一种基于SPE-HPLC技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法与流程

一种基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法。


背景技术：

2.拉考沙胺(lcm)是2018年在我国上市的第三代抗癫痫发作药物(anti-seizure medications，asms)，其作为选择性增强电压门控钠离子通道的慢失活、而不影响快失活钠通道的新型asms，对于癫痫治疗有广泛的应用前景。
3.国外研究表明，lcm体内暴露水平与其临床疗效和毒副反应密切相关，但是儿童患者伴随着生理发育和病理状态的变化，lcm体内药动学行为存在极大的个体差异性。通过检测其体内药物浓度来调整lcm的用法用量是保证临床治疗有效性和安全性的必要措施。本发明采用固相萃取-高效液相色谱法(spe-hplc)测定癫痫患者血清中lcm的浓度，旨在为临床精准用药提供技术支撑，国内有报道采用蛋白沉淀预处理血样，采用超高效液相色谱法(uplc)测定癫痫患儿血清中lcm的稳态谷浓度。
4.专利202011596845.3中提出了一种采用液质联用色谱仪测定血清中lcm浓度的方法，其具体方法是将血清样本经液液萃取预处理后，通过液相色谱串联质谱检测其浓度，该方法1.血清样本预处理方法步骤繁琐，有机溶剂使用多，萃取材料不可重复使用；2.样本前处理纯化程度不高，不利于色谱仪器流路的保护，耐用性不好；3.液相色谱串联质谱仪设备价格昂贵，不利于在基层医疗单位推广使用，故而提出了一种基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法用于解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的步骤繁琐、成本高和耐用性不好，不利于基层单位推广使用的问题，而提出的一种基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法，应用固相萃取技术进行临床生物样本的前处理，具体方法包括以下步骤：
8.(1)血清样本处理：
9.将spe柱先后用1ml甲醇和1ml灭菌注射用水活化备用；取0.5ml的血清样品加入spe萃取柱，待自然沥干后加1ml生理盐水淋洗，弃去淋洗液后用1ml洗脱液进行洗脱；收集洗脱液涡旋混匀，待进样分析；
10.(2)样本测定：
11.取20μl处理后的样本注入高效液相色谱仪进行分析，检测样本中拉考沙胺的色谱峰，并根据峰面积和标准曲线计算血清样本中的拉考沙胺浓度；
12.色谱测定条件如下：色谱柱为依利特sinochrom ods-bp，柱规格为4.6
×
250mm，10μm，柱温为30℃，流动相为甲醇-水，流速为0.8ml/min，紫外检测波长为215nm，进样量为20μl。
13.进一步，在所述步骤(2)中，采用外标法进行测定，通过所述拉考沙胺的峰面积和标准曲线方程获取血清中拉考沙胺的浓度；在所述步骤(1)中，所述洗脱液为70％甲醇；在所述步骤(2)中，所述流动相为40％甲醇。
14.进一步，所述标准曲线方程的获取包括以下步骤：
15.精密称取拉考沙胺对照品配制母液，并通过稀释液逐级稀释为系列浓度溶液，所述稀释液为50％甲醇；
16.分别取各系列浓度溶液200μl，加入对应2ml的空白胎牛血清中，获取标准样品；
17.另取1份2ml的空白胎牛血清加入不含拉考沙胺对照溶液的200μl稀释液中，获取空白样品；
18.将标准样品和空白样品分别涡旋混匀，并按照所述权利要求1的步骤进行样本处理和测定，记录标准样品中的拉考沙胺色谱峰面积，以峰面积为自变量，血药浓度为因变量进行线性回归拟合，获取血清中拉考沙胺的标准曲线方程。
19.进一步，所述检测分析方法的检测精密度和血清样品的提取回收率的获取包括以下步骤：
20.分别制备低、中、高质量浓度的含药血清样本各n份，按所述权利要求1中血清样本处理和样本测定的方法进行处理和分析，隔日测定一次，根据标准曲线计算批内、批间精密度；
21.其中，使用50％甲醇作为稀释液，制成低、中、高质量浓度的拉考沙胺对照样品，每个浓度平行n份，进行分析，以血清样品色谱峰面积与对照样品色谱峰面积进行比较，获取提取回收率。
22.进一步，所述血清样品的稳定性分析包括以下步骤：
23.分别制备低、中、高质量浓度的含药血清样本各m份，按所述权利要求1中血清样本处理和样本测定的方法进样行处理和分析，记录样品峰面积，将处理后的样品置于4℃冰箱冷藏后分别于1、3、5天后再次测定，比对结果后计算稳定性。
24.进一步，所述含药血清样本的低、中、高质量浓度分别为1.47μg
·
ml-1
、5.88μg
·
ml-1
、23.52μg
·
ml-1
。
25.与现有技术相比，本技术的有益效果是：
26.该基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法，将固相萃取技术应用于临床生物样本的前处理过程，不仅回收率高、分离速度快，有机溶剂用量少，且与分析仪器的兼容性好；萃取柱可重复利用，低耗、环保；同时，检测方法中所用材料成本低、易获得，流动相配比简单，本检测方法专属性强、灵敏度高、稳定、可靠，且操作简单，可用于临床治疗中拉考沙胺血药浓度的监测，为患者安全用药保驾护航，也为基层医疗单位推广治疗药物监测服务提供可能，本方法的血清标准曲线线性范围为0.841-26.905μg
·
ml-1
，批内和批间精密度rsd均《10％，适合于测定血清中拉考沙胺的浓度。
附图说明
27.图1为本发明中spe-hplc法测得的lcm在胎牛牛血清中的标准曲线图；
28.图2为本发明中胎牛空白血清的spe-hplc图；
29.图3为本发明中胎牛空白血清加入lcm的spe-hplc图。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.请参阅图1-3，一种基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法，应用固相萃取技术进行临床生物样本的前处理，具体方法包括以下步骤：
32.(1)血清样本处理：
33.将spe柱先后用1ml甲醇和1ml灭菌注射用水活化备用；取0.5ml的血清样品加入spe萃取柱，待自然沥干后加1ml生理盐水淋洗，弃去淋洗液后用1ml洗脱液进行洗脱；收集洗脱液涡旋混匀，待进样分析；
34.(2)样本测定：
35.取20μl处理后的样本注入高效液相色谱仪进行分析，检测样本中拉考沙胺的色谱峰，并根据峰面积和标准曲线计算血清样本中的拉考沙胺浓度；
36.色谱测定条件如下：色谱柱为依利特sinochrom ods-bp，柱规格为4.6
×
250mm，10μm，柱温为30℃，流动相为甲醇-水，流速为0.8ml/min，紫外检测波长为215nm，进样量为20μl。
37.进一步，在所述步骤(2)中，采用外标法进行测定，通过所述拉考沙胺的峰面积和标准曲线方程获取血清中拉考沙胺的浓度；在所述步骤(1)中，所述洗脱液为70％甲醇；在所述步骤(2)中，所述流动相为40％甲醇。
38.进一步，所述标准曲线方程的获取包括以下步骤：
39.精密称取拉考沙胺对照品配制母液，并通过稀释液逐级稀释为系列浓度溶液，所述稀释液为50％甲醇；
40.分别取各系列浓度溶液200μl，加入对应2ml的空白胎牛血清中，获取标准样品；
41.另取1份2ml的空白胎牛血清加入不含拉考沙胺对照溶液的200μl稀释液中，获取空白样品；
42.将取标准样品和空白样品分别涡旋混匀，并按照所述权利要求1的步骤进行样本处理和测定，记录标准样品中的拉考沙胺色谱峰面积，以峰面积为自变量，血药浓度为因变量进行线性回归拟合，获取血清中拉考沙胺的标准曲线方程。
43.进一步，所述检测分析方法的检测精密度和血清样品的提取回收率的获取包括以下步骤：
44.分别制备低、中、高质量浓度的含药血清样本各n份，按所述权利要求1中血清样本处理和样本测定的方法进行处理和分析，隔日测定一次，根据标准曲线计算批内、批间精密度；
45.其中，使用50％甲醇作为稀释液，制成低、中、高质量浓度的拉考沙胺对照样品，每个浓度平行n份，进行分析，以血清样品色谱峰面积与对照样品色谱峰面积进行比较，获取提取回收率。
46.进一步，所述血清样品的稳定性分析包括以下步骤：
47.分别制备低、中、高质量浓度的含药血清样本各m份，按所述权利要求1中血清样本处理和样本测定的方法进样行处理和分析，记录样品峰面积，将处理后的样品置于4℃冰箱冷藏后分别于1、3、5天后再次测定，比对结果后计算稳定性。
48.进一步，所述含药血清样本的低、中、高质量浓度分别为1.47μg
·
ml-1
、5.88μg
·
ml-1
、23.52μg
·
ml-1
。
49.以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
50.实施例一：人血清中拉考沙胺浓度的测定：
51.一、实验材料与分析设备
52.拉考沙胺(对照品):tlc pharmaceutical standards或相同，更高等级的标准品，使用试剂见下表
53.1.试剂明细
54.试剂名称级别制造商甲醇(meoh)hplc国药集团化学试剂有限公司灭菌注射用水 石家庄四药有限公司拉考沙胺对照品 上海麦克林生化科技有限公司
55.2.使用分析设备
[0056][0057][0058]
二、仪器条件
[0059]
1、液相色谱条件
[0060]
1)色谱柱选定，色谱柱为sinochrom ods-bp，柱规格为4.6
×
250mm，10μm，色谱柱温为30℃，流动相为水：甲醇-水(40:60)，流速为0.8ml/min，进样量为20μl，柱温：30℃，检测波长215nm
[0061]
三、实验过程
[0062]
2)样品制备，精密称取拉考沙胺标准品15.1mg(标准品批号：c12642773标示量98％)，用甲醇-水(50:50)溶解并定容于10ml容量瓶中，制成1479.8μg
·
ml-1
的储备液，于4℃保存，临用时用50％甲醇稀释。精密量取储备液2ml，用甲醇-水(50:50)定容于10ml容量瓶中，混匀(标注1号，含量为295.96μg/ml)，逐级稀释，最终制得质量浓度分别为9.249，18.498，36.995，73.99，147.98和295.96μg
·
ml-1
的系列标准溶液，具体稀释浓度见下表：
[0063]
溶液编号对照溶液名称对照品溶液浓度(μg/ml)血清样品浓度(μg/ml)1标样
①
9.2490.8412标样
②
18.4981.6823标样
③
36.9953.3634标样
④
73.996.7265标样
⑤
147.9813.4536标样
⑥
295.9626.905
[0064]
3)线性试验取各质量浓度的lcm系列标准溶液200μl，各加入空白胎牛血清2ml，配制成最终质量浓度为0.841，1.682，3.363，6.726，13.453和26.905μg
·
ml-1
的血清样品。
[0065]
将spe柱先后用1ml甲醇和1ml灭菌注射用水活化备用，取0.5ml的lcm血清样品加入spe萃取柱，待自然沥干后加1ml生理盐水淋洗，淋洗液弃去，再加1ml洗脱液于spe柱洗脱，洗脱液为70％甲醇，收集洗脱液，涡旋混匀，取20μl进样分析。
[0066]
对按照上述步骤处理后的样品进行分析后，记录拉考沙胺峰面积，以峰面积x对血药浓度y作回归计算，得回归方程c＝0.0448a 0.1892，r2＝0.9998。
[0067]
4)为了准确的得出检测精密度和血清样品的提取回收率，提取回收率的计算方法包括以下步骤：
[0068]
分别制备低、中、高质量浓度(1.47/5.88/23.52μg
·
ml-1
)的含药血清样本各5份，按“血清样本前处理”操作后进样分析，隔日测定一次，根据标准曲线计算批内、批间精密度；同时用50％甲醇作为稀释液，制成低、中、高质量浓度的lcm对照样品，每个浓度平行5份，进样分析，以血清样品色谱峰面积与对照样品色谱峰面积进行比较，计算提取回收率，低、中、高质量浓度血清样品的提取回收率为101.1％-112.2％。
[0069]
5)同时为了进一步的得出血清样品的稳定性，血清样品的稳定性分析包括以下步骤：
[0070]
分别制备低、中、高质量浓度(1.47/5.88/23.52μg
·
ml-1)的含药血清样本各3份，按“血清样本前处理”操作后进样分析，记录样品峰面积，将处理后的样品4℃冷藏后分别于第1、3、5天再次测定，并将分别对其结果进行比对，计算其稳定性，结果表明处理后样品5天内稳定性良好，偏差《5％。
[0071]
方法学考察：如图所示，上述lcm保留时间为13min，血清内源性物质对测定无干扰，峰形良好，lcm浓度c在0.841～26.905μg
·
ml-1
范围内与峰面积a的线性关系良好(c＝0.0448a 0.1892，r2＝0.9998)，检测下限为0.231μg
·
ml-1
(s/n＝3)，定量下限为0.841μg
·
ml-1
。
[0072]
批内精密度1.5％～5.9％，批间精密度2.6％～3.9％，准确度98.2％～116.4％，提取回收率为101.1％～112.2％，lcm血清样品经处理后4℃冷藏5天稳定性较好(bias《5％)。
[0073]
本发明所建立的方法学考察实验显示，本研究可在低至500μl血样中快速、准确地检测出lcm的浓度，方法简便可靠，完全能够解决临床工作中采样困难、干扰因素多等问题，所有技术参数指标均满足并优于国家行业标准，可在各级医疗单位推广使用。
[0074]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0075]
(1)社会性效果:辅助抗癫痫精准治疗，保证患者安全性和有效性。
[0076]
(2)经济性效果:预处理方法简便，固相萃取技术应用于临床生物样本的前处理过程，适用于常规测定；有机溶剂用量少且与分析仪器的兼容性好；萃取柱可重复使用，低耗、环保，无需专门试剂盒，检测设备价廉易得，普通基层医疗单位均可配备，方法学提取纯化效率高，可保障仪器使用寿命，综合检测成本较低，可减轻患者经济负担，节约国家医保费用支出，精准用药可缩短患者癫痫调药周期，提高体内浓度达标概率，提高疗效并保证安全性，提高药物经济学性价比，同时，检测方法中所用材料容易获得，流动相配比简单，
[0077]
(3)本检测方法专属性强，且操作简单，快速、准确、灵敏度高、为拉考沙胺的血药浓度测定提供依据，本方法的血清标准曲线线性范围为0.841-26.905μg
·
ml-1
，批内和批间精密度rsd均小于10％，可用于临床治疗中lcm血药浓度的监测，为患者安全用药保驾护航，也为基层医疗单位推广治疗药物监测服务提供可能，在本实验所采用的色谱条件下，拉考沙胺保留时间为10.5min左右，拉考沙胺的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；灵敏度高，特异性强，稳定、可靠，血清中lcm的最低定量限为0.841μg
·
ml-1
，能准确测定血清中lcm的浓度。
[0078]
上述实施例的有益效果为：
[0079]
该基于spe-hplc技术的拉考沙胺体内药物浓度检测分析方法，将固相萃取技术应用于临床生物样本的前处理过程，不仅回收率高、分离速度快，有机溶剂用量少，且与分析仪器的兼容性好；萃取柱可重复利用，低耗、环保；同时，检测方法中所用材料成本低、易获得，流动相配比简单，本检测方法专属性强、灵敏度高、稳定、可靠，且操作简单，可用于临床治疗中拉考沙胺血药浓度的监测，为患者安全用药保驾护航，也为基层医疗单位推广治疗药物监测服务提供可能，本方法的血清标准曲线线性范围为0.841-26.905μg
·
ml-1
，批内和批间精密度rsd均《10％，适合于测定血清中拉考沙胺的浓度。
[0080]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0081]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。