反义寡核苷酸及其在疼痛治疗中的应用

1.本发明属于疼痛领域，更具体地说，本发明涉及治疗外周疼痛的方法和药物组合物。


背景技术：

2.疼痛是一种不愉快的感觉，通常由强烈或破坏性的刺激引起。国际疼痛研究协会(international association for the study of pain)广泛使用的定义指出：“疼痛是一种与实际或潜在组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪体验，或以这种损伤的形式描述”。疼痛有不同的类型。
3.急性疼痛是突然出现的短期疼痛，有特定的原因，通常是组织损伤。一般来说，它持续不到6个月，并且一旦根本病因得到治疗就会消失。
4.慢性疼痛是一个常见的问题，由于其复杂的自然史、病因不明和对治疗的不良反应，对医疗保健提供者构成了重大的挑战。慢性疼痛是一种定义不明确的疾病。大多数作者认为持续时间超过6个月的疼痛可作为诊断标准，而其他作者则将3个月作为最低标准。在慢性疼痛中，持续时间参数是任意设定的。各种神经肌肉、生殖、胃肠道和泌尿系统疾病可能导致或促成慢性疼痛。
5.伤害性疼痛是最常见的疼痛类型。它是由刺激伤害性感受器(nociceptors)引起的，伤害性感受器是组织损伤的疼痛感受器。伤害性感受器遍布全身，尤其是皮肤和内脏器官。当它们受到潜在伤害的刺激时，如割伤或其他伤害，它们会向大脑发送电信号，使受试者感到疼痛。
6.内脏疼痛是由内脏器官的损伤或损坏引起的。受试者可以在其身体的躯干区域感觉到疼痛，包括胸部、腹部和骨盆。通常很难确定内脏疼痛的确切位置。内脏疼痛通常被描述为：压迫、疼痛、挤压或痉挛。
7.躯体疼痛是由组织中的疼痛感受器刺激引起的，而不是由内部器官的刺激引起的。这包括皮肤、肌肉、关节、结缔组织和骨骼。与内脏疼痛相比，躯体疼痛通常更容易确定位置。躯体疼痛通常感觉像是一种持续的疼痛或啃咬的感觉。它可以进一步分为深部或体表：深部躯体疼痛是在关节、肌腱、骨骼和肌肉中感觉到的疼痛。它通常被描述为疼痛；体表疼痛是在皮肤和黏膜会感觉到的疼痛。它可能会感到尖锐或刺痛。
8.外周神经性疼痛是由外周神经系统的神经结构损伤引起的，如皮肤外周神经末梢的损伤(例如来自伤害性感受器)。这些受损的神经末梢可以在没有刺激的情况下产生脉冲，可以对正常的刺激敏感，和/或可以被剩余的局部炎症刺激触发。即使表皮中有极少数受损和过度活跃的小神经纤维也足以引发外周神经性疼痛。例如由于糖尿病性神经病变、带状疱疹后遗神经痛、三叉神经痛、慢性特发性轴突多发性神经病变(chronic idiopathic axonal polyneuropathy)和化疗引起的多发性神经病变引起的外周神经性疼痛。
9.两种最常用的治疗神经性疼痛的外用化合物是辣椒素(一种香草素受体激动剂和抗刺激剂)和利多卡因(一种膜稳定剂)。然而，0.025％至0.075％的外用辣椒素和8％辣椒
素的贴片都有缺点，即应用其经常会引起难以忍受的副作用，例如增加烧灼感，而治疗通常必须与局部麻醉剂相结合，以中和这种副作用(jay gw&barkin rl，2014)。美国专利申请2014/0141056和美国专利申请2013/0184351中公开的5％外用利多卡因贴片需要每12小时更换一次，不能用于伤口、溃疡、受损或发炎的皮肤，常见于患有糖尿病性神经病变的患者，并且在应用于脚趾时可能会出现问题，特别是在老年人中，因为贴片必须要剪掉。此外，市场上还有其他外用形式的利多卡因，在乳膏和凝胶中比例高达8％(deny s等，2014)。然而，目前尚无来自高质量随机对照试验的证据支持使用外用利多卡因治疗神经性疼痛，尽管一些个别研究似乎表明外用利多卡因可能能够有效缓解神经性疼痛(derry s等，2014)。然而，患者和其医生之间的共识是，患有神经性疼痛的患者对局部利多卡因的反应率，以及更普遍地对任何神经性疼痛药物的反应率，无论是局部还是口服，仍然令人非常不满意。
10.越来越多的人认为“神经性疼痛”是一个不充分的容器概念。“神经性疼痛”是一种以各种病理过程为特征的不同病理状态的集合。期望一种治疗性分子能对一系列不同的神经性疼痛综合征有效，显然是一个过高的要求。因此迫切需要为患有特定神经性疼痛的患者制定个性化的治疗策略。此外，在长期使用的情况下，例如每天、每周或每月几次，持续几天、几周、几个月、几年，强烈需要减少副作用的治疗方案，或者更好的、没有副作用的治疗方案。


技术实现要素：

11.本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并至少靶向包含或由序列seq id no:3的核苷酸219～229组成的区域。具体地，本发明由权利要求定义。
12.本发明的详细说明：
13.发明人已经证明，靶向fxyd2区域可用于抑制和/或降低fxyd2的表达和/或活性。他们设计并合成了一种靶向大鼠和人fxyd2基因的反义寡核苷酸(aso；例如seq id no:17)。他们已经利用两种大鼠疼痛模型(神经性疼痛和炎性疼痛)中进行了fxyd2优化的aso的鞘内注射。他们已经证明，fxyd2 aso能有效降低其在大鼠背根神经节(drg)中的表达。他们已经证明，fxyd2 aso可显著降低脊髓神经结扎(snl)大鼠模型中的神经病理性疼痛，而且fxyd2 aso对神经性疼痛的镇痛作用好于目前市场领先的齐康诺肽(ziconotide)。他们还表明，fxyd2 aso可显著降低完全弗氏佐剂(cfa)诱导的大鼠模型中的炎症性疼痛。
14.因此，发明人已经获得了治疗疼痛的工具，更特别是神经性疼痛。
15.本发明的序列
16.在第一方面，本发明涉及一种fxyd2抑制剂，其中所述抑制剂可以降低fxyd2在需要fxyd2的受试者中的表达和/或活性，并至少靶向包含或由具有seq id no:3序列的核苷酸219～229组成的区域。
17.如本文所用，术语“fxyd2”是指含有离子转运调节器2的fxyd结构域。它在本领域具有普遍含义，指的是na、k-atp酶的γ-亚基。该术语包括天然存在的fxyd2变体及其修饰形式。fxyd2 mrna序列可在ncbi基因id no:486中找到。
18.天然存在的人fxyd2基因变体b的核苷酸序列如genbank登录号nm021603.4所示。智人fxyd2转录变体b的核苷酸序列cdna由序列seq id no:1(593bp)定义：
19.actctccatccaggccccaggcaagcagcacctccctgctctcctgcactcctggacacaaccagcagctcctgccatggacaggtggtacctgggcggcagccccaagggggacgtggacccgttctactatgactatgagaccgttcgcaatgggggcctgatcttcgctggactggccttcatcgtggggctcctcatcctcctcagcagaagattccgctgtgggggcaataagaagcgcaggcaaatcaatgaagatgagccgtaacagcagcctcggcggtgccacccactgcactggggccagctgggaagccaagcatggccctgcctctggcgcctccccttcttccctgggctttagacctttgtccccgtcactgccagcgcttgggctgaaggaagctccagactcaatgtgacccccaggtggcatcgccaactcctgcctcgtgccacctcatgcttataataaagccggcgtcagagaccgctgcttccctcacctgcctgcctgtctccctcctctgtcaccaccagcctctccaagctcaagtacaaatacagccgggtctcatttgttttttcaa.
20.天然存在的人fxyd2基因变体a的核苷酸序列如genbank登录号nm001680.5所示。智人fxyd2转录变体a的核苷酸序列cdna由序列seq id no:2(589bp)定义：
21.agacactctccaaaaagcagagacagcaggaagaggggagtggaggcagcccattcacctggggaaatgactgggttgtcgatggacggtggcggcagccccaagggggacgtggacccgttctactatgactatgagaccgttcgcaatgggggcctgatcttcgctggactggccttcatcgtggggctcctcatcctcctcagcagaagattccgctgtgggggcaataagaagcgcaggcaaatcaatgaagatgagccgtaacagcagcctcggcggtgccacccactgcactggggccagctgggaagccaagcatggccctgcctctggcgcctccccttcttccctgggctttagacctttgtccccgtcactgccagcgcttgggctgaaggaagctccagactcaatgtgacccccaggtggcatcgccaactcctgcctcgtgccacctcatgcttataataaagccggcgtcagagaccgctgcttccctcacctgcctgcctgtctccctcctctgtcaccaccagcctctccaagctcaagtacaaatacagccgggtctcatttgttttttcaa.
22.天然存在的人fxyd2基因有一个共同的序列，编码的两种变体(a和b)的核苷酸序列，并由序列seq id no:3定义：
[0023]5’‑
91
[0024]
ggcggcagccccaagggggacgtggacccgttctactatgactatgagaccgttcgcaatgggggcctgatcttcgctggactggccttcatcgtggggctcctcatcctcctcagcagaagattccgctgtgggggcaataagaagcgcaggcaaatcaatgaagatgagccgtaa 267-3’.
[0025]
在具体的实施方案中，智人fxyd2的核苷酸序列arn，转录变体b，由序列seq id no:4定义：
[0026]
uga gag gua ggu ccg ggg ucc guu cgu cgu gga ggg acg aga gga cgu gag gac cug ugu ugg ucg ucg agg acg gua ccu guc cac cau gga ccc gcc guc ggg guu ccc ccu gca ccu ggg caa gau gau acu gau acu cug gca agc guu acc ccc gga cua gaa gcg acc uga ccg gaa gua gca ccc cga gga gua gga gga guc guc uuc uaa ggc gac acc ccc guu auu cuu cgc guc cgu uua guu acu ucu acu cgg cau ugu cgu cgg agc cgc cac ggu ggg uga cgu gac ccc ggu cga ccc uuc ggu ucg uac cgg gac gga gac cgc gga ggg gaa gaa ggg acc cga aau cug gaa aca ggg gca gug acg guc gcg aac ccg acu ucc uuc gag guc uga guu aca cug ggg guc cac cgu agc ggu uga gga cgg agc acg gug gag uac gaa uau uau uuc ggc cgc agu cuc ugg cga cga agg gag ugg acg gac gga cag agg gag gag aca gug gug guc gga gag guu cga guu cau guu uau guc ggc cca gag uaa aca aaa aag uu.
[0027]
在具体的实施方案中，智人fxyd2的核苷酸序列arn，转录变体a，由序列seq id no:5定义：
[0028]
ucu gug aga ggu uuu ucg ucu cug ucg ucc uuc ucc ccu cac cuc cgu cgg gua agu gga ccc cuu uac uga ccc aac agc uac cug cca ccg ccg ucg ggg uuc ccc cug cac cug ggc aag aug aua cug aua cuc ugg caa gcg uua ccc ccg gac uag aag cga ccu gac cgg aag uag cac ccc gag gag uag gag gag ucg ucu ucu aag gcg aca ccc ccg uua uuc uuc gcg ucc guu uag uua cuu cua cuc ggc auu guc guc gga gcc gcc acg gug ggu gac gug acc ccg guc gac ccu ucg guu cgu acc ggg acg gag acc gcg gag ggg aag aag gga ccc gaa auc ugg aaa cag ggg cag uga cgg ucg cga acc cga cuu ccu ucg agg ucu gag uua cac ugg ggg ucc acc gua gcg guu gag gac gga gca cgg ugg agu acg aau auu auu ucg gcc gca guc ucu ggc gac gaa ggg agu gga cgg acg gac aga ggg agg aga cag ugg ugg ucg gag agg uuc gag uuc aug uuu aug ucg gcc cag agu aaa caa aaa agu u.
[0029]
天然存在的人fxyd2基因有一个共同的序列，编码的两种变体(a和b)有以下核苷酸序列，并由序列seq id no:6定义：
[0030]
ccg ccg ucg ggg uuc ccc cug cac cug ggc aag aug aua cug aua cuc ugg caa gcg uua ccc ccg gac uag aag cga ccu gac cgg aag uag cac ccc gag gag uag gag gag ucg ucu ucu aag gcg aca ccc ccg uua uuc uuc gcg ucc guu uag uua cuu cua cuc ggc auu
[0031]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2受试者中可以降低fxyd2的表达和/或活性，并靶向序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的至少15个核苷酸。
[0032]
在具体的实施方案中，本发明中的反义寡核苷酸靶向：
[0033]-包含或由序列为seq id no:3的核苷酸210～238组成的区域；和/或
[0034]-包含或由序列为seq id no:3的核苷酸210～267组成的区域。
[0035]
在具体的实施方案中，根据本发明中的抑制剂至少靶向包含或由序列为seq id no:3的核苷酸组成的区域。
[0036]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2抑制剂，其中所述抑制剂在需要的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并至少靶向包含或由序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6组成的核苷酸。
[0037]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向包含或由下列核酸219-229组成的区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6。
[0038]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向包含或由下列核酸210-238组成的区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6。
[0039]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向包含或由下列核酸210-267构成的区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:
6。
[0040]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向包含下列核酸91至267的区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6。
[0041]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向由下列核酸91至267组成的区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6。
[0042]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向包含下列核酸区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6。
[0043]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂在需要fxyd2的受试者中降低fxyd2的表达和/或活性，并且靶向由下列核酸组成的区域：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6。
[0044]
在具体的实施方案中，根据本发明中的反义寡核苷酸靶向由具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和/或seq id no:6定义的核苷酸序列。
[0045]
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸具有至少15个核苷酸的长度。
[0046]
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸具有15至25个核苷酸的长度
[0047]
特别的是，本发明的寡核苷酸具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度。
[0048]
如本文所用，术语“抑制剂”是指具有抑制或降低fxd2表达和/或活性的生物学效应的天然或合成化合物。
[0049]
在具体的实施方案中，基因表达抑制剂是指具有降低和/或抑制fxyd2基因表达的生物学效应的天然或合成化合物。本领域技术人员将理解，抑制基因的表达，例如fxyd2基因，通常会导致靶细胞或组织中基因产物(蛋白质，例如fxyd2蛋白)的减少甚至消除，尽管可以实现不同程度的抑制。抑制或减少表达通常称为敲低(knockdown)。
[0050]
在具体的实施方案中，fxyd2活性抑制剂是指具有降低和/或抑制fxyd2活性的生物学效应的天然或合成化合物。
[0051]
在具体的实施方案中，fxyd2基因表达的抑制剂为sirna、shrna、反义寡核苷酸、mirna或核酶。
[0052]
在一个实施方案中，本发明中的fxyd2抑制剂是sirna。
[0053]
小的抑制性rna，也称为短干涉rna(sirna)，也可以在本发明中用作fxyd2表达抑制剂。用小双链rna(dsrna)或导致产生小双链rna的载体或构建体处理受试者或细胞，使fxyd2的表达通过以序列特异性方式降解mrna而被特异性抑制(即rna干扰或rnai)，可以降低fxyd2基因表达。对于序列已知的基因，选择合适的dsrna或dsrna编码载体的方法在本领域是已知的(参见例如，tuschl，t.等(1999)；elbashir，s.m.等(2001)；mcmanus,mt.等(2002)；mcmanus,mt.等(2002)；brummelkamp，tr.等(2002)；美国专利第6573099号和第6506559号；以及国际专利出版号：wo 01/36646、wo 99/32619和wo 01/68836，其中每一项都通过引用将其整体并入本发明)。
[0054]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种fxyd2的抑制剂，其中所述抑制剂是sirna。
[0055]
在具体的实施方案中，根据本发明中的sirna靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2、seq di no:3、seq di no:4、seq id no:5或者seq di no:6所设定的核酸组成的区域。
[0056]
在具体的实施方案中，根据本发明中的sirna靶向包含或由seq id no:3设定的核酸组成的区域。
[0057]
在具体的实施方案中，根据本发明中的sirna由以下组成的序列组成：seq id no:31。seq id no:31所设定的核酸由以下核酸定义：5'aagauuccgcugugggggc(uu)3'。
[0058]
在一个实施方案中，根据本发明中的fxyd2抑制剂是shrna。
[0059]
短发夹rna(short hairpin rnas)(shrna)也可在本发明中用作fxyd2表达抑制剂。短发夹rna(shrna)是一种能使发夹状结构紧密转动的rna序列，可通过rna干涉抑制基因表达。shrna通常使用被引入到细胞内的载体表达，其中该载体利用u6启动子确保shrna始终得到表达。这种载体通常会被传递给子细胞，使基因沉默得以遗传。shrna发夹结构被细胞机制切割成sirna，然后与rna诱导的沉默复合体(risc)结合。该复合体结合并裂解与它所结合的sirna相匹配的mrna。
[0060]
在一个实施方案中，根据本发明中的fxyd2抑制剂是mirna。
[0061]
mirna(mir)也可以用作本发明中使用的fxyd2表达抑制剂。mirna在本领域中具有其普遍意义，是指长度通常为21至22个核苷酸的微小rna分子，尽管已有长度为19至23个核苷酸的报道，并且抑制靶向mrna的翻译。mirna均由较长的前体rna分子(“前体mirna”)加工而成。前体mirna是从非蛋白质编码基因转录而来的。前体mirna具有两个互补区域，使它们能够形成类似茎环或叠状结构，在动物体内被称为dicer的核糖核酸酶iii样核酸酶裂解。经过处理的mirna通常是茎的一部分。经过处理的mirna(也称为“成熟mirna”)成为一个大型复合物的一部分，用于下调，例如减少特定靶基因的翻译。
[0062]
可以使用多个mirnas敲低fxyd2。mirnas可以与不同的靶转录物或靶转录物的不同结合位点互补。还可以利用多顺反子转录本提高靶基因敲低效率。在一些实施方案中，编码相同mirnas或不同mirnas的多个基因可在单个转录本中共同调节或在单个载体盒中作为单独转录本调节。在一个实施方案中，该载体是病毒载体，包括但不限于重组腺相关病毒(raav)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和基于逆转录转座子的载体系统。
[0063]
在一个实施方案中，fxyd2抑制剂是反义核酸。
[0064]
本发明的fxyd2表达的抑制剂是基于反义寡核苷酸构建的。反义寡核苷酸，包括反义rna分子和反义dna分子，通过与fxyd2 mrna结合从而阻止蛋白质的翻译，或通过增加mrna的降解降低细胞中fxyd2蛋白的水平，从而降低活性，从而直接阻断fxyd2 mrna的翻译。例如，可以通过常规的磷酸二酯技术合成至少约15个碱基并与编码fxyd2的mrna转录序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，并通过静脉注射或输注等方式给药。反义技术用于特异性地减轻序列已知的基因表达的方法是本领域熟知的(参见例如，美国专利us6,566,135、us6,566,131、us6,365,354、us6,410,323、us6,107,091、us6,046,321和us5,981,732，每一项都通过引用将其整体并入本发明)。
[0065]
与正义靶序列互补的反义rna由dna序列编码，用于产生前述任何一种抑制剂(例如：反义、sirna、shrna或mirna)。将编码相关的双链rna的dna纳入基因盒中，例如：dna转录
由启动子控制的表达盒。
[0066]
在具体的实施方案中，fxyd2基因表达的抑制剂是反义寡核苷酸。
[0067]
在具体的实施方案中，fxyd2基因表达的抑制剂是一种分离的、合成的或重组的靶向fxyd2 mrna转录本的反义寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以是任何合适的类型。
[0068]
在一些实施方案中，寡核苷酸是rna寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是dna寡核苷酸。
[0069]
在具体的实施方案中，反义寡核苷酸选自但不限于以下组：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41。
[0070]
[0071][0072]
表1测试反义寡核苷酸序列降低hek293细胞中fxyd2蛋白水平的能力
[0073]
此处所用术语“核苷酸”被定义为一种修饰过的或天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸通常包括嘌呤和嘧啶，其中包括胸苷(t)、胞苷(c)、鸟苷(g)、腺苷(a)和尿苷(u)。
[0074]
如本文所用，术语“寡核苷酸”指的是上文定义的核苷酸的寡聚物。术语“寡核苷酸”指的是3'-5'或5'-3'定向的核酸序列，可以是单链或双链。在本发明范围内使用的寡核苷酸尤其是dna或rna。另外，术语“寡核苷酸类似物”指的是具有以下特征的寡核苷酸：(
ⅰ
)具有经修饰的主链结构，例如：天然寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键以外的主链；以及
ⅱ
)可选的，经修饰的糖基，例如：吗啉基，而非核糖或脱氧核糖基。寡核苷酸类似物支持能够通过watson-crick碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键连接的碱基，其中，类似物主链以允许寡核苷酸类似物分子和标准多核苷酸(例如：单链rna或单链dna)中的碱基之间以特定序列方式形成氢键的连接。特别的，类似物是那些具有基本不带电的含磷主链的类似物。在寡核苷酸类似物中基本不带电的含磷主链是指其中大多数亚单元键合，例如在50～100％之间，通常至少60％～100％或75％或者80％的连接是不带电的，并且含有一个磷原子。
[0075]
术语“寡核苷酸”还指相对于其正常转录方向倒置的寡核苷酸序列，因此对应于与宿主细胞内表达的靶基因mrna分子互补的rna或dna序列(例如，它可以通过watson-crick碱基配对与靶基因mrna分子杂交)。
[0076]
反义链可以以多种不同方式构建，前提是它能够干扰靶基因的表达。例如，反义链可以通过将靶基因的编码区(或其一部分)相对于其正常转录方向反向互补来构建，以允许其互补的转录，(例如由反义和正义基因编码的rna可以是互补的)。在一些实施方案中，寡核苷酸不需要具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，并且靶基因的非编码区段在实现靶基因表达的反义抑制方面可能与编码区段如反义寡核苷酸(aso)同样有效。在一些实施方案中，寡核苷酸具有与靶基因相同的外显子模式，如sirna和反义寡核苷酸(aso)。
[0077]
如本文所用，术语“靶”或“靶向”是指能够与fyxd2基因或编码fxyd2基因产物的fxyd2 mrna特异性结合的寡核苷酸。特别是指能够通过本领域技术人员已知的方法(例如反义、rna干扰)抑制所述基因或所述mrna的寡核苷酸。
[0078]
根据本发明，本发明中的反义寡核苷酸靶向编码fxyd2基因产物的mrna和/或dna，并且能够降低细胞中fxyd2的表达量和/或活性。
[0079]
也就是说，反义寡核苷酸包含与所述mrna序列的一个区域至少部分互补、特别是完全互补的序列，所述互补性足以在细胞内条件下产生特异性结合。如本领域技术人员熟知的，与第二序列“完全互补”的序列是指第二序列的反向互补对应物，无论是以dna分子的形式还是以rna分子的形式。如果存在一个或多个错配，则该序列与第二个序列“部分互补”。
[0080]
本发明的反义寡核苷酸靶向cdna或mrna编码的fxyd2基因(例如包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no：4、seq id no:5或seq id no:6的fxyd2基因)，可以通过使用所述mrna的序列作为基础来设计，例如使用生物信息学工具。
[0081]
特别地，根据本发明的反义寡核苷酸能够降低drg中fxyd2的表达和/或活性。确定寡核苷酸是否能够降低细胞中fxyd2的表达和/或活性的方法是本领域技术人员所已知的。
[0082]
这可通过例如分析fxyd2 rna的表达，例如通过rt-qpcr、原位杂交或fxyd2蛋白表达，免疫组织化学、western印迹以及通过比较待测反义寡核苷酸存在和不存在时fxyd2蛋白表达或fxyd2功能活性。
[0083]
在其他实施方案中，寡核苷酸靶向mrna的翻译起始位点(aug密码子)、编码区(例如一个或多个外显子)、5'-非翻译区或3'-非翻译区中的序列。其目的是干扰信使rna的功能，包括所有重要功能，包括rna易位到蛋白质翻译位点、蛋白质从rna的实际翻译、rna的剪接或成熟，甚至是rna可能参与的独立的催化活动。这种干扰rna功能的总体效果是导致了蛋白质表达的干扰。
[0084]
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸被进一步修饰，特别是化学修饰，以提高体内稳定性和/或治疗效率。本领域技术人员可以容易地提供一些将提高寡核苷酸功效的修饰，例如稳定化修饰(c.frank bennett and eric e.swayze，rna targeting therapeutics:molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platformannu.rev.pharmacol.toxicol.2010.50:259-293；juliano rl.the delivery of therapeutic oligonucleotides.nucleic acids res.2016aug 19；44(14):6518-48)。特别地，在本发明的上下文中使用的寡核苷酸可以包含修饰的核苷酸。化学修饰可发生在三个不同的位点：(i)在磷酸基团，(ii)在糖分子上，和/或(iii)在寡核苷酸的整个主链结构。通常，化学修饰包括主链修饰、杂环修饰、糖修饰和缀合策略。
[0085]
例如：寡核苷酸选自以下组成的组：寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸、小调节性rna(srna)、u7或u1介导的aso或其共轭产物，例如：肽共轭的或纳米粒子复合的aso、通过主链修饰如：吗啉类、磷酸二酰胺吗啉低聚物(磷酸二酰胺吗啉低聚物，pmo)进行化学修饰的寡核苷酸、肽核酸(pna)、硫代磷酸酯(ps)寡核苷酸、立体化学纯硫代磷酸酯(ps)寡核苷酸、氨基磷酸酯修饰的(phosphoramidates modified)寡核苷酸、硫代氨基磷酸酯修饰的(thiophosphoramidate-modified)寡核苷酸、和甲基膦酸酯(methylphosphonate)修饰的寡核苷酸；通过杂环修饰进行化学修饰的寡核苷酸，例如：双环修饰的寡核苷酸、双环核酸
(bna)、三环修饰的寡核苷酸、三环-dna-反义寡核苷酸(asos)、核碱基修饰，如嘧啶核碱基上的5-甲基取代、5-取代的嘧啶类似物，2-硫代胸腺嘧啶修饰的寡核苷酸和嘌呤修饰的寡核苷酸；通过糖修饰的化学修饰的寡核苷酸，例如：锁核酸(lna)寡核苷酸、2',4'-亚甲基氧基桥联核酸(bna)、乙烯桥联核酸(ena)、约束的乙基(cet)寡核苷酸、2'-修饰的rna、2'-和4'-修饰的寡核苷酸，例如：2'-o-me rna(2'-ome)、2'-o-甲氧基乙基rna(moe)、2'-氟rna(frna)和4'-硫代修饰的dna和rna；通过共轭策略进行化学修饰的寡核苷酸，例如：n-乙酰半乳糖胺(galnac)寡核苷酸共轭物，如5'-galnac和3'-galnac aso共轭物、脂质寡核苷酸共轭物(laso)、细胞穿透肽(cpp)寡核苷酸共轭物、靶向寡核苷酸共轭物、抗体寡核苷酸共轭物、聚合物寡核苷酸共轭物，例如：聚乙二醇化和靶向配体；以及例如：bennett and swayze,2010(rna targeting therapeutics:molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as atherapeutic platform.annu rev pharmacol toxicol.2010；50:259-93)；wan and seth,2016(the medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.j med chem.2016nov 10；59(21):9645-9667)；juliano,2016(the delivery of therapeutic oligonucleotides.nucleic acids res.2016aug 19；44(14):6518-48)；lundin et al.,2015(oligonucleotide therapies:the past and the present.hum gene ther.2015aug；26(8):475-85)；and prakash,2011(an overview of sugar-modified oligonucleotides for antisense therapeutics.chem biodivers.2011sep；8(9):1616-41)报道的化学修饰和共轭策略。实际上，为了在体内使用时寡核苷酸可以被稳定化。“稳定化”寡核苷酸是指耐体内降解的寡核苷酸(例如：通过核酸外切酶或核酸内切酶)。稳定化可以是长度或二次结构的函数。尤其是，可通过磷酸酯(phosphate)主链修饰、磷酸二酯修饰、硫代磷酸酯(ps)主链修饰、磷酸二酯修饰和硫代磷酸修饰的组合、硫代氨基磷酸酯修饰(thiophosphoramidate modifications)、2'修饰(2'-o-me，2'-o-(2-甲氧基乙基)(moe)修饰和2'-氟修饰)、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基及其组合物对寡核苷酸进行稳定。
[0086]
在具体的实施方案中，反义寡核苷酸是脂质缀合的，称为laso。在某些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸的修饰通过在3'或5'末端被包含至少三个饱和或不饱和的，尤其是饱和的、直链或支链，尤其是直链的烃链的部分取代而修饰，烃链如wo2014/195432所述，包含2至30个碳原子的烃链，特别是5至20个碳原子，更特别是10至18个碳原子。
[0087]
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸通过在3'或5'末端包含至少一个缩酮官能团的部分取代而修饰，其中所述缩酮官能团的缩酮碳带有两个饱和或不饱和的，尤其是饱和的、直链或支链，特别是直链的烃链，如wo2014/195430中所述，包括1至22个碳原子，特别是6至20个碳原子，特别是10至19个碳原子，甚至更特别是12至18个碳原子。
[0088]
例如，寡核苷酸可以用作硫代磷酸酯衍生物(用硫原子代替非桥连的磷酰基氧原子)，其具有增加的对核酸酶消化的抗性。2'-甲氧基乙基(moe)修饰(如ionis pharmaceuticals商业化的修饰主链)也是有效的。另外或可选地，本发明的寡核苷酸可包含完全、部分或组合的修饰核苷酸，这些核苷酸是在糖的2'位置具有取代的衍生物，特别是具有以下化学修饰：o-甲基(2'-o-me)取代、2-甲氧基乙基(2'-o-moe)取代、氟基(2'-氟)取代、氯基(2'-cl)取代、溴基(2'-br)取代、氰化物基(2'-cn)取代、三氟甲基(2'-cf3)取代、ocf3基(2'-ocf3)取代、ocn基(2'-ocn)取代、o-烷基(2'-o-烷基)取代、s-烷基(2'-s-烷基)
取代、n-烷基(2'-n-烷基)取代、o-烯基(2'-o-烯基)取代、s-烯基(2'-s-烯基)取代、n-烯基(2'-n-烯基)取代、soch3基(2'-soch3)取代、so2ch3基(2'-so2ch3)取代、ono2基(2'-ono2)取代、no2基(2'-no2)取代、n3基(2'-n3)取代和/或nh2基(2'-nh2)取代。另外或可选地，本发明的寡核苷酸可包含完全或部分修饰的核苷酸，其中核糖部分用于产生锁核酸(lna)，在核糖的2'氧和4'碳之间形成共价桥，将其固定在3'-endo构型中。这些分子在生物介质中非常稳定，能够激活rnase h，例如当lna位于末端(gapmer)时，并与互补rna和dna形成紧密杂交。
[0089]
在一些实施方案中，本发明范围内使用的寡核苷酸中包含选自lna、2'-ome类似物、2'-o-met、2'-o-(2-甲氧基乙基)(moe)寡聚物、2'-硫代磷酸酯类似物、2'-氟类似物、2'-cl类似物、2'-br类似物、2'-cn类似物、2'-cf3类似物、2'-ocf3类似物、2'-ocn类似物、2'-o-烷基类似物、2'-s-烷基类似物、2'-n-烷基类似物、2'-o-烯基类似物、2'-s-烯基类似物、2'-n-烯基类似物、2'-soch3类似物、2'-so2ch3类似物、2'-ono2类似物、2'-no2类似物、2'-n3类似物、2'-nh2类似物、三环(tc)-dnas、u7短核(sn)rna、三环-dna-反义寡核苷酸及其组合(2009年4月10日申请的美国临时专利61/212384，关于三环dna反义寡核苷酸、组合物以及疾病治疗方法；该参考文献在本专利中已引用)。
[0090]
在具体的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸是lna寡核苷酸。如本文所用，术语“lna”(锁定核酸)(或“lna寡核苷酸”)是指含有一种或多种双环、三环或多环核苷类似物的寡核苷酸，也称为lna核苷酸和lna类似物核苷酸。lna寡核苷酸、lna核苷酸和lna类似物核苷酸一般描述于国际公开号wo 99/14226和随后的申请中；国际公开号wo 00/56746、wo00/56748、wo 00/66604、wo 01/25248、wo 02/28875、wo 02/094250、wo 03/006475；美国专利号us6,043,060、us6268490、us6770748、us6639051和美国公开号2002/0125241、2003/0105309、2003/0125241、2002/0147332、2004/0244840和2005/0203042，所有这些都通过参考而纳入本文。lna寡核苷酸和lna类似物寡核苷酸可从例如proligo llc,6200lookout road,boulder,co 80301usa获得。
[0091]
本发明的其他形式的寡核苷酸是与基于但不限于慢病毒或腺相关病毒的病毒转移方法结合的小核rna分子如u1或u7的寡核苷酸序列(denti,ma等,2008；goyenvalle,a等,2004)。
[0092]
本发明寡核苷酸的其他形式是肽核酸(pna)。在肽核酸中，寡核苷酸的脱氧核糖主链被替换为更类似于肽而不是糖的主链。每个亚基或单体具有连接到该主链的天然或非天然碱基。其中一种主链是由n-(2-氨基乙基)甘氨酸通过酰胺键连接的的重复单元构成。由于自由基偏离脱氧核糖的主链，这些化合物被命名为肽核酸(dueholm等,new j.chem.,1997,21,19-31)。pna与dna和rna结合，形成pna/dna或pna/rna双链。由此产生的pna/dna或pna/rna双链比相应的dna/dna、dna/rna或rna/rna双链具有更大的亲和力，由tm确定。这种高热稳定性可能是由于pna中中性主链缺乏电荷排斥。pna的中性主链也导致pna/dna(rna)双链的tm几乎不受盐浓度的影响。因此，与高度依赖离子强度的dna/dna、dna/rna或rna/rna双重作用相比，pna/dna(rna)双链的相互作用提供了进一步的优势。已证明高嘧啶pna以反平行方向结合互补dna或rna，形成具有高热稳定性的(pna)2/dna(rna)三链体(参见例如，egholm等，science,1991,254,1497；egholm等，j.am.chem.soc.1992,114,1895；egholm等，j.am.chem.soc.，1992,114,9677)。除了增加亲和力，pna也被证明与dna或rna结合具有增加的特异性。当pna/dna双链错配相对于dna/dna双链解链时，可以看到tm下降8至20℃。
对于存在错配的相应dna/dna双链体，看不到这种tm下降幅度。pna链与dna或rna链的结合可以发生在两种方向之一。pna链与dna或rna链的结合可以发生在两个方向之一。当5'到3'方向的dna或rna链与互补的pna链结合，使得pna的羧基末端指向dna或rna的5'末端，并且pna的氨基端指向dna或rna的3'端时，该方向被称为反平行。在平行方向上，pna的羧基端和氨基端正好与dna或rna的5'-3'方向相反。与寡核苷酸相比，pna的另一个优势是其聚酰胺主链(有适当的碱基或其他侧链基团附着在其上)不被核酸酶或蛋白酶识别，并且不被裂解。因此，pnas与核酸和肽不同，可以对酶的降解具有抗性。wo92/20702描述了一种肽核酸(pna)化合物，其与互补dna和rna的结合比相应的dna更紧密。pna对互补dna表现出很强的结合亲和力和特异性(egholm,m.等,chem.soc.,chem.commun.,1993,800；egholm,m.,等,nature,1993,365,566；和nielsen,p.等.nucl.acids res.,1993,21,197)。此外，pna在细胞提取物中显示出核酸酶抗性和稳定性(demidov,v.v.等,biochem.pharmacol.,1994,48,1309-1313)。pna的修饰包括延伸的主链(hyrup,b.等.chem.soc.,chem.commun.,1993,518)，主链和核碱基之间的延伸连接子，酰胺键(the amida bond)的反转(lagriffoul,ph等,biomed.chem.lett.,1994,4,1081)，以及使用基于丙氨酸的手性主链(dueholm,k.l等,biomed.chem.lett.,1994,4,1077)。美国专利号us5,539,082和美国专利号us5,539,083描述了肽核酸。美国专利申请号08/686,113中进一步描述了肽核酸。
[0093]
通常，本发明的寡核苷酸是通过本领域技术人员所熟知的常规方法获得的。例如，本发明的寡核苷酸可以使用本领域众所周知的许多方法中的任何一种从头合成。例如，b-氰乙基磷酰胺法(beaucage等，1981)；核苷h-膦酸盐法(garegg等，1986；froehler等，1986，garegg等，1986，gaffney等，1988)。这些化学反应可以通过市场上各种可用的自动化核酸合成器来完成。这些核酸可称为合成核酸。或者，可以在质粒中大规模生产寡核苷酸(见sambrook等，1989)。寡核苷酸可以使用已知技术从现有的核酸序列制备，例如使用限制性内切酶、外切核酸酶或内切核酸酶的技术。以这种方式制备的寡核苷酸可以称为分离的核酸。
[0094]
本领域技术人员可以容易地提供一些用于增强寡核苷酸的递送和功效的方法和修饰，例如寡核苷酸的化学修饰、基于脂质和聚合物的纳米颗粒或纳米载体、通过将寡核苷酸连接到靶向剂的配体-寡核苷酸缀合物例如碳水化合物、肽、抗体、适体、脂质或改善寡核苷酸递送的小分子和小分子，如juliano rl中所述。改善寡核苷酸的递送。nucleic acids res.2016aug19；44(14):6518-48。亲脂性缀合物和脂质缀合物包括脂肪酸-寡核苷酸缀合物、固醇寡核苷酸偶联物和维生素-寡核苷酸偶联物。
[0095]
在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸与第二分子缀合。通常，所述第二分子选自适体、抗体或多肽组成的组。例如，本发明的寡核苷酸可以与细胞穿透肽缀合。细胞穿透肽是本领域众所周知的，例如tat肽(bechara c,sagan s.cell-penetrating peptides:20years later,where do we stand？febs lett.2013jun 19；587(12):1693-702)。
[0096]
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸与载体或媒介物相关联，例如脂质体或胶束，尽管可以使用其他载体，正如本领域技术人员所熟知的。脂质体是由具有类似于生物膜结构的脂质双分子层制成的囊泡。此类载体用于促进寡核苷酸的细胞摄取或靶向，或改善寡核苷酸的药代动力学或治疗特性。例如，本发明的寡核苷酸也可以包封在脂质体、药物组合物中给药，其中活性成分分散或不同地存在于由附着于脂质层的水性同心层组成的小体
中。根据溶解度的不同，该寡核苷酸可同时存在于水层和脂质层中，或者存在于通常称为脂质体悬浮液的物质中。疏水层一般但不限于此，包括磷脂(如卵磷脂和鞘磷脂)、类固醇(如胆固醇)、或多或少的离子表面活性剂(如二乙酰磷酸盐、硬脂胺或磷脂酸)或其他具有疏水性质的材料。脂质体的直径一般在15纳米至5微米之间。使用脂质体作为药物传递载体具有几个优点。脂质体增加细胞内稳定性，提高吸收效率并改善了生物活性。脂质体是由脂质组成的中空球形囊泡，其排列方式与构成细胞膜的脂质相似。它们具有用于捕获水溶性化合物的内部水空间，尺寸范围为直径0.05至几微米。一些研究表明，脂质体可以将核酸输送到细胞，并且核酸保持生物活性。例如，最初设计作为研究工具的脂质体递送载体，如lipofectin，可以递送完整的核酸分子到细胞。使用脂质体的具体优点包括：它们在组合物中无毒且可生物降解；它们显示出较长的循环半衰期；识别分子可以很容易地附着在它们的表面上以靶向组织。最后，以液态悬浮液或冻干产品形式的基于脂质体的药物，其成本效益生产已经证明了该技术作为可接受的药物递送系统的可行性。
[0097]
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸与络合剂络合，以增加寡核苷酸的细胞摄取。络合剂的一个实例包括阳离子脂质。阳离子脂质可用于将寡核苷酸递送至细胞。术语“阳离子脂质”包括具有极性和非极性结构域的脂质和合成脂质，它们能够在生理ph或其周围带正电荷，并与聚阴离子如核酸结合并促进核酸的进入细胞。一般而言，阳离子脂质包括饱和和不饱和烷基和脂环族醚以及胺的酯、酰胺或其衍生物的酯。阳离子脂质的直链和支链烷基和链烯基可含有例如1至约25个碳原子。特别地，直链或支链烷基或烯烃基团具有六个或更多个碳原子。脂环族基团包括胆固醇和其他类固醇基团。阳离子脂质可以用多种抗衡离子(阴离子)制备，包括例如cl-、br-、i-、f-、乙酸盐、三氟乙酸盐、硫酸盐、亚硝酸盐和硝酸盐。阳离子脂质的实例包括：聚乙烯亚胺、聚酰胺(pamam)星爆树突状大分子(polyamidoamine(pamam)starburst dendrimers)、lipofectin(dotma和dope的组合)、lipofectase、lipofectamine、dope、cytofectin(gilead sciences,foster city,calif.)和eufectins(jbl,san luis obispo,calif.)。阳离子脂质体可包含以下物质：n-[1-(2,3-二油氧基)-丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(n-[1-(2,3-dioleoloxy)-propyl]-n,n,n-trimethylammonium chloride)(dotma)、n-[1-(2,3-二油氧基)-丙基]-n,n,n-三甲基甲基硫酸铵(n-[1-(2,3-dioleoloxy)-propyl]-n,n,n-trimethylammonium methylsulfate)(dotap)、3p-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(3p-[n-(n',n'-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol)(dc-chol)、2,3,-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-三氟乙酸丙胺(2,3,-dioleyloxy-n-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-n,n-dimethyl-1-propanami nium trifluoroacetate)(dospa)、1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-1-羟乙基溴化铵(1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethy-1-hydroxyethyl ammonium bromide)和二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide)(ddab)。例如，阳离子脂质n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)被发现可将硫代磷酸酯寡核苷酸的反义效应提高1000倍。(vlassov等，1994,biochimica et biophysica acta 1197:95-108)。寡核苷酸也可以与例如聚(l-赖氨酸)或抗生物素蛋白复合，这种混合物中可以包括也可以不包括脂类(例如，甾体聚(l-赖氨酸))。阳离子脂质已被用于本领域将寡核苷酸递送至细胞(参见例如，美国专利号us5,855,910、us5,851,548、us5,830,430、us5,780,053、us5,767,099；
lewis等，1996.proc.natl.acad.sci.usa 93:3176；hope等，1998.molecular membrane biology15:1)。可用于促进本发明寡核苷酸吸收的其他脂质组合物可与所述方法结合使用。除了上文列出的那些，其他脂质组合物也是本领域已知的并且包括如，美国专利号us4,235,871、美国专利号us4,501,728、us4,837,028、us4,737,323中所公开的内容。
[0098]
在特定的实施方案中，根据本发明的抑制剂，其中所述抑制剂靶向由seq id no:3的核苷酸组成的区域。
[0099]
在具体的实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸包含由以下组成的序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41。
[0100]
在具体的实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸由以下序列组成：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41。
[0101]
在具体的实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸包含和/或由以下组成的序列组成：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41。
[0102]
在具体的实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸包含或由seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26组成的序列。
[0103]
在具体的实施方案中，根据本发明的抑制剂和/或反义寡核苷酸，其中所述抑制剂和/或反义寡核苷酸能够降低背根神经节(drg)中fyxd2的量。
[0104]
根据本发明，第一核酸序列与第二核酸序列具有至少70％的同一性，即第一核酸序列与第二核酸序列具有70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性。核酸序列的同一性特别是使用合适的序列比对算法和默认参数来确定，如blast n(karlin and altschul,proc.natl acad.sci.usa87(6):2264-2268(1990)。
[0105]
本发明的载体
[0106]
在第二方面，本发明涉及一种用于递送异体核酸的载体，其中该核酸编码一种抑
no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41的载体，其编码fxyd2的一部分或片段，或其变体。
[0119]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种由以下内容组成的载体：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41，其编码fxyd2的一部分或片段，或其变体。
[0120]
在另一个实施方案中，本发明的载体包括该序列的任何变体：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30、seq id no:26或seq id no:27，其编码fxyd2的一部分或片段，或其变体。
[0121]
在另一个实施方案中，本发明的载体由以下序列的任何变体组成：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41，其编码fxyd2的一部分或片段，或其变体。
[0122]
在具体的实施方案中，本发明的载体由以下序列的任何变体组成：seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26。
[0123]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种载体，包括一个选自但不限于seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的序列和启动子。
[0124]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含或由一个序列组成的载体，该序列选自但不限于seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41以及启动子。
[0125]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含或由一个序列组成的载体，该序列选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26以及启动子。
[0126]
在另一个实施方案中，根据本发明的载体，其中所述反义寡核苷酸靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4，seq id no:5或seq id no:6的核
苷酸以及u6启动子或polii启动子组成的区域。
[0127]
在一些实施方案中，所述载体包含的序列是选自但不限于seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41的组别中的序列以及u6启动子或polii启动子。
[0128]
在一些实施方案中，该载体包含选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26的组别中的一个序列以及u6启动子或polii启动子组成的序列。
[0129]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含对fxyd2的部分或片段或其变体进行编码的寡核苷酸序列以及cag启动子的载体。
[0130]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含对mirna的部分或片段或其变体进行编码的寡核苷酸序列以及cag启动子的载体。
[0131]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含对shrna的部分或片段或其变体进行编码的寡核苷酸序列以及u6启动子的载体。
[0132]
在另一个实施方案中，根据本发明的载体，其中所述反义寡核苷酸靶向包含或由具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸以及cag启动子组成的区域。
[0133]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含一个序列的载体，该序列选自但不限于seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41以及cag启动子。
[0134]
在具体的实施方案中，本发明的载体包含一个序列，该序列选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和cag启动子。
[0135]
变体，包括，例如由于个体之间的等位基因变异(例如多态性)，选择性剪接形式等而自然发生的变体。术语“变体”还包括来自其他来源或生物体的本发明基因序列。变体优选与本发明的序列基本上同源，即表现出与本发明序列的核苷酸序列一致性通常至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％、更优选至少约95％。本发明基因的变体还包括在严格杂交条件下与上述定义的序列(或其互补链)杂交的核酸序列。典型的严格杂交条件包括温度高于30℃，优选高于35℃，更优选超过42℃，和/或盐度低于约500mm，优选低于200mm。杂交条件可由技术人员通过改变温度、盐度和/或其他试剂如sds、ssc等的浓度来调整。
[0136]
在具体的实施方案中，根据本发明使用的载体是非病毒载体或病毒载体。
id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41。
[0153]
在具体实施例中，本发明的腺相关病毒(aav)载体包含一个序列的任何变体，该序列选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26。
[0154]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的寡核苷酸序列。
[0155]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的反义序列。
[0156]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的mirna序列。
[0157]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的shrna序列。
[0158]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的寡核苷酸序列以及cag启动子。
[0159]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的反义序列以及cag启动子。
[0160]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的mirna序列以及cag启动子。
[0161]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的shrna序列以及cag启动子。
[0162]
在具体的实施方案中，本发明涉及包含反义寡核苷酸的腺相关病毒(aav)载体，该反义寡核苷酸靶向包含或由seq id no:1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸组成的区域以及cag启动子。
[0163]
在具体的实施方案中，本发明涉及腺相关病毒(aav)载体，其包含序列seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41和cag启动子。
[0164]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种腺相关病毒(aav)载体，其包含一个序列，该序列选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no：19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和cag启动子。
[0165]
在一个实施方案中，aav载体是aav1、aav2、aav3、aav4、aa5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aavrh.10或可以感染人、啮齿动物、猴子或其他物种的任何其他aav血清型。
[0166]“aav载体”是指来源于腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aavrh.10等。aav载体可以有一个或多个aav野生型基因全部或部分缺失，例如rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼itr序列。功能性itr序列对于aav病毒粒子的拯救、复制和包装是必需的。因此，aav载体在本发明中被定义为至少包括以顺式方式复制和包装病毒所需的那些序列(例如，功能性itr)。itr不需要是野生型多核苷酸序列，并且可以通过例如，核苷酸的插入、缺失或替换进行改变，只要序列提供功能性拯救、复制和包装。使用已知技术构建aav表达载体以至少提供包括在转录方向上可操作连接的组分、控制元件包括转录起始区、目标dna(即本发明的核酸序列)和转录终止区。
[0167]
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法中使用的病毒载体是重组腺相关病毒(raav)。raav可以是本领域已知的任何血清型、修饰或衍生物，或其本领域已知的任何组合(例如，包含两种或更多种血清型的raav群体，例如，包含raav2、raav8和raav9中的两种或更多种)。在一些实施方案中，raav是raav1、raav2、raav3、raav4、raav5、raav6、raav7、raav8、raav9、raav10、raav-11、raav-12、raav-13、raav-14、raav-15、raav-16、raav.rh8、raav.rh10、raav.rh20、raav.rh39、raav.rh74、raav.rhm4-1、aav.hu37、raav.anc80、raav.anc80l65、raav.7m8、raav.php.b、raav2.5、raav2tyf、raav3b、raav.lk03、raav.hsc1、raav.hsc2、raav.hsc3、raav.hsc4、raav.hsc5、raav.hsc6、raav.hsc7、raav.hsc8、raav.hsc9、raav.hsc10、raav.hsc11、raav.hsc12、raav.hsc13、raav.hsc14、raav.hsc15或raav.hsc16，或其他raav，或其两种或更多种的组合。
[0168]
在一些实施方案中，用于本发明的组合物和方法的raav包含来自aav衣壳血清型的衣壳蛋白，所述aav衣壳血清型选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-11、aav-12、aav-13、aav-14、aav-15、aav-16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16，或衍生物、修饰，或其假型。在一些实施方案中，raav与aav衣壳血清型的vp1、vp2和/或vp3序列包含至少80％或更多相同的衣壳蛋白，例如有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％，即最多100％的同一性，aav衣壳血清型的vp1、vp2和/或vp3序列选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-11、aav-12、aav-13、aav-14、aav-15、aav-16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16。
[0169]
在某些实施方案中，在本发明所述的方法中使用的aav是anc80或anc80l65，正如zinn等人，2015：1056-1068中所述，通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，用
于本发明所述方法的aav包含下述氨基酸插入之一：lgettrp(seq id no:14)或lalgettrp(seq id no:15)，正如美国专利us9,193,956、us9458517和us9,587,282和美国专利申请公布号2016/0376323中所述，每一个都通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，本发明所述方法中使用的aav是aav.7m8，正如美国专利us9,193,956、us9,458,517和us9,587,282和美国专利申请公布号2016/0376323中所述，每一个都通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，用于本发明所述方法的aav是美国专利us9,585,971中公开的任何aav，例如aav-php.b。在某些实施方案中，本发明所述方法中使用的aav是美国专利us9,840,719和wo 2015/013313中公开的任何aav，例如aav.rh74 rhm4-1，每一个都通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，在本发明所述的方法中使用的aav是在wo 2014/172669中公开的任何aav，例如aav rh.74，通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，本发明所述方法中使用的aav2/5，如georgiadis等人，2016，gene therapy23：857-862和georgiadis等人，2018，gene therapy 25：450中所述，其中的每一个都通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，在本发明所述的方法中使用的aav是wo 2017/070491中公开的任何aav，例如aav2tyf，通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，本发明所述方法中使用的aav是aavlk03或aav3b，如puzzo等,2017,sci.transl.med.29(9):418中所述，通过引用将其整体并入本发明。在某些实施方案中，用于本发明所述方法的aav是美国专利us8,628,966、us8,927,514、us9,923,120和wo 2016/049230中公开的任何aav，例如hsc1、hsc2、hsc3、hsc4、hsc5、hsc6、hsc7、hsc8、hsc9、hsc10、hsc11、hsc12、hsc13、hsc14、hsc15或hsc16，通过引用以其整体并入本发明。
[0170]
在某些实施方案中，本发明所述方法中使用的aav是在以下专利和专利申请中的任何一个公开的aav，这些专利和专利申请中的每一个都通过引用将其整体并入本发明：美国专利us7,282,199、us7,906,111、us8,524,446、us8,999,678、us8,628,966、us8,927,514、us8,734,809、us9,284,357、us9,409,953、us9,169,299、us9,193,956、us9458517和us9,587,282和美国公开号2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257和国际专利申请号pct/us2015/034799、pct/ep2015/053335。在一些实施方案中，raav与以下任何专利和专利申请中公开的aav衣壳的vp1、vp2和/或vp3序列具有至少80％或更多相同的衣壳蛋白，即例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％，即最多100％的同一性，其中的每一个都通过引用将其整体并入本发明：美国专利us7,282,199、us7,906,111、us8,524,446、us8,999,678、us8,628,966、us8,927,514、us8,734,809、usus 9,284,357、us9,409,953、us9,169,299、us9,193,956、us9458517和us9,587,282，美国公开号2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257和国际专利申请号pct/us2015/034799、pct/ep2015/053335。
[0171]
在一些实施方案中，raav具有国际公开号wo 2003/052051(参见例如，seq id no:2)、wo 2005/033321(参见例如，seq id nos:123和88)、wo03/042397(参见例如，seq id nos:2、81、85和97)、wo 2006/068888(参见例如，seq id nos:1和3-6)、wo 2006/110689(参见例如，seq id nos:5-38)、wo2009/104964(参见例如，seq id nos:1-5、7、9、20、2、24和31)、w0 2010/127097(参见例如，seq id nos:5-38)和wo 2015/191508(参见例如，seq id nos:80-294)和美国公开号20150023924(参见例如，seq id nos:1、5-10)中公开的衣壳蛋
白，每一个都通过引用将其整体并入本发明。在一些实施方案中，raav与公开在或国际公开号wo 2003/052051(参见例如，seq id no:2)、wo 2005/033321(参见例如，seq id nos:123和88)、wo 03/042397(参见例如，seq id nos:2、81、85和97)、wo2006/068888(参见例如，seq id nos:1和3-6)、wo 2006/110689(参见例如，seq id nos:5-38)、wo2009/104964(参见例如，seq id nos:1-5、7、9、20、22、24和31)、w0 2010/127097(参见例如，seq id nos:5-38)和wo 2015/191508(参见例如，seq id nos:80-294)和美国公开号20150023924(参见例如，seq id nos:1、5-10)的aav衣壳血清型的vp1、vp2和/或vp3序列具有至少80％或更多相同的衣壳蛋白，即例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％，高达100％的同一性。
[0172]
使用例如在美国专利us7,282,199、us7,906,111、us8,524,446、us8,999,678、us8,628,966、us8,927,514、us8,734,809、us9,284,357、us9,409,953、us9,169,299、us9,193,956、us9458517和us9,587,282，美国公开号2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257，国际专利申请号pct/us2015/034799、pct/ep2015/053335；wo 2003/052051、wo 2005/033321、wo 03/042397、wo 2006/068888、wo 2006/110689、wo2009/104964、w0 2010/127097和wo 2015/191508和美国公开号20150023924公开的基于aav的病毒载体的核酸序列和制备重组aav和aav衣壳的方法。
[0173]
在另外的实施方案中，raav包含假型raav。在一些实施方案中，假型raav是raav2/8或raav2/9假型raav。生产和使用假型raav的方法是本领域熟知的(参见例如：duan et al.,j.virol.,75:7662-7671(2001)；halbert et al.,j.virol.,74:1524-1532(2000)；zolotukhin et al.,methods 28:158-167(2002)；and auricchio et al.,hum.molec.genet.10:3075-3081,(2001))。
[0174]
在另外的实施方案中，raav包含嵌合两种或更多种aav衣壳血清型的衣壳蛋白的衣壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白是选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-11、aav-12、aav-13、aav-14、aav-15、aav-16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16的aav血清型的2种或更多种aav衣壳蛋白的嵌合体。
[0175]
在某些实施方案中，可以使用单链aav(ssaav)。在某些实施方案中，可以使用自互补载体，例如scaav(参见例如：wu,2007,human gene therapy,18(2):171-82,mccarty et al,2001,gene therapy,vol.8,number 16,pages1248-1254和美国专利us6,596,535、us7,125,717和us7,456,683,每一个都通过引用将其整体并入本发明)。
[0176]
在某些实施方案中，用于递送转基因的重组aav载体对drg中的细胞具有趋性。这样的载体可以包括非复制的“raav”，优选那些带有aav8或aavrh10衣壳的载体。在某些实施方案中，本发明提供的病毒载体是基于aav9或aavrh10的病毒载体。在某些实施方案中，本文提供的基于aav8或aavrh10的病毒载体保留了对drg的趋性。可以使用aav变体衣壳，包括但不限于wilson在美国专利us7,906,111所描述的aav变体衣壳，特别优选aav/hu.31和aav/hu.32，通过引用将其整体并入本发明；以及由chatterjee在美国专利us8,628,966、美
国专利us8,927,514和smith等，2014，mol ther 22：1625-1634中描述的aav变体衣壳，每一个都通过引用将其整体并入本发明。
[0177]
在某些实施方案中，本发明涉及一种重组腺相关病毒(raav)，该病毒包括(i)包含在调控元件控制下并由itr侧翼的转基因的表达盒，以及(ii)aav衣壳，其中，转基因编码一种抑制性rna，该rna特异性地结合fxyd2mrna并抑制细胞中fxyd2的表达。
[0178]
在特定的实施方案中提供了包括人工基因组的aav载体，该人工基因组包括(i)包含在调控元件控制下并由itr侧翼的转基因的表达盒；和(ii)具有aav衣壳蛋白的氨基酸序列或与aav衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性，同时保留aav衣壳的生物功能的病毒衣壳。
[0179]
在特定的实施方案中提供了包括人工基因组的aavrh10载体，该人工基因组包括(i)包含在调控元件控制下并由itr侧翼的转基因的表达盒(i)具有aavrh10衣壳蛋白的氨基酸序列或与aavrh10衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性，同时保留aavrh10衣壳的生物学功能的病毒衣壳。在某些实施方案中，编码的aavrh10衣壳具有美国专利号us9,790,427中列出的seq id no:81的序列，通过引用将其整体并入本发明，其具有1、2、3、4、5、6、7、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代，并保留aavrh10衣壳的生物学功能。
[0180]
所选择的控制元件在哺乳动物细胞中具有作用。所得到的结构包含操作连接的组件，其两侧是(5'和3')功能aav itr序列。“腺相关病毒末端反向重复序列”或“aav itrs”是指在aav基因组的每一端发现的现有公认的区域，它们以顺式方式一起作为dna复制的起点和作为病毒的包装信号发挥作用。aav itrs与aav rep编码区一起提供了有效的切除和抢救，以及将插入在两个侧翼itr之间的多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中。aav itr区的多核苷酸序列是已知的。正如本发明所用，“aav itr”不一定包含野生型多核苷酸序列，但可以被改变，例如通过核苷酸的插入、删除或替换。此外，aav itr可以来自多种aav血清型中的任何一种，包括但不限于aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aavrh.10等。此外，aav载体中所选多核苷酸序列侧翼itr的5'和3'itr不必相同或源于相同的aav血清型或分离物，只要它们按预期发挥作用即可，即允许从宿主细胞基因组或载体中切除和抢救目标序列，并允许当细胞中存在aav rep基因产物时将异源序列整合到受体细胞基因组中。此外，aav itrs可以源于多种aav血清型中的任何一种，包括但不限于aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav 5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aavrh.10。此外，aav表达载体中位于所选多核苷酸序列两侧的5'和3'itr不必相同或源于相同的aav血清型或分离物，只要它们按预期发挥作用即可，即允许从宿主细胞基因组或载体中切除和抢救目标序列，并允许当细胞中存在aav rep基因产物时将dna分子整合到受体细胞基因组中。
[0181]
具体实施方案是源于aav血清型的载体，在哺乳动物drg细胞中具有的趋向性和高转导效率。本专利申请对不同血清型的转导效率进行了回顾与分析。在某些实施例中，基于aav2、aav5、aav8、aav9和rh.10的载体指导转基因在drg中的长期表达。
[0182]
所选的多核苷酸序列可操作地连接至控制元件，该控制元件指导其在受试者体内的转录或表达。这样的控制元件可以包含通常与所选基因相关的控制序列。
[0183]
通常，本发明的载体包含表达盒。术语“表达盒”是指包含足以表达本发明的核酸
分子的核酸元件的核酸构建体。通常，核酸分子编码异源基因，并且也可以包括合适的调节元件。异源基因是指编码目标rna的转基因。
[0184]
可以使用一种或多种表达盒。每个表达盒可以包含至少一个启动子序列，该启动子序列可操作地连接到编码目标rna的序列。每个表达盒可以由额外的调节元件、间隔物、内含子、utr、多聚腺苷酸化位点等组成。在某些实施方案中，表达盒相对于转基因编码例如两个或多个mirna是多顺反子的。在其他实施方案中，表达盒包含启动子、编码一种或多种目标rna分子的核酸和多聚体(polya)。在进一步的实施方案中，表达盒包含5'-启动子序列、编码第一种目标rna的序列、编码第二种目标rna的序列和多聚腺苷酸化序列-3'。
[0185]
在某些实施方案中，表达盒可以包含额外的元件，例如，内含子、增强子、多聚腺苷酸化位点、土拨鼠转录后反应元件(a woodchuck posttranscriptional response element)(wpre)和/或已知影响编码序列表达水平的其他元件。通常，表达盒包含可与启动子序列操作性连接的本发明的核酸分子。
[0186]
术语“可操作相连”是指两个或多个核酸片段在单个核酸片段上的结合，使得一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的影响。
[0187]
例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子与编码序列可操作相连(例如，编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在有义或反义方向上与调控序列进行操作连接。
[0188]
如本文所用，术语“启动子”序列是指包含dna调控序列的多核苷酸区域，其中该调控序列来源于能够结合rna聚合酶并启动下游(3'-方向)编码序列转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中与启动子有效连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻抑型启动子”(其中与启动子有效连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。
[0189]
在一些实施方案中，启动子是异源启动子。如本文所用，术语“异源启动子”是指在自然界中未发现与给定编码序列可操作连接的启动子。
[0190]
有用的异源控制序列通常包括那些编码哺乳动物或病毒基因的序列。实例包括但不限于磷酸甘油酸激酶(pkg)启动子(the phophoglycerate kinase(pkg)promoter)、cag((cmv)巨细胞病毒增强子、鸡β肌动蛋白启动子(cba)和兔β珠蛋白内含子的复合物)、u6启动子、神经元启动子(人突触素1(hsyn)启动子、neun启动子、camkii启动子、多巴胺-1受体和多巴胺-2受体的启动子)、sv40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子；腺病毒主要晚期启动子(ad mlp)；单纯疱疹病毒(hsv)启动子、cmv启动子例如cmv立即早期启动子区(cmv-ie)、劳斯(rous)肉瘤病毒(rsv)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，源自非病毒基因的序列，例如鼠金属硫蛋白基因，也将在本发明中找到应用。此类启动子序列可从例如stratagene(san diego,ca)商购获得。
[0191]
出于本发明的目的，异源启动子和其他控制元件，例如drg特异性和诱导型启动子、增强子等，都将具有特别的用途。
[0192]“增强子”是一种可以刺激启动子活性的多核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件，也可以是插入的异源元件，以增强启动子的水平或组织特异性。在一些实施方案中，启动子整体源于天然基因。在一些实施方案中，启动子由来源于不同天然存在的启动子的不同元件组成。在一些实施方案中，启动子包含合成多核苷酸序列。本领域技术人员将理
解，不同的启动子会直接的表达在不同的组织或细胞类型的基因，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件或药物或转录辅因子存在与否。普遍存在的、细胞类型特异性的、组织特异性的、发育阶段特异性的和条件性的启动子，例如，本领域技术人员熟知的药物反应性启动子(例如四环素反应性启动子)。
[0193]
在哺乳动物系统中，存在三种启动子，它们是构建表达载体的候选启动子：pol i启动子控制大核糖体rna的转录；pol ii启动子控制mrna(被翻译成蛋白质)和小核rna(snrna)的转录；和pol iii启动子唯一转录小的非编码rna。在设计用于体内表达rna的构建体时，每种方法都有其优点和制约因素需要考虑。例如，pol iii启动子对于在体内从dna模板合成小干扰rna(shrna)很有用。为了更好地控制组织特异性表达，首选pol ii启动子，但只能用于mirna的转录。然而，当使用pol ii启动子时，可能优选省略翻译起始信号，以便rna起着反义、sirna、shrna或mirna的作用，并且不会在体内翻译成多肽。
[0194]
可以直接将所选择的序列插入到已被切除了主要的aav开放阅读框(“orf”)的aav基因组中来构建具有侧翼为aav itrs的目标dna分子的aav表达载体。aav基因组的其他部分也可以被删除，只要保留足够的itr以便允许复制和包装功能。构建体可以使用本领域已知的技术来设计。参见例如，美国专利号us5,173,414和us5,139,941；国际公开号wo92/01070(1992年1月23日公开)和wo 93/03769(1993年3月4日公开)。另外，aav itrs可以使用标准连接技术从病毒基因组或从含有相同且融合的选定核酸构建体的5'和3'的aav载体中切除，所述核酸构建体存在于另一个载体中。例如在美国专利号5,139,941中描述了含有itr的aav载体。特别地，其中描述了几种aav载体，它们可从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection("atcc"))获得，登录号为53222、53223、53224、53225和53226。另外，嵌合基因可以通过合成方法产生，以包括aav itr序列排列的5'和3'的一个或多个选择的核酸序列。可以使用用于在哺乳动物drg细胞中表达嵌合基因序列的优选密码子，并且在某些实施方案中，转基因的密码子优化通过本领域众所周知的方法进行。完整的嵌合序列是由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装而成。为了产生aav病毒体，使用已知技术将aav表达载体引入合适的宿主细胞，例如通过转染。许多转染技术在本领域中一般是已知的。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀法、直接显微注射入培养细胞法、电穿孔法、脂质体介导的基因转移法、脂质介导的转导法和高速微粒的核酸递送法。
[0195]
例如，除了本发明的核酸序列之外，特定的病毒载体还包含具有源自aav-2的itr的aav载体质粒的主干、启动子，例如小鼠pgk(磷酸甘油酸激酶)基因或巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂合启动子(cag)由来自cmv即刻基因的增强子、启动子、来自鸡β-肌动蛋白基因的剪接供体和内含子、来自兔β-珠蛋白的剪接受体、或任何神经元启动子例如多巴胺-1受体或多巴胺-2受体的启动子、或突触蛋白启动子，有无野生型或突变型的土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件(wpre)，以及兔β-珠蛋白polya序列。病毒载体可以另外包含编码抗生素抗性基因的核酸序列，例如氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素(kanamycin)、潮霉素(hygromycin)b、遗传霉素(geneticin)、杀稻瘟菌素s(blasticidin s)或嘌呤霉素(puromycin)基因。
[0196]
在一个实施方案中，使用了逆转录病毒载体。
[0197]
逆转录病毒由于能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外来遗传物质，感染种类和细胞类型广泛，并且可以包装在特殊的细胞系中，因此可以选择作为基因递送载
体。为了构建逆转录病毒载体，将编码目标基因的核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了包含gag、pol和/或env基因但不包含ltr和/或包装组分的包装细胞系。当含有cdna的重组质粒与逆转录病毒ltr和包装序列一起被引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的rna转录物被包装到病毒颗粒中，然后分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，选择性浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。
[0198]
在另一个实施方案中，使用了慢病毒载体。
[0199]
在具体的实施方案中，本发明涉及包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的寡核苷酸序列的慢病毒载体。
[0200]
在另一个实施方案中，本发明的慢病毒载体包含编码fxyd2的部分或片段的寡核苷酸序列的任何变体。
[0201]
在另一个实施方案中，本发明的慢病毒载体包含编码fxy2d的任何变体的寡核苷酸序列的任何变体。
[0202]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的反义序列的慢病毒载体。
[0203]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的shrna序列的慢病毒载体。
[0204]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的mirna序列的慢病毒载体。
[0205]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含反义寡核苷酸的慢病毒载体，该反义寡核苷酸靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:或其变体的核苷酸组成的区域。
[0206]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体包含一个编码fxyd2的部分或片段或其变体的序列，该序列选自但不限于seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41。
[0207]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体包含一个编码fxyd2的部分或片段的序列的任何变体，该序列选自但不限于seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41。
[0208]
在另一个实施方案中，本发明的慢病毒载体包含一个序列的任何变体，该序列选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、
seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26。
[0209]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的寡核苷酸序列的慢病毒载体。
[0210]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码fxyd2的部分或片段或其变体的shrna序列和u6启动子的慢病毒载体。
[0211]
在另一个实施方案中，本发明涉及包含反义寡核苷酸的慢病毒载体，该反义寡核苷酸靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸组成的区域以及u6启动子。
[0212]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体，其包含的序列选自但不限于seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41和u6启动子。
[0213]
在另一个实施方案中，本发明的慢病毒载体包含一个序列的任何变体，该序列选自但不限于seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和u6启动子。
[0214]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体，该慢病毒载体包括编码fxyd2的部分或片段或其变体的寡核苷酸序列和cag启动子。
[0215]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体，该慢病毒载体包括编码fxyd2的部分或片段或其变体的反义序列和cag启动子。
[0216]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体，该慢病毒载体包括编码fxyd2的部分或片段或其变体的mirna序列和cag启动子。
[0217]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体，该慢病毒载体包括编码fxyd2的部分或片段或其变体的shrna序列和cag启动子。
[0218]
在具体的实施方案中，本发明涉及包含反义寡核苷酸的慢病毒载体，该反义寡核苷酸靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸组成的区域和cag启动子。
[0219]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种慢病毒载体，其包含序列seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41和cag启动子。
[0220]
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，如在潜伏感染过程中。一些慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒(hiv 1、hiv 2)和猿类免疫缺陷病
毒(siv)。慢病毒载体是通过多重减弱hiv毒力基因产生的，例如删除基因env、vif、vpr、vpu和nef，从而使载体在生物学上是安全的。慢病毒载体为本技术领域所已知，参见例如，美国专利号us6,013,516和us5,994,136，这两个专利均通过引用并入本发明中。通常，载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外源核酸、用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中的关键序列。目标载体的gag基因、pol基因和env基因为本领域所已知。因此，相关基因被克隆到选定的载体中，然后用于转化感兴趣的目标细胞。能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两种或多种携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat，描述于美国专利号us5,994,136，其通过引用并入本发明中。本发明描述了可提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体和可提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞的另一载体。将提供异源基因的载体引入该包装细胞得到生产细胞，该生产细胞释放携带目标外源基因的感染性病毒颗粒。env优选是允许人和其他物种的细胞转导的两性包膜蛋白。通常，本发明的核酸分子或载体包括“控制序列”，其统称为启动子序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点(“ires”)、增强子等，它们共同为编码序列在受体细胞中的复制、转录和翻译提供条件。并不需要所有的这些调控序列总是存在，只要选定的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译。
[0221]
治疗疼痛的方法
[0222]
在第三方面，本发明涉及上述的抑制剂和/或反义寡核苷酸在治疗有需要的受试者的疼痛中的用途。
[0223]
在具体的实施方案中，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者的疼痛的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上述的抑制剂和/或反义寡核苷酸的步骤。
[0224]
在具体的实施方案中，根据本发明的方法，所述反义寡核苷酸至少靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸组成的区域。
[0225]
在具体的实施方案中，根据本发明的方法，所述抑制剂靶向包含或由seq id no:3的核苷酸组成的区域。
[0226]
在具体的实施方案中，根据本发明的方法，其中所述反义寡核苷酸包含或由序列seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41组成。
[0227]
在具体的实施方案中，根据本发明的方法，所述反义寡核苷酸包含或由序列seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26组成。
[0228]
在具体的实施方案中，根据本发明的方法，所述反义寡核苷酸单独(裸)或在上述的载体中施用。
[0229]
如本文所用，术语“治疗”或“提供治疗”指的是预防性或防范性治疗，也指治愈性
或疾病改善治疗，包括对有感染疾病风险或疑似感染疾病的患者进行治疗，以及对患病或被诊断患有疾病或身体状况出现问题的患者进行治疗，并且包括防止临床复发。可对患有疾病或最终可能患病的对象进行治疗，以预防、治愈、延迟疾病的发作，降低疾病的严重程度，或改善疾病或复发疾病的的一种或多种症状，或者为了延长受试者的生存期，使其超过没有这种治疗的预期。所谓“治疗方案”指的是针对某个疾病的治疗，例如治疗期间使用的剂量模式。一个治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指对疾病进行初期治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案初期向患者提供高水平的药物。诱导方案可(部分或全部)采用“负荷治疗”，其中可包括比医生在维持方案期间所使用的药物剂量更大，比医生在维持治疗方案中使用的药物更频繁，或两者兼有。短语“维持疗法”或“维持期”指的是在疾病治疗期间维持患者疗效的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长期处于缓解病情状态阶段(数月或数年)。维持方案可采用连续治疗(例如：规律地服用药物，如每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如：中断治疗、间歇治疗、复发时治疗或在满足特定的预定标准[如：疾病症状等]时进行治疗)。
[0230]
如本文所用，术语“疼痛”是指一种不愉快的感觉，通常由强烈或破坏性刺激引起。国际疼痛研究协会(international association for the study of pain)对“疼痛”广泛使用的定义为：“疼痛是一种不愉快的感觉和情绪体验，与实际或潜在组织损伤相关，或以这种损伤的形式描述”。有不同类型的疼痛：急性疼痛、慢性疼痛、躯体疼痛、伤害性疼痛、内脏疼痛或外周疼痛。在本发明的上下文中，疼痛是外周疼痛。更具体地，外周疼痛是神经性疼痛、糖尿病性疼痛、化疗疼痛、炎性疼痛、术后疼痛和/或慢性术后疼痛。
[0231]
如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。特别地，本发明的受试者是人、小鼠或大鼠。如本文所用，术语“受试者”包括“患者”。
[0232]
在具体的实施方案中，受试者感受到或易感受到疼痛。
[0233]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患外周疼痛。
[0234]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患神经性疼痛。
[0235]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患炎性疼痛。
[0236]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患糖尿病性疼痛。
[0237]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患化疗疼痛。
[0238]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患外科术后疼痛。
[0239]
在具体的实施方案中，受试者患有或易患慢性术后疼痛。
[0240]
如本文所用，术语“给药(administering)”或“给药(administration)”是指将存在于体外的物质(例如，fxyd2的抑制剂，例如本发明的aso)注射或以其他物理方式递送到受试者中的行为，例如通过静脉、肌肉、肠内、皮下、胃肠外、全身、局部、脊髓、鼻、局部或表皮进行给药(例如，通过注射或输液)。当正在治疗疾病或其病症时，物质的给药通常发生在疾病或其症状发作之后。当疾病或其病症被预防时，物质的给药通常发生在疾病或其病症发作之前。在具体的实施方案中，通过贴片、糊剂(paste)、软膏、悬浮液、溶液或乳膏(cream)、凝胶或喷雾进行给药。在具体的实施方案中，给药是通过乳膏进行的。
[0241]
在具体的实施方案中，抑制剂和/或反义寡核苷酸的给药是通过鞘内、皮下、局部或静脉施用。
[0242]
在进一步的实施方案中，i)根据本发明的反义寡核苷酸和ii)作为组合制剂在疼痛治疗中同时、单独或顺序用药的传统治疗。
[0243]
如本文所用，术语“传统治疗”是指任何化合物，天然的或合成的。在具体的实施方案中，传统治疗选自但不限于：阿司匹林、扑热息痛、非甾体抗炎药(nsaids)；可待因、冷冻疗法、虚拟疗法、大麻、吗啡及其衍生物、鸦片及其衍生物。
[0244]“有效治疗量”指的是为受试者提供有效治疗所需最小剂量的活性剂(例如：本发明中的aso)。举例来讲，为受试者提供得到“有效治疗量”是这样一种量，它能诱导、改善或以其他方式缓解病理症状、疾病进展或和疾病相关的生理状态，或对屈服于某种疾病的抵抗。应理解的是，本发明化合物的每日使用总剂量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。针对特定受试者的具体有效治疗量取决于多种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度，所用特定化合物的活性，所用药物的具体成分，受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食习惯，所用特定化合物的给药时间、给药途径和排泄速度，治疗的持续时间，与所使用特定化合物一起服用或同时服用的药物，以及医学领域中众所周知的其它可能因素。举例来讲，一开始所使用的化合物剂量通常低于达到所需治疗效果所需剂量，然后逐渐增加剂量直至达到所需效果，这完全在本领域的技术范围内。但是，成人服用产品的每日剂量在0.01mg到1,000mg的宽广范围内变化。通常，可能含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，可根据治疗受试者的症状调整剂量。药物通常含有约0.01mg到500mg的活性成分，优选含1mg至100mg活性成分的药物。有效量的药物的通常以每日0.0002mg/kg至约20mg/kg体重的剂量供应，特别是以每日约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量。
[0245]
药物组合物
[0246]
第四方面，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含本发明中的抑制剂和/或反义寡核苷酸。
[0247]
在具体的实施方案中，根据本发明的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸至少靶向包含或由seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6的核苷酸组成的区域。
[0248]
在具体的实施方案中，根据本发明的药物组合物的，其中所述抑制剂靶向包含或由seq id no:3的核苷酸组成的区域。
[0249]
在具体的实施方案中，本发明涉及根据本发明的药物组合物，包含至少一种反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸包含和/或由seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40或seq id no:41组成的组的序列组成。
[0250]
在具体的实施方案中，根据本发明的药物组合物，其中反义寡核苷酸包含或由seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26组成的组的序列组成。
[0251]
在具体的实施方案中，本发明涉及的根据药物组合物用于治疗疼痛。
[0252]
在具体的实施方案中，本发明涉及使用的药物组合物，其中疼痛是外周疼痛。
[0253]
在具体的实施方案中，本发明涉及根据本发明使用的药物组合物，其中疼痛是神经性疼痛、糖尿病性疼痛、化疗疼痛、炎性疼痛、术后疼痛和/或慢性术后疼痛。
[0254]
如上所述的抑制剂和/或反义寡核苷酸可以与药学上可接受的赋形剂，以及任选的缓释基质，例如生物可降解聚合物相结合，以形成药物组合物。“药学上的”或“药学上可接受的”是指在适当情况下给哺乳动物，尤其是人给药时，不会产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配方助剂。本发明的药物组合物作为传统药物支持的混合物，向例如动物和人类的受试者通过口服、舌下、皮下、肌内、静脉、透皮、局部或直肠给药，其活性成分单独或与另一活性成分组合可以以单位给药形式给药。适合的单位给药形式包括口服途径形式，如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒和口服悬浮液或溶液、舌下和颊下给药形式、气雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹腔、肌内、静脉、皮下、透皮，鞘内和鼻内给药形式和直肠给药形式。
[0255]
在具体的实施方案中，根据本发明的药物组合物通过鞘内、皮下、局部或静脉注射进行给药。
[0256]
通常，药物组合物含有载体是药学上可接受的，能够用于注射的制剂。这些载体可以是特定的等渗、无菌生理盐水(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，也可能是干燥的，尤其是冷冻干燥的成分。根据具体情况，在将这些成分加入无菌水或生理盐水时，就配制了可注射溶液。适用于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液，包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。不管是哪种形式，该制剂必须是无菌的，并且必须是流体，以达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须保持稳定，并且必须能防止微生物，如细菌和真菌的污染作用。包含本发明化合物的自由基或药学上可接受的盐的溶液可以在水中制备，适量与表面活性剂，如如羟丙基纤维素混合。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。多肽(或其核酸编码)可以中性或盐的形式配制成组合物。药物可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基结合而成)，举例来讲，同盐酸或磷酸等无机酸结合，或者同乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸结合。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，也可能衍生自有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物和植物油。适当的流动性，可以例如通过使用包衣例如卵磷脂等包衣，在分散的情况下通过保持所需的颗粒大小和使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好还使用等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，来延长可注射组合物的吸收。无菌注射液的制备方法是在适当的溶剂中，加入所需量的活性多肽，并根据需要加入上面列举的几种其它成分，然后进行过滤灭菌。通常，分散剂的制备方法是将各种已灭菌的活性成分加入无菌载体中，该载体含有基本分散介质和上述列举的所需其它成分。就制备无菌注射溶液所需无
菌粉末而言，优选制备方法包括真空干燥和冷冻干燥方法，该技术从之前无菌过滤的溶液中获得包含活性成分和其它所需成分的粉末。在配制完成后，溶液将以符合剂量配制要求和能获得疗效的方式进行施用。该制剂很容易以多种形式给药，例如上述的注射液类型，但也可以使用药物缓释胶囊等。举例来讲，对于在水溶液中的肠胃外给药，若需要，应该适当缓冲溶液，并且先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。这方面，根据本发明，本领域技术人员将了解可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗nacl溶液中，然后添加到1000ml皮下注射液中，或在建议的注入部位注射。根据被治疗对象的具体状况，剂量必然会有一些变动。在任何情况下，负责给药的人员将确定适合具体对象的剂量。
[0257]
在具体的实施方案中，本发明提供了一种包含反义寡核苷酸的局部制剂。例如，只是作为示例而不是作为限制，本发明提供了一种包含反义寡核苷酸的局部制剂。用于本发明抑制剂的局部或透皮给药的剂型包括但不限于粉剂、喷雾剂、软膏、膏体、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片和吸入剂。在某些非限制性实施方案中，局部制剂包含由胶束、脂质体或非基于脂质微球组成的反义寡核苷酸。在某些非限制性实施方案中，此类局部制剂可包含渗透增强剂，例如但不限于二甲基亚砜、烃类(例如烷烃和烯烃)、醇类(例如乙二醇和甘油)、酸(例如脂肪酸)、胺、酰胺、酯(例如肉豆蔻酸异丙酯)、表面活性剂(例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂)、萜烯和脂质(例如磷脂)。
[0258]
在具体的实施方案中，该制剂是贴片、糊剂、软膏、悬浮液、溶液或乳膏、凝胶或喷雾。在具体的实施方案中，该制剂是乳膏。
[0259]
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
[0260]
图1：针对人fxyd2 mrna的反义寡核苷酸的鉴定。通过一系列针对人fxyd2 mrna的反义寡核苷酸(a)和长度分别为15、17和20个核苷酸的aso75和aso82(b)转染hek293细胞的提取物后，通过蛋白质印迹法(western blot)定量fxyd2蛋白水平。fxyd2蛋白的水平用肌动蛋白标准化。数据表示为平均值
±
s.e.m。*＝p《0.05；**＝p《0.01；***＝p《0.001和****＝p《0.0001，(n＝3次平行测定)。
[0261]
图2.通过鞘内注射脂质修饰的fxyd2反义寡核苷酸fxyd2-laso在体内抑制大鼠drg神经元中的fxyd2表达。在14天(n＝3)内每天鞘内注射增加的fxyd2-laso的用量，解剖腰椎drg(l4-l6)组织并量化fxyd2蛋白水平。fxyd2蛋白的水平用肌动蛋白标准化。数据表示为平均值
±
s.e.m。*＝p《0.05；ns，不显著。
[0262]
图3.每日鞘内注射脂质修饰的fxyd2反义寡核苷酸在减轻snl神经性疼痛模型中的疼痛敏感性方面至少与鞘内注射ω-芋螺毒素肽mviia一样有效。一组大鼠接受snl手术并测试对机械刺激的反应(a:von frey测试；b:randall-selitto爪压测试)。每天鞘内注射2μg fxyd2-laso(n＝9)，不注射对照-laso(n＝9)，在2项测试中导致机械超敏反应逐渐完全缓解，但中断治疗后逆转。恢复fxyd2-laso治疗恢复了镇痛效果。对显示神经性疼痛症状的大鼠群组进行单次鞘内注射ω-芋螺毒素肽mviia(conotoxin mviia)(n＝9)可减轻1-2小时机械超敏反应。数据表示为平均值
±
s.e.m。*＝p《0.05；***＝p《0.001和****＝p《
0.0001。
[0263]
图4.fxyd2-laso治疗可减轻炎性疼痛模型中的机械超敏反应。通过足底内注射cfa(完全弗氏佐剂)诱导机械超敏反应。每日注射fxyd2-laso(n＝6)，不注射对照-laso(n＝6)，减轻了疼痛症状(a:von frey测试；b:randall-selitto爪压测试)。fxyd2-laso的镇痛作用依赖于持续治疗，注射中断会恢复疼痛超敏反应。数据表示为平均值
±
s.e.m。*＝p《0.05；**＝p《0.01和****＝p《0.0001。
[0264]
图5.fxyd2-laso的脂质修饰对其在神经性疼痛snl模型中的镇痛作用至关重要。在通过snl诱导机械超敏反应后，每天向大鼠鞘内注射fxyd2-laso(n＝6)或fxyd2-aso(非脂质修饰形式)(n＝6)。fxyd2-laso，但不是fxyd2-aso，有效地逆转了机械敏感性测试所证明的疼痛行为(a:von frey测试；b:randall-selitto爪压测试)。数据表示为平均值
±
s.e.m。*＝p《0.05；**＝p《0.01；***＝p《0.001和****＝p《0.0001。
[0265]
图6.鞘内注射accell fxyd2-sirna抑制fxyd2可降低snl模型中的机械超敏反应。在通过snl诱导机械超敏反应后，每天向动物鞘内注射accell fxyd2-sirna(n＝9)或accell control-sirna(n＝9)。在von frey试验(a)和randall-selitto爪压试验(b)中，accell fxyd2-sirna而非accell对照-sirna降低了机械超敏反应。数据表示为平均值
±
s.e.m。**＝p《0.01；***＝p《0.001和****＝p《0.0001。
具体实施方式
[0266]
材料与方法
[0267]
动物
[0268]
所有实验均经法国研究部批准(授权号：c34-172-36)，并根据国际疼痛研究协会(iasp)的指导方针进行。所有动物都以12/12暗/光循环圈养，自由取食和进水。使用在实验开始时体重为200至250克的五只周龄雄性sprague-dawley大鼠(janvier，法国)。
[0269]
慢性疼痛模型
[0270]
采用外周神经性疼痛的snl(脊髓神经结扎)模型和慢性炎性疼痛的cfa(完全弗氏佐剂)模型。所有外科手术均在深度异氟醚麻醉下进行。snl程序按照前面描述的进行2。简而言之，移除l6横突以暴露l4和l5脊神经。然后分离l5脊神经并用6.0丝线紧密结扎。完全弗氏佐剂(cfa)诱导的疼痛模型3已用于评估慢性炎性疼痛。简而言之，在异氟醚麻醉下，对动物的左后爪进行足底注射(50μl)每毫升1mg结核分枝杆菌(sigma-aldrich)的溶液。
[0271]
对大鼠鞘内注射aso、laso、sirna或ω-芋螺毒素肽mviia
[0272]
aso和laso由法国波尔多的chembiopharm制造。chembiopharm提供非靶向aso和laso(正义序列：5’cgtgtaggtacggcagatc 3'＝seq id no:32)并用作阴性对照。我们设计了29种不同的fxyd2-aso，序列见表1。针对大鼠-人fxyd2 mrna的“accell”sirna购自dharmacon。正义序列如下：5'aagauuccgcugugggggc(uu)3'由seq id no:31定义。“accell非体内靶向”sirna(dharmacon,d-001910-01)用作阴性对照。ω-芋螺毒素肽mviia购自sigma aldrich(参考文献c1182)，如de souza等人1所述，鞘内注射100皮摩尔剂量。
[0273]
对snl手术大鼠进行了测试以确认机械超敏反应，然后在短暂的异氟醚麻醉下，每天鞘内注射2μg对照或fxyd2-sirna或aso或laso，在20μl5％葡萄糖溶液中进入蛛网膜下腔4。对于注射cfa的大鼠，从注射cfa后第3天开始，每天鞘内注射20μl 5％葡萄糖水溶液中
的4μg对照或fxyd2-laso。
[0274]
大鼠行为测试
[0275]
sprague-dawley雄性大鼠在标准光照和温度条件下每笼饲养三只。商业饲料颗粒和自来水可随意获得。到达后，让动物适应殖民地的房间(the colony room)4天。为了避免实验条件造成的应力，由同一实验者在靠近菌落室的测试室于安静条件下进行分析。实验前2周，每天对动物称重，轻轻处理5分钟，然后在测试室放置1小时，让它们习惯痛感装置。分别于术前、手术当日(d0)及术后每日1次评估机械异常性疼痛和机械性痛觉过敏。对于机械异常性疼痛，我们在每种实验条件下对6只动物进行了如上所述的von frey测试。对于机械性痛觉过敏，如前所述，爪压发声测试来确定手持大鼠的伤害感受阈值5。简而言之，对受伤的后爪施加不断增加的压力，直到大鼠发出吱吱声。使用basile镇痛计(apelex；接触式探针，1mm)。为防止组织损伤，测定了600克的截止值。
[0276]
用aso进行的体外fxyd2蛋白敲低实验
[0277]
使用对照-aso、29个不同的fxyd2-aso，每个长度为20个核苷酸，以及aso#75和aso#82，长度分别为15个和17个核苷酸(序列显示在表1中)(chembiopharm，波尔多，法国)，并在hek293m细胞中进行体外测试。hek293m细胞维持在dmem glutamax(invitrogen)中，补充有抗生素(青霉素50u/ml、链霉素50μg/ml)和10％热灭活胎牛血清。细胞以50％的密度铺板，并在1天后用指定的aso处理2天。lipofectamine 2000是一种阳离子脂质(invitrogen)，用于增加aso对细胞的吸收。用在无血清opti-mem(life technologies)中以1/1000稀释的lipofectamine 2000预孵育20分钟后，用100nm aso处理细胞。4小时后，用上述标准培养基更换培养基。
[0278]
用laso进行的体内fxyd2蛋白敲低实验
[0279]
在14天内，每天鞘内注射20μl 5％葡萄糖溶液中的0、0.5、2、4或8μgfxyd2-laso。对于每种浓度的fxyd2-laso，注射3只大鼠。大鼠腹腔注射戊巴比妥，并经心脏灌注pbs。腰椎drgs(l4-l6)被解剖并储存在-80℃。
[0280]
蛋白质印迹(western blot)
[0281]
细胞或组织在4℃下在np40缓冲液(1％np40、150mm nacl；50mm tris-hcl，ph7.5和蛋白酶抑制剂)中机械匀浆。裂解物在4℃下以12,000
×
g澄清10分钟。在使用bca试剂盒(thermofisher，法国)进行蛋白质定量后，裂解物在sds-page上运行并转移到硝酸纤维素膜上。使用兔抗c末端fxyd2和小鼠抗肌动蛋白抗体。在与一抗和荧光irdye二抗(li-cor biosciences)孵育后，使用odyssey clx imager(li-cor biosciences)进行免疫检测。使用image studio lite软件(li-cor biosciences)进行量化。
[0282]
统计分析
[0283]
对于蛋白质印迹(western blot)实验，采用单因素方差分析(anova)进行统计分析，然后进行事后dunnett检验。对于行为研究，组效应和时间效应通过重复测量的双向方差分析进行验证。当方差分析显示显著效应时，使用bonferroni事后检验来确定差异的显著性。p值《0.05(*)、p《0.01(**)、p《0.001(***)和p《0.0001(****)被认为具有统计学意义。呈现的所有数据均为平均值
±
s.e.m。
[0284]
结果
[0285]
我们使用rnafold程序(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/rnafold.cgi)
生成了人fxyd2 mrna的二级结构(ncbi参考序列nm_001680)，用于识别具有潜在功能敲低特性的寡核苷酸序列(数据未显示)。通过将单个aso转染到人hek293细胞中并通过蛋白质印迹(western blot)定量fxyd2蛋白水平，测试了一系列覆盖人fxyd2 mrna碱基112-267的重叠寡核苷酸序列(表1)。发现包括碱基210-238(由aso#75至#84靶向)的区域特别有利于反义抑制(图1a)。
[0286]
测试了长度为15、17和20个核苷酸的aso#75和aso#82的(seq id no:17、24、38-41)。长度为20个核苷酸的asos的抑制效率最高(图1b)。
[0287]
选择aso#75(seq id no:17；与碱基210-229互补)进行进一步深入研究，因为该序列在大鼠和人mrna之间是100％守恒的，因此可以在大鼠模型系统中测试其功效。然后在体内测试aso#75鞘内注射后大鼠drg中fxyd2蛋白的敲除(图2)。为了避免已知的转染剂毒性作用并提高aso吸收到神经元中的效率，我们使用了一种脂质修饰形式的aso#75，以下称为fxyd2-laso。这种脂质修饰在wo2014/195430和pokholenko等人，2013中有所描述。
[0288]
我们首先进行了剂量反应分析，以找到可以有效降低drg神经元中fxyd2蛋白水平的最低剂量的fxyd2-laso。fxyd2-laso(0、0.5、2、4和8μg)或对照-laso在20μl 5％葡萄糖溶液中每天鞘内注射，持续14天。解剖腰椎drg(l4、l5、l6)并通过蛋白质印迹(western blot)分析组织。图2显示，注射2μg的fxyd2-laso可达到最大的敲除效果，而注射更多剂量的laso后，敲除效果没有进一步降低。对照-laso对fxyd2蛋白水平没有影响。
[0289]
然后，我们在snl神经性疼痛模型中测试了鞘内注射fxyd2-laso对大鼠疼痛行为的体内影响(图3)。手术后四天，大鼠表现出对机械刺激的超敏反应，这可以通过降低对von frey细丝的退缩阈值和增加对同侧爪子上爪压的反应(randall-siletto测试)来证明。从术后第14天开始每天注射fxyd2-laso导致疼痛行为逐渐逆转，并且到术后第21天反应恢复到基线水平。只要持续注射fxyd2-laso(6天)，疼痛行为的完全减弱就得以维持。fxyd2-laso注射的中断导致2天内对机械刺激的超敏反应恢复。在神经症大鼠中平行注射2μg对照laso对疼痛行为没有减轻作用。
[0290]
然后，我们将fxyd2-laso的镇痛效果与鞘内给药的黄金标准ω-芋螺毒素肽mviia进行了比较，后者的合成形式以prialt
tm
的名称商业化用于人。ω-芋螺毒素肽mviia是一种钙通道抑制剂，用于某些顽固性疼痛的病例。在已经成功用fxyd2-laso治疗过的大鼠群组中，如果停止注射后机械过敏现象又出现，我们就开始了一系列新的注射。同样，fxyd2-laso完全消除了疼痛行为。与此同时，一组接受过手术并出现神经性疼痛的大鼠接受了ω-芋螺毒素肽mviia(100皮摩尔/鞘内注射1)治疗。ω-芋螺毒素肽mviia部分减轻了疼痛行为(图3)，尽管正如预期的那样，效果持续时间很短(1-2小时)。该实验表明，鞘内注射fxyd2-laso在啮齿动物神经性疼痛模型中是一种有效的镇痛剂，作用持续时间更长(几天而不是几小时)，并且至少与当前的金标准prialt
tm
一样有效。
[0291]
我们接下来测试了fxyd2-laso对fxyd2的抑制在其他疼痛模型中是否有效，其中已知的潜在机制与神经损伤引起的疼痛有关的机制不同。因此，我们采用了一种常用的炎性疼痛模型，即足底内注射完全弗氏佐剂(cfa)，这会导致长时间的机械超敏反应(图4)。再次，我们使用von frey细丝和randall-selitto测试来测试机械灵敏度。注射cfa在2天内引起了快速的机械超敏反应，该反应在用对照laso治疗的对照动物的时程实验中保持不变。每天一次鞘内注射4μg fxyd2-laso再次减轻疼痛行为，尽管与神经损伤引起的神经性疼痛
相比时间更长。与损伤诱导的神经性疼痛模型中的7天相比，治疗15天后达到最大镇痛效果。其次，尽管在von frey细丝试验完全减轻了疼痛行为，但结果显示在randall-selitto试验中部分有效(图4)。与神经损伤模型的情况一样，停止注射fxyd2-laso后导致疼痛行为迅速恢复，随后恢复注射fxyd2-laso后恢复了镇痛效果。
[0292]
我们接下来通过在同一实验中直接比较鞘内注射未修饰的fxyd2-aso反义寡核苷酸和fxyd2-laso的反应，探讨了fxyd2-laso的脂质修饰在其镇痛功效中的重要性(图5)。在snl手术和诱导神经性疼痛行为后，通过每天鞘内注射2μg fxyd2-aso或fxyd2-laso对一组大鼠进行治疗。机械敏感性测试表明，fxyd2-aso对减轻疼痛行为无效，脂质修饰对于寡核苷酸的疼痛抑制作用是必要的。
[0293]
最后，我们测试了使用针对fxyd2 mrna的sirna作为抑制其功能的替代方法的有效性(图6)。购买了使用accelltm技术(dharmacon)合成并针对与aso#75中相同的100％守恒的大鼠-人序列的定制sirna。accelltm技术无需添加转染剂即可促进细胞穿透。我们每次注射使用2μgfxyd2-sirna。“非靶向”sirna用作对照。虽然不如fxyd2-laso有效，但每天的fxyd2-sirna，并不是对照sirna，减少了snl神经性疼痛模型中的机械超敏反应。
[0294]
结论:
[0295]
总体而言，这些结果确定了几种可以在体外抑制人fxyd2表达的反义寡核苷酸。鞘内注射脂质修饰形式的100％守恒的大鼠-人aso(laso#75)可以显著减轻两种神经性疼痛啮齿动物模型中的疼痛行为；周围神经损伤诱发的神经性疼痛和cfa诱发的炎性疼痛。
[0296]
因此，发明人已经证明根据本发明的反义寡核苷酸能够抑制fxyd2从而治疗疼痛。
[0297]
参考文献:
[0298]
在整个本技术中，各种参考文献描述了本发明所涉及的现有技术。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开。
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