一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法与流程

技术特征：
1.一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，包括如下步骤：对透明质酸进行荧光标记，合成带有荧光标记的透明质酸；测定所述荧光标记的透明质酸的标记度；用所述荧光标记的透明质酸孵育细胞，孵育一定时间后，通过超分辨显微镜观察透明质酸是否进入细胞的内部并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。2.根据权利要求1所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，采用荧光素对透明质酸进行荧光标记，可选地，所述荧光素为6-氨基荧光素或5-氨基荧光素。3.根据权利要求2所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，荧光标记的反应原理如下式：或者，荧光标记的反应原理如下式：4.根据权利要求2所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，合成带有荧光标记的透明质酸的步骤包括：取透明质酸钠，加入甲酰胺溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，充分混匀后静置，活化透明质酸钠中的羧基；然后加入荧光素、避光搅拌，进行充分反应；在避光条件下，向充分反应后得到的反应液中加入乙醇，离心分离并收集沉淀物，继续重复用乙醇洗涤沉淀物、离心分离若干次，干燥所得的沉淀物即得；可选地，用薄层色谱法鉴别合成的荧光标记的透明质酸，优选地，薄层色谱法中使用的
展开剂为正丙醇与水的混合物，正丙醇：水的体积比＝3：1。5.根据权利要求2或3所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，所述透明质酸的重均分子量为2-2000kda，优选30-200kda，所述透明质酸为单一分子量的样本或多分子量混合后的样本；可选地，所述荧光素的物质的量浓度为反应体系中透明质酸所含二糖重复单元总数的0.4-1.0倍，优选0.5倍。6.根据权利要求4所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的物质的量浓度为反应体系中透明质酸所含二糖重复单元总数的2.0-10.0倍，优选5.0倍。7.根据权利要求2所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，测定所述荧光标记的透明质酸的标记度的步骤包括：将荧光素溶解于pbs缓冲液中，得到设定浓度梯度的fa溶液；将荧光标记的透明质酸溶解于pbs缓冲液中，得到ha-fa溶液；分别测定设定浓度梯度的fa溶液及ha-fa溶液的吸光度；针对设定浓度梯度的fa溶液的吸光度数据，以浓度为自变量，吸光度为因变量，以最小二乘法对数据进行线性拟合，得到形如a＝ac
fa
b的标准曲线，其中，a为吸光度，c
fa
为fa浓度，a、b为常数；而后由标准曲线a＝ac
fa
b按如下公式计算ha-fa溶液中fa的含量：c
fa
＝(a-b)/a通过上述公式计算得到的ha-fa溶液中所含的fa含量等价于fa标准品溶液的浓度，记为c
fa
，根据以下公式计算标记度：其中，mr
ha
为所用透明质酸样品的重均分子量，c
ha-fa
为ha-fa溶液的浓度，mr
fa
为fa的相对分子质量，该步骤计算得到标记度用于表征ha-fa样本中所含fa的数目，以保证每次细胞孵育实验时所使用的ha-fa中所含的fa的量相等，由此可通过比对荧光强度的强弱判断ha进入细胞能力的高低。8.根据权利要求7所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，通过超分辨显微镜观察细胞并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱的步骤包括：(1)配制含ha-fa的培养基：称取一定质量的ha-fa，通过如下公式将ha-fa的量转换为其中所含fa的量：其中，m
fa
为fa的物质的量，w
ha-fa
为ha-fa的质量，mr
ha-fa
为ha-fa的相对分子质量，在标记度不高的情况下可用ha重均分子量代替；后以细胞培养基溶解，使其中所含的ha-fa经转换后等价于fa的浓度，使每次孵育细胞所用的ha-fa溶液中所含fa的量相等；(2)细胞接种及染色：细胞正常培养至对数生长阶段，然后按正常传代步骤接种至超分辨显微镜专用培养皿内，正常培养至细胞生长至培养皿面积(60
±
2)％的密度，后更换含
ha-fa的培养基，孵育2-12h，后用pbs缓冲液清洗，洗去ha-fa，后更换无酚红培养基，后用蓝色、红色或红外的探针至少对细胞中细胞膜、细胞核或线粒体的结构进行染色，以对细胞进行定位；(3)超分辨显微镜观察与结果分析：将细胞置于超分辨显微镜下，以绿色通道及所用细胞器探针的通道对细胞进行观察并拍照；用图片处理软件计算视野内每个细胞内的荧光强度并对面积求平均值，对比各组细胞荧光强度高低，荧光强度值的高低表明透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。9.根据权利要求8所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，所述超分辨显微镜采用结构光照明显微镜。10.根据权利要求8所述的分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，其特征在于，采用所述超分辨显微镜观察时，观察ha-fa所用的通道为greenhs488通道，曝光时间为10-300ms，优选200ms，曝光度为0.1％-100％，优选30％。

技术总结
本发明提供了一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，该方法包括：对透明质酸进行荧光标记，合成带有荧光标记的透明质酸；测定所述荧光标记的透明质酸的标记度；用所述荧光标记的透明质酸孵育细胞，孵育一定时间后，通过超分辨显微镜观察透明质酸是否进入细胞的内部，并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。本发明实现了对透明质酸透细胞膜吸收能力的可视化及定量分析，更加直观、准确。准确。准确。


技术研发人员：凌沛学 曾庆恺 邵华荣 陈启鑫 孙婷 亓金亮
受保护的技术使用者：山东美貌制药有限公司 山东贯天下生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.12
技术公布日：2022/7/29