针对IL-17RA蛋白的抗体及其制备方法和应用与流程

针对il-17ra蛋白的抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及针对il-17ra蛋白的抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.白介素17受体a(interleukin-17receptor a,il-17ra)在1995年被首次发现，并且被确认为白介素17a(il-17a)和白介素17f(il-17f)的受体。随后，一系列的其他白介素17受体家族成员被发现了，分别为il-17rb、il-17rc、il-17rd和il-17re，这5个家族成员在序列上都包含一个相同的结构域，但是和其他已知的，如肿瘤坏死因子(tnf)受体，toll样受体(tlr)以及i/ii型干扰素(ifn)受体家族具有很大的区别。
3.il-17受体家族成员可以被il-17家族成员特定的配体特异性识别。il-17家族包含6个成员，即il-17a、b、c、f、e和f。通常情况下，il-17a和il-17f会与由il-17ra和il-17rc组成的受体复合物结合，il-17b与il-17rb结合，il-17c和il-17re结合，il-17e(也被称为il-25)会与由il-17ra和il-17rb(也被称为il-25r)组成的受体复合物结合。2012年的一项研究表明il-17rd也会参与到il-17a介导的信号通路中来，但目前对il-17d还知之甚少。
4.由il-17ra介导的信号通路主要有两条：il-17a(f)信号和il-17e(il-25)信号。就现有的研究结果得知，il-17a和il-17f在序列上具有最高的同源性，并且二者可以形成il-17a/a、il17-f/f同源二聚体或者il1-7a/f异源二聚体，然后和il-17ra/rc异二聚体受体复合物结合进而激活下游信号。一直以来，il-17a和il-17f都被认为是重要的促炎因子并且会引发诸如nf-κb、mapks以及c/ebps等炎症信号。
5.目前，已有研究通过il-17a/f分别缺陷的小鼠来区别二者不同的生物活性。在小鼠的炎症模型当中，il-17a显示出了间接的促炎作用。而o’connor等人的研究表明，il-17a缺陷的t细胞在小鼠cd45rbhi转移性肠炎模型中会引发加剧的病症。
6.il-17ra可以激活多个下游炎症信号通路，包括nf-κb通路。
7.nf-κb是一个典型的炎症相关的转录因子，iκbα是nf-κb的抑制因子，而nf-κb可以通过p50和p56亚基来使iκbα磷酸化和降解。有趣的是，shen等人通过microarray分析发现il-17a/il-17ra可以促进iκbζ的表达，而iκbζ是il-6表达所需要的，其证明il-17a与tnfα协同促进炎症反应。此外，il-17ra还会激活mapks信号以及c/ebp信号。
8.还有一些研究表明pi3k和jak/stat通路也会参与到il-17ra信号当中。
9.目前，靶向il-17信号分子的疗法成为治疗自身免疫疾病患者的重要手段，该方法可以缓解患者体内非常夸张的炎症反应，il-17信号通路中的多个分子成为单克隆抗体的靶向分子，例如靶向il-12/23p40的ustekinumab和briakinumab，靶向il-6的clazakizumab、olokizumab、sirukumab，靶向il-6r的tocilizumab、sarilumab，靶向il-17a的secukinumab、ixekizumab。
10.而靶向il-17ra的目前处于临床研究的只有单克隆抗体brodalumab。brodalumab是全人源化单克隆抗体，可与il-17r结合，阻断多种il-17细胞因子(a、f、a/f和c)与受体结
合，抑制炎症信号传递，而il-17通路是引起和促进炎症过程的关键作用所在，该药物于2017年2月15日，美国fda批准valeant制药公司研发的单抗药物siliq(brodalumab)上市，用于治疗银屑病(atopic dermatitis)。但该药在临床试验阶段一度陷入会引发患者自杀念头的风波，并且目前只是作为二线药物用于银屑病的治疗。显然，该药物作为治疗用药存在问题。
11.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于提供针对il-17ra蛋白的抗体、其制备方法、包含该抗体的分离的核酸、重组载体、宿主细胞以及用于检测il-17ra的试剂盒。
13.本发明是这样实现的：
14.第一方面，本发明实施例提供针对il-17ra蛋白的抗体，
15.所述抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自(1)～(37)中的任一种：
16.(1)如seq id no.1～3所示序列；
17.(2)如seq id no.4～6所示；
18.(3)如seq id no.7～9所示；
19.(4)如seq id no.10～12所示；
20.(5)如seq id no.13～15所示；
21.(6)如seq id no.16～18所示；
22.(7)如seq id no.19～21所示；
23.(8)如seq id no.22～24所示；
24.(9)如seq id no.25～27所示；
25.(10)如seq id no.28～30所示；
26.(11)如seq id no.31～33所示序列；
27.(12)如seq id no.34～36所示；
28.(13)如seq id no.37～39所示；
29.(14)如seq id no.40～42所示；
30.(15)如seq id no.43～45所示；
31.(16)如seq id no.46～48所示；
32.(17)如seq id no.49～51所示；
33.(18)如seq id no.52～54所示；
34.(19)如seq id no.55～57所示；
35.(20)如seq id no.58～60所示；
36.(21)如seq id no.61～63所示序列；
37.(22)如seq id no.64～66所示；
38.(23)如seq id no.67～69所示；
39.(24)如seq id no.70～72所示。
40.第二方面，本发明实施例提供一种分离的核酸，其编码如前述实施例所述的针对
il-17ra蛋白的抗体。
41.第三方面，本发明实施例提供一种重组载体，其含有前述实施例所述的分离的核酸。
42.第四方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其含有前述实施例所述的重组载体。
43.第五方面，本发明实施例提供针对il-17ra蛋白的抗体的制备方法，其包括培养如前述实施例所述的宿主细胞，获得针对il-17ra蛋白的抗体。
44.第六方面，本发明实施例提供一种用于检测il-17ra的试剂盒，其包括前述实施例所述的针对il-17ra蛋白的抗体。
45.第七方面，本发明实施例提供如前述实施例所述的针对il-17ra蛋白的抗体在制备抑制或预防自身免疫疾病的药物中的应用。
46.本发明具有以下有益效果：
47.本发明提供了一种新的抗il-17ra的抗体，为自身免疫疾病的研究或其药物开发提供了一种新的途径，有助于开发出新的自身免疫疾病的相关治疗手段。
附图说明
48.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
49.图1为实施例1中人源重组il-17ra蛋白的sds-page分析结果；
50.图2为实施例1中针对il-17ra的单域抗体文库的vhh片段正确插入率分析结果；
51.图3为实施例1中基于构建的针对il-17ra的纳米抗体文库，以固相淘选的方式针对il-17ra进行特异性抗体的靶标富集结果；
52.图4为实施例1中筛选出的部分单域抗体在原核表达系统中纯化的结果sds-page分析图；
53.图5为实施例1中的单域抗体fc融合表达载体示意图；
54.图6为实施例2中纯化后的单域抗体与靶标蛋白的初步亲和力elisa检测结果；
55.图7为实施例3中纯化后的单域抗体与靶标蛋白的亲和力量效曲线；
56.图8为单域抗体体外中和细胞因子释放实验结果。
具体实施方式
57.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
58.名词定义
59.本说明书中提到的“单域抗体”是一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)，也被称为纳米抗体。
60.本说明书中提到的“cdr”为抗体的互补决定区，抗体通常包含两个可变区，重链可
变区和轻链可变区，重链可变区或轻链可变区通常包括3个cdrs。
61.本发明实施例提供了针对il-17ra蛋白的抗体，
62.所述抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自(1)～(24)中的任一种：
63.(1)如seq id no.1～3所示序列；
64.(2)如seq id no.4～6所示；
65.(3)如seq id no.7～9所示；
66.(4)如seq id no.10～12所示；
67.(5)如seq id no.13～15所示；
68.(6)如seq id no.16～18所示；
69.(7)如seq id no.19～21所示；
70.(8)如seq id no.22～24所示；
71.(9)如seq id no.25～27所示；
72.(10)如seq id no.28～30所示；
73.(11)如seq id no.31～33所示序列；
74.(12)如seq id no.34～36所示；
75.(13)如seq id no.37～39所示；
76.(14)如seq id no.40～42所示；
77.(15)如seq id no.43～45所示；
78.(16)如seq id no.46～48所示；
79.(17)如seq id no.49～51所示；
80.(18)如seq id no.52～54所示；
81.(19)如seq id no.55～57所示；
82.(20)如seq id no.58～60所示；
83.(21)如seq id no.61～63所示序列；
84.(22)如seq id no.64～66所示；
85.(23)如seq id no.67～69所示；
86.(24)如seq id no.70～72所示。
87.在可选的实施方式中，所述抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自：(2)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(18)、(20)和(22)中的任一种。
88.在可选的实施方式中，所述抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自(15)、(20)和(22)中的任一种。
89.在可选的实施方式中，所述重链可变区还包括骨架区，具体地，骨架区包括fr1、fr2、fr3和fr4，重链可变区的结构为：
90.fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
91.当所述抗体的重链可变区的cdr1～3的氨基酸序列依次如(1)～(24)所示时，所述重链可变区的氨基酸序列依次如seq id no.73～96所示。在可选的实施方式中，所述抗体选自单域抗体、重链抗体、fc段融合蛋白、iggi、igg2、igg4、iga、ige、igm、igd、fab’、fab、f(ab’)2、fv和scfv片段中的至少一种。
92.具体地，单域抗体(vhh)为前述实施任一所示的重链可变区。需要说明的是，当本说明书实施例中要求保护的“针对il-17ra蛋白的抗体”为单域抗体时，抗体的序列等同于抗体的重链可变区的序列。
93.重链抗体(hcab)为包括上述单域抗体以及两个恒定区(ch2区和ch3区)的抗体；fc段融合蛋白，为将上述重链可变区与免疫球蛋白的fc段融合得到的抗体。
94.所述“iggi、igg2、igg4、iga、ige、igm、igd、fab’、fab、f(ab’)2、fv和scfv片段”为包含上述重链可变区的抗体，这里的“iggi、igg2、igg4、iga、ige、igm、igd、fab’、fab、f(ab’)2、fv和scfv片段”仅是说明抗体的可能的类型，只要是含有上述重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的抗体，均属于本技术保护的范围。
95.在可选的实施方式中，所述抗体为单域抗体或fc段融合蛋白，所述fc段融合蛋白包括所述重链可变区和免疫球蛋白的fc段。
96.在可选的实施方式中，所述抗体为单域抗体。
97.需要说明的是，上述单域抗体可以为人工合成，也可先合成其编码基因，在进行生物表达得到。
98.本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码如前述任一实施方式所述的针对il-17ra蛋白的抗体；
99.在可选的实施方式中，所述核酸包括如seq id no.97～120所示序列中的任一序列。
100.需要说明的是，当抗体为单域抗体且其序列依次如seq id no.73～96所示时，所述核酸的序列依次如seq id no.97～120所示。
101.本发明实施例提供了一种重组载体，其含有如前述任一实施方式所述的分离的核酸。
102.在可选实施方式中，重组载体可以为质粒、噬菌体或病毒载体。
103.本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的重组载体。
104.在可选实施例中，宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。
105.本发明实施例提供了针对il-17ra蛋白的抗体的制备方法，其包括培养如前述实施例所述的宿主细胞，获得针对il-17ra蛋白的抗体。
106.本发明实施例还提供了一种用于检测il-17ra的试剂盒，其包括如前述任一实施方式所述的针对il-17ra蛋白的抗体。
107.此外，本发明实施例还提供了所述的针对il-17ra蛋白的抗体在制备抑制或预防自身免疫疾病的药物中的应用。
108.在可选实施方式中，自身免疫疾病包括克罗恩氏病、银屑病、化脓性汗腺炎、全身炎症和多发性组织硬化中的至少一种。
109.在可选实施方式中，所述抗体通过抑制il-17受体与il-17细胞因子的结合以抑制或预防自身免疫疾病。
110.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
111.实施例1
112.针对人源重组il-17ra蛋白的单域抗体的制备。
113.1.构建人源重组il-17ra蛋白的表达载体：
114.在ncbi中检索获得il-17ra的编码序列，其收录号为nm_014339.6，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为np_055154.3。然后分别通过tmhmm和smart网站对np_055154.3对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。
115.分析结果显示，il-17ra蛋白的胞外端为上述序列的第1～320位氨基酸，其中，第1～32位为该蛋白的信号肽。
116.利用序列特异性引物，通过限制性内切酶xbai和agei将编码il-17ra蛋白的第1～320位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcdna3.4中。将构建好的载体进行sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293f进行目的蛋白(il-17ra蛋白)的表达和纯化，人源重组il-17ra蛋白纯化后sds-page分析如图1所示。
117.由图1可知，纯化后蛋白纯度高达90％，满足动物免疫需求。
118.2.构建il-17ra蛋白的单域抗体文库
119.将1mg步骤1中纯化获得的人源重组il-17ra蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是用1mg il-17ra蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对il-17ra蛋白的抗体。
120.动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150ml，并提取细胞的rna。利用提取的总rna合成cdna，并通过套式pcr反应以cdna为模板扩增vhh(抗体重链可变区)。
121.然后利用限制性内切酶分别酶切pmecs载体和vhh片段，然后将酶切后的片段和载体链接。将连接后的片段点转化至感受态细胞tg1中，构建mmp9蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1
×
109，同时，通过菌落pcr鉴定检测文库在目的片段的正确插入率，结果如图2所示。
122.结果显示，从文库中随机挑选的30个菌落进行pcr扩增后，有28个克隆可以扩增出大小为600bp(预测大小)的条带，有2个克隆扩增出条带不正确，故正确插入率为28
÷
30
×
100％≈93.3％。
123.3.筛选抗il-17ra蛋白的单域抗体
124.取200μl步骤2中的重组tg1细胞至2
×
ty培养基中培养，期间加入40μl辅助噬菌体vcsm13侵染tg1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用peg/nacl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体。
125.将稀释在100mm ph 8.3的nahco3中的il-17ra蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；第二天加入200μl的3％的脱脂乳，室温封闭2h；封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2
×
10
11
个噬菌体颗粒)，室温作用1h；作用1小时后，用pbs 0.05％tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体。
126.用终浓度为25mg/ml的胰蛋白酶将与il-17ra蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌tg1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集，当富集倍数达到10倍以上时，富集效果如图3所示。
127.图3中，p/n＝生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染tg1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染tg1细菌后生长的单克隆细菌数，该参数在富集发生后会逐渐增大；i/e＝生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱
出的噬菌体总量，该参数在富集发生后会逐渐趋近于1。
128.4.酶联法筛选抗il-17ra的特异性阳性克隆
129.根据上述步骤3中的筛选方法对抗il-17ra蛋白的单域抗体进行3轮筛选，抗il-17ra蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，筛选结束后，从筛选获得的阳性克隆中挑选400个单菌落分别接种于含100μg/ml氨苄青霉素的tb培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mm的iptg，28℃培养过夜。
130.利用渗透涨破法获得粗提抗体；将il-17ra重组蛋白分别释至100mm ph 8.3的nahco3中并将100μg蛋白在酶标板(elisa板)中4℃包被过夜。将获得的抗体粗提液取100ul转移至加入抗原的elisa板上，室温孵育1h；用pbst洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的mouse anti-ha tag antibody(鼠抗ha抗体，thermo fisher)，在室温孵育1h；用pbst洗去未结合的抗体，加入100μl经1:20000稀释后的anti-rabbit hrp conjugate(山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于thermo fisher)，在室温孵育1h；用pbst洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入中止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值。
131.当样品孔od值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中以便提取质粒并进行测序。
132.根据序列比对软件vector nti分析各个克隆株的基因序列，把cdr1，cdr2和cdr3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对il-17ra蛋白的单域抗体。
133.其抗体的氨基酸序列为fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4结构，构成整个vhh。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。
134.5.抗il-17ra蛋白的单域抗体在宿主大肠杆菌中的纯化及表达。
135.将步骤4中测序分析所获得不同克隆株的质粒(pmecs-vhh)电转化到大肠杆菌hb2151中，并将其涂布在lb amp glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；挑选单个菌落接种在5ml含有岸边青霉素的lb培养液中，37℃摇床培养过夜。
136.接种1ml的过夜培养菌种至330ml tb培养液中，37℃摇床培养，培养到od600nm值达到0.6-0.9时，加入1m iptg，28℃摇床培养过夜；离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；
137.通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，如图4所示，包括vhh1～18。
138.6.含有抗il-17ra蛋白的单域抗体的fc段融合蛋白真核表达载体的构建。
139.将步骤4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将步骤4中筛选出来的单域抗体经sanger测序得到其核苷酸序列。通过序列合成的方式将密码子优化后的上述核苷酸序列合成至设计改造的纳米抗体通用的目标载体rjk-v4-hfc中。
140.rjk-v4-hfc为在invitrogen商业化载体pcdna3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/tfs-assets/lsg/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源igg的重链编码序列(ncbi accession no：ab776838.1)中的fc区段后改造而来的，即该载体包含了igg重链的铰链区(hinge)ch2和ch3区。具体改造方案如下：
141.选取pcdna3.4上的限制性酶切位点xbai和agei；在fc片段编码序列的5’端和3’端
通过重叠pcr的方式分别引入多克隆位点(mcs，multiple cloning site)和6
×
his标签，如图5所示；使用分别带有xbai和agei酶切位点的一对引物通过pcr的方式将上述片段扩增，得到重组dna片段；使用限制性内切酶xbai和agei分别酶切pcdna3.4和得到的重组dna片段；将酶切后的载体和插入片段在t4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
142.将构建好的重组真核表达载体转化至dh5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
143.7.含有抗il-17ra蛋白的单域抗体的fc段融合蛋白在悬浮expi cho-s细胞中表达。
144.转染前3天以2.5
×
105/ml细胞传代和扩大培养expi cho-s
tm
细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的expicho
tm
表达培养基的500ml摇瓶中；使细胞浓度达到约4
×
106～6
×
106活细胞/ml。
145.在转染前一天，将expicho-s
tm
细胞稀释浓度至3.5
×
106活细胞/ml，使细胞过夜培养；转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7
×
106～10
×
106活细胞/ml。
146.用预热至37℃新鲜的expi cho
tm
表达培养基将细胞稀释至6
×
106个活细胞/ml。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml(终体积)的expicho
tm
表达培养基的500ml摇瓶中：使轻轻颠倒混匀expifectamine
tm
cho试剂，用3.7ml optipro
tm
培养基稀释expifectamine
tm
cho试剂，回荡或混匀；用冷藏的4ml optipro
tm
培养基稀释质粒dna，回荡混匀；将expifectamine cho/质粒dna复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
147.将细胞在37℃、8％co2、加湿的空气中震荡培养；转染后第1天(18-22小时后)添加600μl expifectamine
tm
cho enhancer和24ml expicho feed。在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。
148.8.含有抗il-17ra蛋白的单域抗体的fc段融合蛋白在悬浮293f细胞中的表达。
149.重组单域抗体表达实验流程(以500ml摇瓶为例)：
150.转染前3天以2.5
×
105/ml细胞传代和扩大培养293f细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的opm-293cd05 medium培养基的500ml摇瓶中。使细胞浓度达到约2
×
106-3
×
106活细胞/ml。
151.转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2
×
106～3
×
106活细胞/ml。用预热的opm-293cd05medium将细胞稀释至1
×
106个活细胞/ml。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml(终体积)的培养基的500ml摇瓶中。
152.用4ml opti-mem培养基稀释pei(1mg/ml)试剂，回荡或吹打混匀；用4ml opt-mem培养基稀释质粒dna，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
153.将稀释的pei试剂加入稀释的dna中，颠倒混匀。将pei/质粒dna复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
154.将细胞在37℃、5％co2、120rpm震荡培养。转染后第24h、72h添加5ml opm-cho pff05补料。在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清。
155.9.含有抗il-17ra蛋白的单域抗体的fc段融合蛋白的纯化
156.将步骤6或7中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；将滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源fc与protein a(蛋白a)结合的能力，使用偶联protein a的琼脂糖填料进行纯化；
157.将滤液通过1ml/分钟的流速流穿protein a预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；用低ph缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行洗脱；将洗脱液迅速加入ph9.0的tris-hcl溶液，进行中和。
158.将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行sds-page分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/ml以上后，低温保存备用。
159.实施例2
160.实施例1提供的单域抗体与il-17ra亲和力的elisa检测。
161.将抗il-6的vhh作为同型对照，检测抗il-17ra蛋白的vhh与靶点的结合能力，操作步骤如下：
162.将50μl浓度为1ng/μl的人源重组il-17ra样品包被到elisa板材上，4℃包被过夜；使用5％脱脂奶粉对上述包被的板材进行封闭，封闭1小时，每孔脱脂奶粉200μl；加入实施例1中步骤4获得的单域抗体，该单域抗体带有ha或者人源fc标签，孵育1小时；加入特异性针对ha标签蛋白或人源fc的检测抗体(hrp标记)，孵育0.5小时；加入显色底物tmb，显色；加入终止液终止反应。测量od450值，如图6所示。结果显示，通过生物淘选的37株单域抗体，在elisa检测实验中只有一部分(24株抗体)与il17ra有明显的特异性结合作用，剩余的13株抗体可判断为非特异性结合。
163.24株单域抗体的氨基酸序列如seq id no.73～96所示，请参照表1。表1单域抗体
164.[0165][0166]
实施例3
[0167]
实施例1提供的单域抗体与il-17ra亲和力的量效曲线测定。
[0168]
将50μl浓度为1ng/μl的人源重组il-17ra样品包被到elisa板材上，4℃过夜；洗板；加入200μl 5％牛奶，37℃封闭1h；将实施例2中p/n值较高的24株单域抗体分别稀释至2μg/ml，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度；洗板；加入50μl抗体，两复孔，37℃孵育1h；洗板；加入50μl鼠抗ha标签hrp二抗，37℃孵育30min；洗板；加入50μl预先恢复常温的tmb，避光常温反应15min；加入50μl终止液(1n hcl)，酶标仪读数保存；绘制曲线，计算ec50，结果如图7所示。
[0169]
由图7可知，在实施例2中分析获得的24株抗体中，有9株单域抗体与il17ra结合的量效曲线ec50值较低，且曲线窗口较大，证明这9株单域抗体与il17ra的亲和力常数较小，亲和力高。
[0170]
9株单域抗体分别为：1h10、3b1、4a8、1b6、4a9、1g12、3b8、1c11和3a10。
[0171]
抗体在未经成熟的亲和力常数已达到nm级别。其中，克隆1b12虽然在本实验中ec50曲线窗口较小，但是在实施例5的功能结果中却表现出较好的生物功能活性。
[0172]
实施例4
[0173]
实施例1中的il-17ra的单域抗体中和细胞因子释放实验。
[0174]
il-17可诱导hela细胞释放il-6，il-17r的中和性抗体可以阻断此反应。实验步骤如下：
[0175]
将hela细胞铺于96孔板，每孔一万个细胞；将最高浓度10μg/ml，5倍梯度稀释的抗il-17ra的vhh(实施例3中ec50较低的单域抗体)，并对照设置3组对照例，分别为lxekizumab、brodalumab和空白对照higg，将之与220ng/ml il-17以1:1混合；将混合后的混合物与细胞按1:1混合，培养24小时后收集细胞上清；用human il-6elsia试剂盒检测细胞上清中的il-6表达情况，elisa实验条件参考thermo，cat#88-7066-88的说明书，结果如图8所示。
[0176]
结果显示在实施例3中获得的ec50较低(亲和力高)的9株单域抗体在功能实验中，克隆3b8、4a9较好，但是其功能可以通过氨基酸突变来实现优化，而克隆1b12虽然在实施例3中量效曲线窗口很小，但是在本实施例中表现优秀，ec50较低，且曲线窗口较大。
[0177]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。