一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，ha)是天然存在的一种由d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的二糖单位交替连接而成的糖胺多糖，是细胞外基质的主要成分之一。ha在自然界中普遍存在，其在不同的生物中、同一种生物不同的组织中均有分布，且在生物体内发挥着重要而又丰富的作用，比如ha可以调节细胞的增殖、粘附、迁移，调节机体的炎症反应、增强免疫应答等作用。细胞表面有很多对透明质酸起到识别作用的受体，如tlr2/4，cd44以及rhamm等，其中cd44被认为是细胞表面与透明质酸识别相关的受体，有研究表明透明质酸在细胞表面被cd44受体识别并结合后被细胞通过胞吞作用吸收入细胞内。而在细胞内，除了有通过胞吞作用被吞噬入细胞内的透明质酸外，还存在大量的内源性透明质酸，且透明质酸分子本身不带荧光，不同分子量的透明质酸混合后难以区分，所以在研究细胞对透明质酸的摄取时，如何将进入细胞内的透明质酸分子与细胞内的其它成分分离并进行鉴定存在较多的困难。
3.目前有研究通过异硫氰酸荧光素(fitc)对透明质酸进行标记并以普通荧光显微镜或共聚焦显微镜对细胞进行观察，以确认透明质酸分子是否进入到了细胞内，但fitc分子本身无法与透明质酸直接结合，需要通过乙二胺等物质作为桥连接透明质酸与fitc分子，这样需要通过两步反应，反应的交联度低，且在水溶液中虽通过edc/nhs作为交联剂，但连接效率仍极低。除此之外，不管是普通的荧光显微镜还是共聚焦显微镜，其较低的分辨率导致其难以对细胞内的荧光强度进行精准的定量。
4.有鉴于此，仍需要研究便于精准定量分析透明质酸分子进入细胞内的情况的方法，特提出本技术。


技术实现要素：

5.本发明针对透明质酸分子本身不带荧光无法直接进行观察、进入细胞内的透明质酸难以鉴别和定量分析，现有技术缺乏评估透明质酸进入细胞能力的有效方法的问题，提出一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法。
6.本发明方法通过对透明质酸分子进行荧光标记，并使用超分辨显微成像技术对带有荧光标记的透明质酸分子穿过细胞膜进入细胞内的行为进行观察，通过图像处理软件分析细胞内荧光强度的高低以分析不同透明质酸样品透细胞膜吸收能力。
7.本发明的主要技术构思如下：
8.一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法，包括如下步骤：
9.对透明质酸进行荧光标记，合成带有荧光标记的透明质酸；
10.测定所述荧光标记的透明质酸的标记度；
11.用所述荧光标记的透明质酸孵育细胞，待孵育一定时间后，通过超分辨显微镜观察透明质酸是否进入细胞的内部并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。
12.超分辨显微镜，或称超高分辨显微成像技术，其采用的结构光照明显微成像技术(sim)的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨的信息。sim技术由于其具有光毒性低、成像速度快、可用于观察活细胞等优点而得到了越来越广泛的应用。其优点在于对荧光探针的要求较低，样品制备过程相对简单。此外，在使用超分辨显微镜的实验中可以很好地实现多色成像和活细胞成像，因此可用其较精确地分析荧光标记的透明质酸在细胞内的分布情况。
13.荧光素氨作为一种常见的荧光素，其激发波长为490nm，发射波长为515nm。相比于其它常见的荧光素，其价格便宜，且其结构中包含的氨基可以通过交联剂催化以酰胺键连接到透明质酸的羧基上，只需一步反应，效率较高，所以用其标记透明质酸较fitc有很大的优势。
14.作为一种实施方式，采用荧光素对透明质酸进行荧光标记，可选地，所述荧光素为6-氨基荧光素或5-氨基荧光素。
15.作为一种实施方式，荧光标记的反应原理如下式：
[0016][0017]
或者，荧光标记的反应原理如下式：
[0018][0019]
作为一种实施方式，合成带有荧光标记的透明质酸的步骤包括：
[0020]
取透明质酸钠，加入甲酰胺溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚
胺(edc)，充分混匀后静置，活化透明质酸钠中的羧基；然后加入荧光素、避光搅拌，进行充分反应；
[0021]
在避光条件下，向充分反应后得到的反应液中加入乙醇，离心分离并收集沉淀物，继续重复用乙醇洗涤沉淀物、离心分离若干次，干燥所得的沉淀物即得。
[0022]
可选地，用薄层色谱法鉴别合成的荧光标记的透明质酸，优选地，薄层色谱法中使用的展开剂为正丙醇与水的混合物，正丙醇∶水的体积比＝3∶1。
[0023]
作为一种实施方式，所述透明质酸的重均分子量为2-2000kda，优选30-200kda，所述透明质酸为单一分子量的样本或多分子量混合后的样本。
[0024]
可选地，所述荧光素的物质的量浓度为反应体系中透明质酸所含二糖重复单元总数的0.4-1.0倍，优选0.5倍。
[0025]
作为一种实施方式，所述edc的物质的量浓度为反应体系中透明质酸所含二糖重复单元总数的2.0-10.0倍，优选5.0倍。
[0026]
作为一种实施方式，测定所述荧光标记的透明质酸的标记度的步骤包括：
[0027]
将荧光素溶解于pbs缓冲液中，得到设定浓度梯度的fa溶液；
[0028]
将荧光标记的透明质酸溶解于pbs缓冲液中，得到ha-fa溶液；
[0029]
分别测定设定浓度梯度的fa溶液及ha-fa溶液的吸光度；
[0030]
针对设定浓度梯度的fa溶液的吸光度数据，以浓度为自变量，吸光度为因变量，以最小二乘法对数据进行线性拟合，得到形如a＝ac
fa
b的标准曲线，其中，a为吸光度，c
fa
为fa浓度，a、b为常数；而后由标准曲线a＝ac
fa
b按如下公式计算ha-fa溶液中fa的含量：
[0031]cfa
＝(a-b)/a
[0032]
通过上述公式计算得到的ha-fa溶液中所含的fa含量等价于fa标准品溶液的浓度，记为c
fa
，根据以下公式计算标记度：
[0033][0034]
其中，mr
ha
为所用透明质酸样品的重均分子量，c
ha-fa
为ha-fa溶液的浓度，mr
fa
为fa的相对分子质量，该步骤计算得到的标记度，用于表征ha-fa样本中所含fa的数目，以保证每次细胞孵育实验时所使用的ha-fa中所含的fa的量相等，由此可通过比对荧光强度的强弱判断ha进入细胞能力的高低。
[0035]
作为一种实施方式，通过超分辨显微镜观察细胞并计算细胞内的荧光强度以分析透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱的步骤包括：
[0036]
(1)配制含ha-fa的培养基：称取一定质量的ha-fa，通过如下公式将ha-fa的量转换为其中所含fa的量：
[0037][0038]
其中，m
fa
为fa的物质的量，w
ha-fa
为ha-fa的质量，mr
ha-fa
为ha-fa的相对分子质量，在标记度不高的情况下可用ha重均分子量代替；后以细胞培养基溶解，使其中所含的ha-fa经转换后等价于fa的浓度，以确定每次孵育细胞所用的ha-fa溶液中所含fa的量相等；
[0039]
(2)细胞接种及染色：细胞正常培养至对数生长阶段，然后按正常传代步骤接种至
超分辨显微镜专用培养皿内，正常培养至细胞生长至培养皿面积(60
±
2)％的密度，后更换含ha-fa的培养基，孵育2-12h，后用pbs缓冲液清洗，洗去ha-fa，后更换无酚红培养基，后用蓝色、红色或红外的探针至少对细胞中细胞膜、细胞核或线粒体的结构进行染色，以对细胞进行定位；
[0040]
(3)超分辨显微镜观察与结果分析：将细胞置于超分辨显微镜下，以绿色通道及所用细胞器探针的通道对细胞进行观察并拍照；
[0041]
用图片处理软件计算视野内每个细胞内的荧光强度并对面积求平均值，对比各组细胞荧光强度高低，荧光强度值的高低表明透明质酸的透细胞膜吸收能力的强弱。
[0042]
作为一种实施方式，所述超分辨显微镜采用结构光照明显微镜。
[0043]
作为一种实施方式，采用所述超分辨显微镜观察时，观察ha-fa所用的通道为greenhs 488通道，曝光时间为10-300ms，优选200ms，曝光度为0.1％-100％，优选30％。
[0044]
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0045]
1、本发明方法中采用荧光标记透明质酸，该过程得到的荧光标记透明质酸分子的标记度适中，通过红外光谱分析发现该过程标记后的透明质酸分子的谱图与未标记透明质酸分子的谱图基本一致(见图1)，说明该标记方法相对温和，标记过程不会对透明质酸分子的天然结构造成破坏，不会改变透明质酸分子的生物学活性。
[0046]
2、本发明方法采用醇沉淀法对荧光标记后产物进行分离纯化，免去长时间的水溶液透析过程，避免荧光标记后产物的水解，同时避免因透析后形成大量溶液而导致的耗时的冻干过程。
[0047]
3、本发明采用的6-氨基荧光素及5-氨基荧光素标记透明质酸，可适应超分辨成像显微镜下的高强度曝光要求。
[0048]
4、本发明方法利用荧光标记的透明质酸分子孵育细胞，待其透过细胞膜进入细胞内后，通过超高分辨成像系统对其孵育过的细胞进行观察，通过软件对细胞内的荧光强度进行分析，相比于传统荧光显微镜和共聚焦显微镜，超分辨显微镜的分辨率更高，从而可更直观、更准确地得到细胞对透明质酸透膜吸收能力的强弱。
[0049]
5、本发明方法实现了对透明质酸透细胞膜吸收能力的可视化及定量分析。
[0050]
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0051]
图1是本发明方法中透明质酸分子荧光标记前、后的红外谱图。
[0052]
图2是本发明实施例1中所得到的fa吸光度随浓度变化的标准曲线。
[0053]
图3是本发明实施例1中200kda ha-fa孵育细胞2h后的sim图像。
[0054]
图4是本发明实施例1中30kda ha-fa孵育细胞2h后的sim图像。
[0055]
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
具体实施方式
[0056]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057]
实施例1
[0058]
本实施例用荧光素氨标记30kda以及200kda的ha分子，然后用其分别孵育细胞，用超分辨显微镜进行观察并用imagej软件计算细胞内的荧光强度，从而根据荧光强度的强弱判断这两种分子量的透明质酸透细胞膜吸收能力的强弱。
[0059]
具体操作步骤如下：
[0060]
(1)对透明质酸分子进行荧光标记，合成带有荧光标记的透明质酸
[0061]
称取0.0264g 200kda的透明质酸钠于小烧杯中，加入1.32ml甲酰胺溶解，使所得溶液中透明质酸钠的浓度为20mg/ml；
[0062]
然后加入0.0606g edc，该edc的量为反应体系中透明质酸所含双糖单位物质的量的5.0倍，充分混匀后于4℃静置10分钟，活化透明质酸钠中的羧基；
[0063]
然后加入0.0135g 6-氨基荧光素，该6-氨基荧光素的量为反应体系中透明质酸所含双糖单位物质的量的5.0倍，4℃避光，磁力搅拌器搅拌12小时，充分反应。
[0064]
(2)分离纯化合成的荧光标记透明质酸
[0065]
将充分反应后的全部反应溶液转移至离心管，加入13.2ml乙醇，震荡5min混匀，可见离心管中出现淡黄色絮状物，表明荧光标记的透明质酸已从溶液中析出，后用离心机以10000r/min的转速离心10分钟，弃去上清液，得到荧光标记的透明质酸沉淀；
[0066]
然后，再次加入13.2ml乙醇，充分震荡使沉淀均匀分散到乙醇溶液中，震荡5分钟，再以10000r/min的速度离心10分钟，弃去上清液，后重复上述步骤2次，总共洗涤沉淀3次；
[0067]
弃去上清液，将得到的沉淀冷冻干燥1h，即得到干燥的荧光标记的透明质酸样品，将得到的ha-fa避光密封-20℃保存；
[0068]
上述分离纯化步骤应全程避光进行。
[0069]
图1是透明质酸分子荧光标记前后的红外谱图，其中，3227cm-1
处的宽峰为羟基的吸收峰，1623cm-1
处为羧基的吸收峰，1044cm-1
处的两个峰分别为伯醇和叔醇的吸收峰，895cm-1
处的峰表示了β糖苷键的吸收峰。
[0070]
标记前后ha-fa的红外谱图几乎没有发生改变，说明本发明的标记过程并未对ha结构造成太大影响，不会影响ha的生物活性。
[0071]
(3)用tlc鉴别上述合成的荧光标记的透明质酸，以确认fa已通过酰胺键连接到透明质酸分子上
[0072]
首先，制备fa与ha的混合溶液：称取0.0120g ha溶解于12.0ml水中，得到浓度为1.0mg/ml的ha溶液，后称取0.0012gfa加入到上述ha溶液中，使溶液中fa的浓度为0.1mg/ml；
[0073]
然后制备ha-fa溶液：称取0.0014g ha-fa溶解于1.4ml的水中，得到浓度为1.0mg/ml的ha-fa溶液；
[0074]
将上述步骤得到的ha与fa的混合溶液以及ha-fa溶液各10μl置于薄层板上，用正
丙醇：水的体积比＝3：1作为展开剂展开，以10w％的浓硫酸进行显色，结果显示，ha与fa的混合溶液点中，ha与fa在展开过程中相互分离，fa形成的黄色斑点接近溶剂前沿，而ha-fa点则在原点处形成一个向上拉长的椭圆形黄色斑点，这表明fa已通过酰胺键连接到了ha分子上。
[0075]
每分子ha上至少连接一分子fa即可认为成功合成了本发明方法所述的ha-fa。
[0076]
(3)测定所述荧光标记透明质酸的标记度
[0077]
首先配制不同浓度梯度的fa溶液：称取0.0011g fa，用11.0ml的pbs溶解，得到浓度为0.1mg/ml的fa母液溶液，然后将fa母液以pbs稀释，得到浓度梯度为0.001mg/ml，0.003mg/ml，0.005mg/ml，0.01mg/ml，0.02mg/ml的fa溶液；然后称取0.0012g的ha-fa，溶解于6.0mlpbs中，得到浓度为0.2mg/ml的ha-fa溶液。
[0078]
然后用紫外吸光光度计(检测波长480nm)分别检测上述各浓度梯度的fa溶液及ha-fa溶液的吸光度，每组溶液测量三次取平均值作为该溶液的吸光度，测得的吸光度数据如表1所示。
[0079]
表1 fa及ha-fa的吸光度
[0080][0081]
对上述各浓度梯度的fa溶液吸光度的数据，以浓度为自变量，吸光度为因变量，以最小二乘法对数据进行拟合，得到标准曲线如图2所示，得到的标准曲线为a＝85.169
×
cfa-0.0073，其r2＝0.9999；
[0082]
然后根据上步所得标准曲线，根据以下公式进行计算：
[0083]cfa
＝(a-b)/a
[0084][0085]
计算可得合成的透明质酸分子的标记度为15.5。
[0086]
(4)配制含ha-fa的培养基
[0087]
称取0.0013g ha-fa溶于10ml dmem细胞培养基中，对其中所含的ha-fa浓度经上述标记度转换后可知其等价于fa的浓度为10μmol/l。
[0088]
(5)细胞接种及染色
[0089]
hepg2细胞正常培养至对数生长阶段，然后接种至超分辨显微镜专用培养皿内，培
养至细胞生长至密度为(60
±
2)％培养皿面积，后更换上述含ha-fa的培养基，孵育2h，后用pbs清洗5次，洗去ha-fa，后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核进行染色，pbs清洗5次后，更换无酚红培养基。
[0090]
(6)超分辨显微镜观察与结果分析
[0091]
将细胞置于超分辨显微镜下，以greenhs 488绿色通道及bluehs 405蓝色通道对细胞进行观察，其中，绿色通道曝光时间为200ms，曝光度为30％，蓝色通道曝光时间为30ms，曝光度为50％，得到的sim图片如图3所示，
[0092]
图中绿色荧光为进入细胞内的ha-fa，蓝色荧光为细胞核。
[0093]
用imagej软件计算sim图片中绿色荧光强度的平均值，其数值以灰度值表示，如表2所示。
[0094]
将200kda的ha更换为30kda的ha，重复上述步骤，孵育细胞所用的ha-fa溶液中所含fa的浓度应与前述步骤相同，即同样为10μmol/l，后以超分辨显微镜拍照观察，得到荧光标记的30kda的ha-fa分子孵育细胞后的sim图片。
[0095]
如图4所示，图中绿色荧光为进入细胞内的ha-fa，蓝色荧光为细胞核；用imagej软件计算得到图片中绿色荧光强度的平均值，其数值以灰度值表示，如表2所示。
[0096]
表2绿色荧光强度数值
[0097][0098]
从图3及图4中可直观地看出，孵育细胞2h后，分子量为30kda的ha-fa相较于分子量为200kda的ha-fa，细胞内有更多的绿色荧光。
[0099]
通过对荧光强度进行计算也可以看出，30kda的ha-fa孵育细胞后细胞内荧光强度的值(imagej软件转换为灰度值)要明显高于分子量为200kda的ha。
[0100]
由此可见，本发明方法直观准确地得出了细胞对透明质酸透膜吸收能力的强弱，便于推广应用。
[0101]
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。