1小时时，收集iln并制备用于使用双光子显微镜(olympus)的成像分析。使用速度共定位分析计算pearson相关性。[0194]抗原和佐剂的体内分布（图34和36）将c57bl/6j小鼠在尾基部施用：alexa647-k3(538pmol);alexa647-k3-spg(538pmol);alexa488-ova(10μg);alexa488-ova加k3(10μg);alexa488-ova加k3-spg(10μg);dq-ova(10μg);dq-ova加alexa647-k3(538pmol);或dq-ova加alexa647-k3-spg(538pmol)。[0195]施用后24小时，收集iln。为了制备单细胞悬浮液，将iln与胶原蛋白酶d（1mg/ml）和dnasei（0.1mg/ml）在37℃下孵育30min。将制备的细胞与抗b220(ra3-6b2)、抗cd8α(56-6.7)和抗-cd11c抗体孵育以分离不同的dc群。通过facs分析ova和cpgodn的细胞摄取。[0196]氯膦酸盐脂质体注射（图37）免疫前5天或2天在尾基部向六周龄c57bl/6j小鼠施用氯膦酸盐脂质体。在第0天在尾基部用ova加k3-spg免疫小鼠。在第8天收集血液和脾，并通过elisa测量血清抗体滴度和t细胞应答。[0197]体内dc活化的研究（图38）用k3(10μg)或k3-spg(10μg)向尾基部对c57bl/6j或tlr9缺陷小鼠施用。施用后24小时，通过上述方法制备iln。将细胞用抗cd11c、抗mpdca-1(jf05-1c2.4.1)、抗cd8α、和抗cd40(3/23)抗体孵育，随后通过facs分析。[0198]针对流感病毒感染的防御应答的研究将六周龄c57bl/6j小鼠用以下施用：裂解疫苗(0.1μg)；裂解疫苗加k3-spg(10μg);或wiv(0.2μg)在第0和14天。免疫后2周，通过elisa测量血清抗体滴度（图39）并用2.3ꢀ×ꢀ103pfu(10ld50)的流感病毒a/pr/8/34鼻内攻击小鼠。监测攻击小鼠的体重改变和死亡率持续20天(图40)。[0199]食蟹猴的疫苗模型（图41和42）将食蟹猴在第0和14天皮下施用：流感裂解疫苗(5μg)加k3(5nmol)，或裂解疫苗和k3-spg(5nmol)在-2、2、4、6、8、110周收集血样，并通过elisa测量血清抗体滴度。[0200]统计学分析组间的统计学显著(p《0.05)使用student'st检验或mann-whitneyu检验来确定。[0201][结果]1）k3-spg的杆形纳米大小颗粒获得k和d型cpgodn的双重特性。[0202]cpgodn和spg之间的更好的络合效率需要如图1中所示的经变性-复性程序的对于在5'和3'端的多da40的ps骨架的额外序列(shimada,n.,等人.,bioconjugatechemistry18,1280-1286(2007);minari,j.,等人.,bioconjugatechemistry22,9-15(2011))。在通过人源化的cpgodn形成复合体的优化过程中，本发明人检查了cpgodn的5'和3'端的免疫刺激影响。5’‑k3-da40-3’而不是5’‑da40-k3-3’与spg活化的人外周血单核细胞(pbmc)络合以产生大量的ifn-α，尽管络合效率是可比较的（图2和3）。k3、k3-da40和da40-k3，其能够活化人pbmc以产生其他细胞因子，诸如il-6，无法产生ifn-α（图2和3）。这些结果表明5'-cpg比3'-cpg作为新颖的tlr9激动剂是更期望的。[0203]k3-spg的鉴定和定量通过扫描电子显微镜（sem）和动态光散射(dls)来进行。k3-spg具有杆样结构，与之前报道中可见的一致(bae,a.h.,等人.,carbohydrateresearch339,251-258(2004))（图4）。其似乎为具有30nm的平均直径的可溶性单体纳米颗粒，与spg本身相当且比d型cpgodn(d35)更小（图5）(klein,d.c.等人.,ultramicroscopy110,689-693(2010);costa,l.t.,等人.,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications313,1065-1072(2004))。[0204]考虑到k3-spg形成纳米颗粒，将k3-spg的免疫刺激活性与c、d和p型cpgodn比较。用k3-spg刺激pbmc产生更大量的ifn-α和ifn-γ，且以比由d35（图6）、p和c型cpgodn（图7）诱导的那些更低的浓度。这些结果表明k3-spg获得d型cpgodn的特征，而没有丧失k型的特征，这是因为这些ifn已知是d型特异性的细胞因子(krug,a.,等人.,europeanjournalofimmunology31,2154-2163(2001);verthelyi,d.等人.,journalofimmunology166,2372-2377(2001);gursel,m.等人.,journalofleukocytebiology71,813-820(2002))。为了理解k和d型cpgodn的双功能，本发明人分析了k3-spg在骨髓来源的巨噬细胞中的胞内定位。k3-spg不仅与包含k型cpgodn的内体而且与包含d型cpgodn的内体共定位（图8和9），如c型cpgodn(guiducci,c.,等人.,thejournalofexperimentalmedicine203,1999-2008(2006))，表明k3-spg可以转导经k和d型cpgodn的内体介导的先天免疫信号传递途径。这些结果强烈表明k3-spg形成纳米大小的高级和完全溶解的颗粒，并且发现这种“一体化”k3-spg展示比任何其他cpgodn和先前已知的cpg-spg复合体更有效的活性和与其不同的特征。[0205]2）k3-spg是诱导针对蛋白抗原的有效ctl应答无需缀合的有效疫苗佐剂。[0206]本发明人在鼠免疫模型中比较了k3、k3-da40和k3-spg的佐剂作用。当用单独的ova、或ova与每一k3来源的佐剂免疫野生型小鼠时，k3-spg诱导比由k3诱导的显著更高的体液免疫应答（图10）和更强的t细胞应答（图11）。值得注意的是，四聚体测定揭示ova特异性cd8t细胞显著更高的数目（图12）。还观察到针对共施用的蛋白抗原而无任何共价缀合的非常强的体内ctl活性（图13）。由k3-spg的这种强ctl诱导通过肽接种而再现（图14），且是剂量依赖性的（图15）。k3-spg的抗原节约能力如此有效以致于使用百分之一的ova抗原的量实现了相当的抗体和cd4t细胞应答（图16和17）。这些结果明确地表明k3-spg是比单独的k3更卓越的佐剂。[0207]3）spg是可溶性树突状细胞相关性c型植物血凝素-1配体，但不是树突状细胞相关性c型植物血凝素-1激动剂。[0208]检查了树突状细胞相关性c型植物血凝素-1在细胞摄入spg和k3-spg及随后被其活化中的作用，因为树突状细胞相关性c型植物血凝素-1已显示是β-葡聚糖诸如酵母多糖trendsinimmunology33,66-70(2012))。使用常规荧光显微镜的组织学分析没有合适地揭示整个iln表面；此外，这些巨噬细胞难于分离用于流式细胞术分析(aoshi,t.,等人.,europeanjournalofimmunology39,417-425(2009);gray,e.e.&cyster,j.g.,journalofinnateimmunity4,424-436(2012))。因此，使用双光子显微镜成像分析来阐明离体的抗原和k3-spg的分布。注射抗marco和抗siglec-1抗体后，将特异性巨噬细胞显像。当通过双光子显微镜在注射后1小时监测iln时，ova和k3-spg与marco 而非siglec-1 巨噬细胞共定位（图33和35）。之前报道表明免疫复合体和灭活的流感病毒被siglec-1 巨噬细胞捕获以诱导体液免疫应答(gonzalez,s.f.,等人.,natureimmunology11,427-434(2010);suzuki,k.等人.,thejournalofexperimentalmedicine206,1485-1493(2009))。如由速度共定位分析所验证的，分布模式与iln中的marco 巨噬细胞的分布模式完美匹配，但不与siglec-1 巨噬细胞共定位（图34和36）。相反，相比于k3-spg，k3在marco 和siglec-1 区域之间更广泛地分布（图35和36）。此外，tlr9缺陷和树突状细胞相关性c型植物血凝素-1缺陷小鼠显示相当的k3-spg共定位。为了确定这些巨噬细胞对k3-spg佐剂作用的贡献，检查了注射氯膦酸盐脂质体进入尾基部后巨噬细胞和dc的不同的恢复动力学。注射后，巨噬细胞在第2天完全耗竭。这些细胞没有恢复持续至少一周，而dc到第5天大部分恢复，如之前所报道的(aoshi,t.,等人.,immunity29,476-486(2008))。当巨噬细胞和dc均耗竭时，免疫应答显著抑制（图37；cloꢀ‑d2）。仅巨噬细胞而不是dc耗竭且免疫应答与未处理的小鼠中的那些相当（图37；clo–d5）。这将表明尽管ova和k3-spg在注射后主要被iln中的marco 巨噬细胞捕获，但巨噬细胞诱导适应性免疫应答。换言之，k3-spg的佐剂作用很大程度上依赖于dc群。[0214]6）k3-spg在体内靶向且强烈活化携带抗原的dc群。[0215]本发明人的发现表明尽管很大比例的纳米颗粒k3-spg在注射后被iln中的marco 巨噬细胞摄取，但佐剂作用似乎被dc所控制。聚焦于iln中被dc群的抗原和佐剂摄取。注射后24小时，通过流式细胞术分析dc群的抗原和佐剂摄取。三个dc亚群(pdcs,cd8α dcs和cd8α-dcs)中cpg阳性频率在k3-spg注射后比用k3注射后显著增加。相反，ova阳性dc频率在k3和k3-spg注射后相当。当聚焦于抗原和佐剂阳性的dc时，对于k3-spg相对于k3存在实质增加。iln中的pdc和cd8α dcs均被k3-spg而非k3在注射后24小时强烈活化，且这完全依赖于tlr9（图38）。这些结果表明pdcs和cd8α dcs有限捕获纳米颗粒k3-spg而非非颗粒k3用于成熟，和实施佐剂作用。[0216]7）k3-spg是鼠和非人灵长类动物模型中用于流感疫苗的有效佐剂。[0217]通过使用在小鼠和非人灵长类动物中的更多临床相关的流感接种模型来检查k3-spg的佐剂作用。当用醚处理的血凝素抗原富集的无病毒体的裂解疫苗（sv）加所示佐剂免疫小鼠时，当比较抗体应答和t细胞应答时，k3-spg证实比k3更优秀的佐剂作用（图43）。更重要的是，sv加k3-spg免疫导致100倍更高的抗体应答，甚至与用完全（病毒体）灭活疫苗（wiv）(0.2μg/小鼠)（图39）接种相比时，所述灭活疫苗包含病毒rna作为内置佐剂(builtinadjuvant)(koyama,s.,等人.,sciencetranslationalmedicine2,25ra24(2010))。用sv(0.1μg/小鼠)和k3-spg免疫的小鼠展示比wiv免疫的小鼠更低的体重降低（图40）。显著地，k3-spg赋予针对致死的pr8病毒攻击100％的保护，而以该剂量仅10％的wiv接种的小鼠存活（图40）。这些结果强烈支持这一概念，即k3-spg作为鼠模型中蛋白或基于蛋白的疫苗的有效佐剂起效，促使本发明人扩展这一发现至使用食蟹猴的非人灵长类动物模型。每组三只食蟹猴用sv加k3或k3-spg在第0和14天免疫。血清抗体滴度随后监测持续8周。sv加k3-spg诱导在免疫后2周时显著更高的抗体滴度，且滴度水平保持高位持续至少再6周（图41）。免疫后2年（110周）时，k3-spg组比k3组具有显著更高的抗体滴度（图42和43）。总之，这些结果表明k3-spg在非人灵长类动物模型中是卓越的疫苗佐剂。[0218]8）使用人pbmc的k3-lnt和k3-spg复合体的炎症应答诱导能力的研究。[0219]使用人pbmc(lonza,目录号cc-2702,批次号0000396517)，评价单独的k3(k3-da30、k3-da35、k3-da40)、k3-lnt复合体(k3-da30-lnt、k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-lnt)诱导pan-ifn-a(hifna)和il-6(hil-6)的产生的能力。[0220]结果显示于图44中。当以低剂量刺激时，相比于单独的k3，用k3-spg（其为k3和spg的复合体）和k3-lnt（其为k3和lnt的复合体）的pan-ifn-a和il-6的产生更高。此外，由具有不同da尾长度（da30、da35、da40）的k3-lnt诱导的炎症细胞因子可生产性被指出可能几乎相同。此外，当比较k3-spg和k3-lnt的炎症细胞因子可生产性时，k3-lnt的pan-ifn-a产生的可诱导性被指出可能比k3-spg的更高。另一方面，k3-spg和k3-lnt发现在il-6产生中相等。[0221]9）用添加有k3-lnt和k3-spg复合体的rsvf亚单位疫苗接种的小鼠血清中的rsvf抗原特异性igg抗体滴度。[0222]将7周龄的c57bl/6小鼠在尾基部用rsvf抗原(0.5μg)和各种佐剂(10μg)(单独的k3(k3-da30、k3-da35、k3-da40)、k3-lnt复合体(k3-da30-lnt、k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-spg)、磷酸铝(alumphosphate))每只小鼠以2周间隔免疫两次。最终免疫后一周时，回收外周血并制备血清，其用作评价样品。使用elisa方法测量血清中结合rsvf疫苗抗原的抗体的滴度。如图45中所示，rsvf抗原特异性总igg诱导相比于单独的rsvf抗原接种组（f）通过添加佐剂而得到增强，其表明单独的k3(f k3-da30、f k3-da35、f k3-da40)、k3-lnt(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(f k3-da40-spg)和磷酸铝(f alum)的佐剂作用可能是相同的。在接种由磷酸铝(f alum)的小鼠组中，其为th2佐剂，发现igg1子类诱导能力比单独的rsvf抗原接种组更高。另一方面，结果显示接种有单独的k3(f k3-da30、f k3-da35、f k3-da40)、k3-lnt(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)、k3-spg(f k3-da40-spg)的免疫组在igg2c子类抗体中比用磷酸铝(f alum)的组更高，其表明k3-lnt复合体可以是如k3-spg的th1佐剂。[0223]10）用添加有k3-lnt和k3-spg复合体的rsvf亚单位疫苗接种的小鼠中的rsvf抗原特异性细胞因子产生能力。[0224]将7周龄的c57bl/6小鼠在尾基部用rsvf抗原(0.5μg)和各种佐剂(10μg)(单独的k3(k3-da30、k3-da35、k3-da40)、k3-lnt(k3-da30-lnt、k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-spg)、磷酸铝(alumphosphate))每只小鼠以2周间隔免疫两次。最终免疫后一周时，回收脾，并制备脾细胞。将接种在96孔培养板中的脾细胞用mhci类限制性表位肽、mhcii类限制性表位肽和rsvf抗原的疫苗抗原蛋白刺激，并培养24小时或48小时。通过细胞因子elisa方法并使用培养上清液作为样品评价rsvf特异性细胞因子产生能力。在该研究中，评价三类细胞因子（ifn-g，其为th1细胞因子；il-2，其产生自活化的t细胞；和il-3，其为th2细胞因子）。[0225]结果是，如图46中所示，表明对ifn-g产生和il-2产生的rsvf抗原特异性诱导的增强作用在k3-lnt(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)和k3-spg(f k3-da40-spg)中是相同的。在磷酸铝佐剂（th2佐剂）接种组（f alum）中，ifn-g产生低于通过任何刺激的检测限水平。另一方面，il-13产生增强作用在磷酸铝（th2佐剂）接种组中高而在k3-spg（th1佐剂）接种组中低。有趣的是，在k3-lnt接种组(f k3-da30-lnt、f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)中，对il-13产生的增强作用相比于相同的th1佐剂（k3-spg）接种组(f k3-da40-spg)高。因此，这表明k3-lnt复合体具有除了由k3-spg具有的高th1应答增强作用外的th2应答增强能力。[0226]11）用添加有k3-lnt和k3-spg的rsvf亚单位疫苗接种的棉鼠中针对rsv感染的保护性作用。[0227]将6至7周龄的棉鼠在尾基部用rsvf抗原(1μg)和各种佐剂(10μg)(k3-lnt(k3-da35-lnt、k3-da40-lnt)和k3-spg复合体(k3-da40-spg)、磷酸铝(alumphosphate))每只小鼠以2周间隔免疫两次。最终免疫后两周时，将棉鼠通过经鼻接种用rsv血清型a（长链）进行攻击，并在3天后测量肺内病毒量。synagis（帕利珠单抗）施用组在攻击感染前一天肌内施用有synagis（2.5mg/kg），且以如上相同方式评价感染保护性能力。攻击感染前立即在麻醉下从大鼠的颈静脉收集血液样品并使用所获血清研究中和抗体滴度。[0228]肺内病毒量的结果显示于图47的左侧，且中和抗体滴度的结果显示于该图右侧。肺内病毒量的结果揭示在pbs施用组中观察到约105pfu/肺的病毒量，而在施用添加有磷酸铝的rsvf疫苗（f alum）的组中抑制至低约100倍的病毒量（平均值）。另一方面，诱导保护免于感染的活性也在添加k3-spg的疫苗施用组(f k3-da40-spg)中观察到。添加k3-lnt的疫苗组(f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)显示对感染的最佳保护作用，因此表明成为新颖的疫苗佐剂候选的可能性，其相比于磷酸铝和k3-spg有助于高感染防御能力。[0229]至于中和抗体诱导能力，在添加磷酸铝的疫苗施用组（f alum）中观察到等于synagis的血液中的中和能力。另一方面由于在k3-spg添加的疫苗施用组(f k3-da40-spg)中的4只大鼠中的3只中几乎没有诱导中和抗体，因此认为k3-spg产生的感染保护作用源自中和抗体不依赖的机制。此外，由于相比于k3-spg，在k3-lnt施用组(f k3-da35-lnt、f k3-da40-lnt)发现高中和抗体，因此表明k3-lnt佐剂可以具有与k3-spg的不同的特性，例如，th2应答增强能力。[0230]产业实用性本发明提供具有优秀的免疫刺激活性的寡脱氧核苷酸和包含其的复合体。具体而言，本发明的复合体同时具有针对k型cpgodn独特的免疫刺激活性和针对d型cpgodn独特的免疫刺激活性。此外，k3-spg和k3-lnt具有强疫苗佐剂活性，并且用k3-spg或k3-lnt连同抗原的免疫刺激抗原特异性体液免疫和细胞免疫两者。因此，本发明的复合体可用作药物领域中的免疫刺激剂或疫苗佐剂。[0231]本技术基于在日本提交的专利申请号2013-196206（申请日：2013年9月20日），其内容完整并入本文。当前第1页12当前第1页12
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