一种降解多环芳烃类污染物的假单胞菌菌株及其应用

1.本发明属于有机污染物修复治理技术领域，具体涉及一种能降解多环芳烃类污染物的假单胞菌菌株及其应用方法。


背景技术：

2.多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是指一类由两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环碳氢化合物，其中具有4个苯环及4以上的pahs称之为高分子量多环芳烃(highmolecular weight-pahs，hmw-pahs)。多环芳烃的来源主要包括两个方面：一方面是自然界自身的活动，如森林火灾、动植物遗体腐烂、石油煤炭形成、火山喷发等；另一方面是人类污染行为，如化石燃料的不完全燃烧、城市固体废弃物的焚烧、石油开采、加工运输以及化工生产和汽车尾气的排放等。多环芳烃通常存在于石化产品、橡胶、塑料、润滑油防锈油以及不完全燃烧的有机化合物等物质中，它可以通过大气和水体的流动发生长距离迁移，因此其广泛分布在大气、土壤、水体、沉积物以及植物等各种环境介质中。由于多环芳烃水溶性低、吸附性强、半衰期长，使其可以持续存在于环境中数年，而且通常随着芳环数和分子量的增大，其生物可利用性越差。多环芳烃的脂溶性使其可以通过食物链逐级富集到处于食物链末端人的体内，并分散到体内组织，通过蛋白质酮-稀醇互变异构过程中的催化作用，导致蛋白的不可逆转变，进而使细胞发生癌变。pahs的“致癌性、致畸性、致突变”效应，对人类健康和生态系统造成巨大威胁，故多环芳经的污染修复刻不容缓。
3.土壤微生物修复技术是一种利用土著微生物或人工驯化的具有特定功能微生物，在适宜环境条件下，通过自身的代谢作用，降低有害污染物活性或降解成无害物质的修复技术。微生物修复技术包括生物通风法、投菌法、生物培养法、异位微生物修复技术、土耕法、生物堆制法、生物泥浆法、土壤堆肥法、预制床法等。微生物修复具有高效、经济、应用范围广、对环境的毒害作用较小、不会产生二次污染的优点。
4.虽然pahs是一种极为稳定的难降解物质，但因其分布广泛，一些环境中的微生物可以经过适应和诱导，对pahs进行代谢分解，甚至矿化。微生物主要以两种方式代谢：一种是以pahs为唯一碳源和能源；另一种是与其它有机质共代谢。所谓的共代谢是指利用一种容易降解的物质作为支持微生物生长繁殖的营养物质，而同时降解另一种物质，但后一种物质的降解和转化并不能使共代谢的微生物获得能量、碳源或其它的任何营养物质。其中，微生物的共代谢作用对于难降解污染物pahs的彻底分解或矿化起主导作用。生物修复利用微生物来分解土壤中的污染物，将其转化为细胞其它碳基大分子和二氧化碳。这项技术攻克的关键就是从污染土壤中不断筛选，找到效果最好的单菌。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株能够快速降解多环芳烃类污染物的菌株，且有用于环境修复的价值。
6.本发明的技术方案具体为：
7.一种能够降解多环芳烃类有机污染物的菌株，具体为假单胞菌phe11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc m2022278，保藏日期为2022年3月18日。
8.该菌株由加油站附近的土壤中分离得到，能够实现多种多环芳烃类污染物的快速降解。通过生理生化鉴定和核糖体16s rdna测序分析，确定其为假单胞菌属(pseudomonas sp.)。
9.该菌株的生物学特性为革兰氏阴性菌，在lb平板上菌落为圆形，边缘光滑圆润，菌落呈乳白色，质地湿润，菌长在0.8～2.5μm左右，宽在0.5μm左右，稍隆起。
10.上述菌株可以用于土壤或水体修复治理，具体实施方法可以为：将菌株接种于包含多环芳烃有机污染物的土壤或水体中进行降解处理，其中多环芳烃有机污染物包括菲、萘、芴、荧蒽、芘和苯并芘中的一种或多种。
11.进一步地，在上述技术方案中，土壤或水体的ph为4～10。
12.进一步地，在上述技术方案中，土壤或水体的盐浓度为0～6％(质量浓度)；更进一步地，土壤或水体的盐浓度为0～3％。
13.进一步地，在上述技术方案中，降解处理的温度为16～42℃。
14.进一步地，在上述技术方案中，土壤或水体中含有重金属，所述重金属为cd
2
、pb
2
、zn
2
、mn
2
、cd
2
、pb
2
、zn
2
、mn
2
、cro
42-、co
2
中的一种或多种。
15.进一步地，在上述技术方案中，土壤或水体中添加有能够促进菌株降解多环芳烃类有机污染物的表面活性剂。
16.更进一步地，表面活性剂可以为海藻糖脂，海藻糖脂的添加量可以为10～100mg/l。
17.上述菌株还可以与其他菌株组合，制备成用于降解多环芳烃类有机污染物的微生物菌剂。
18.本发明的有益效果为：本发明菌株对芘、苯并芘、菲、芴和荧蒽等有机污染物具有高效快速的降解能力，尤其是菲、芴、芘，能够降解高浓度的菲；温度适用范围广，可用于常温或低温环境条件下的多环芳烃污染物去除；具有广泛的酸碱度适应能力，在弱酸性、中性、弱碱性环境中均表现出高效的多环芳烃去除能力，有利于多种类型土壤的原位修复；有广泛的重金属耐受力，有利于该菌定值于多环芳烃—重金属复合污染地区，对复合污染的土壤或水体进行高效修复；还具有广泛的盐度适应能力。故本发明菌株是对受多环芳烃类有机污染物的土壤或水体进行生物修复的优秀微生物材料。
附图说明
19.图1为实施例1中采用双层平板法分离菲降解菌的示意图；
20.图2为本发明菌株phe11的在固体lb平板上的生长图(a)和sem图(b)；
21.图3为本发明菌株phe11的系统发育树；
22.图4为本发明菌株phe11在lb培养液中的生长曲线；
23.图5为实施例2中菌株phe11在200mg/l菲浓度下的生长和降解曲线；
24.图6为本发明菌株phe11在不同起始菲浓度下的7天降解率对比图；
25.图7为本发明菌株phe11在不同培养温度下菲的7天降解率对比图；
26.图8为本发明菌株phe11在不同nacl浓度下菲的7天降解率对比图；
27.图9为本发明菌株phe11在不同ph条件下菲的7天降解率对比图；
28.图10为本发明菌株phe11在不同接种量条件下菲的7天降解率对比图；
29.图11为本发明菌株phe11对不同多环芳烃的7天降解率对比图；
30.图12为表面活性剂海藻糖脂对本发明菌株phe11降解菲的影响结果图；
31.图13为重金属离子对本发明菌株phe11降解菲的影响结果图。
具体实施方式
32.以下结合实验实例对本发明进行详细地说明，应该说明的是，本发明的实施例仅限于对于本发明进行说明，而没有限制作用。
33.实施例中所涉及的有关筛选方法，缓冲液配置和常见培养基配方等可参考陈雯莉主编的《微生物学》第七版以及《分子克隆实验指南》描述的内容(参见j.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金东雁等(译)，科学出版社，北京)。
34.本发明中涉及的其他各种实验操作均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
35.实施例1
36.采用中国石化南湖大道加油站附近排水沟土壤为筛选土壤，具体筛选方案如下：
37.(1)取10g土壤，加入到100mg/l菲的100ml无机盐培养基(msm培养基)中，于28℃、180r/min的摇床中连续培养10天，再以5％的接种量接到上述新鲜的培养基中同等条件培养，连续转接6次至菌群功能稳定。
38.(2)由于pahs一般具有低水溶性的特点，基本难以与水相形成互溶的溶液，因而无法和传统的稀释涂平板的办法一样进行菲降解菌的分离纯化。故本实施例采用双层平板法进行菲降解菌的分离。具体如图1所示：首先制备2％琼脂浓度的固体msm培养基平板，然后在冷却的msm平板上加入适量的菲-丙酮溶液，让有机相能够均匀覆盖，待有机相挥发后，在平板上留有一层明显的白色的菲膜；再配制0.5％琼脂浓度的msm培养基，充分溶解后，待温度降低至40～50℃时，加入从步骤(1)中取的100μl富集菌群培养液，充分混匀后，小心倒入覆盖有菲膜的平板，加入量以刚刚覆盖平板表面并形成薄薄的一层软琼脂层为宜。
39.(3)小心盖上平皿盖子，正置恒温恒湿培养箱中培养1d后，倒置培养，每天观察一次直至有单菌落长出。然后挑取单菌落进一步接种在lb固体培养基上反复纯化直至平板上的菌落形态、大小、颜色不再发生变化且显微镜下观察到的细菌形态、大小前后一致。在纯化的过程中得到的不同菌株都要保存下来，在含有菲的固体培养基上利用点种法进行功能验证。
40.(4)将步骤(3)挑取且连续纯化的单菌落，接种到含200mg/l菲的250ml msm培养基中，于摇床中28℃、180r/min培养20天，获得本发明的菌株。
41.进一步对菌株进行形态学和分子生物学鉴定：
42.首先，对菌株的形态学特征进行了初步的观察，结果表明，该菌生物学特征为革兰氏阴性菌，在lb平板上菌落(图2中a)为圆形，边缘光滑圆润，菌落呈乳白色，质地湿润，菌株细胞长在0.8～2.5μm，宽在0.5μm左右，稍隆起(图2中b)。
43.同时，分离获得菌株的基因组dna，对菌株phe11的16s rdna基因片段的pcr扩增及种属分析。由于筛选菌株为细菌类，故以细菌16s rdna基因的通用引物27f和1492r引物对dna进行pcr扩增；将获得的pcr扩增产物进行测序，其测序序列如序列表seq id no:1所示。然后将所得序列在ncbi官网中进行blast分析，用mega.11.0软件，采用邻近-连接(neighbor-joining)构建进化树(如图3所示)，比较其同源序列。通过blast分析可知菌株与假单胞菌属同源性高达98％，结合革兰氏染色和形态学观察，将该菌株命名为pseudomonas sp.phe11。
44.实施例2
45.首先从-80℃超低温冰箱中取出实施例1获取的菌株，然后在超净工作台中lb平板上划线活化一天，挑选长出的湿润单菌落于pa瓶中100ml新鲜高温灭菌的lb液体培养基中培养(其对应的生长曲线见图4)，一天后取出培养液于离心机中4200
×
g离心6分钟，菌泥用无菌msm培养基清洗3次，最后用无菌msm培养基悬浮并调菌液的od
600
值为1。
46.然后按5％的接种量接种至25ml含有唯一碳源200mg/l的菲的msm培养基(设3个重复组，该培养基的配制方法为：在50ml锥形瓶中加入菲-丙酮：正己烷＝1：1标准溶液，静止十分钟待丙酮正己烷完全挥发，然后加入25ml的msm培养基)，盖上封口膜，于摇床中28℃、180r/min培养。每隔24小时测定od
600
值，并用丙酮：正己烷＝1：1作为萃取剂萃取锥形瓶中残余的菲。
47.使用gc-fid(气相色谱-火焰离子化检测器)，色谱柱为hp-5弹性石英毛细管色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)进行菲含量测定。测定程序为：起始柱温60℃保持两分钟，以15℃/min升至250℃，保持4min；进样量1μl；进样口温度250℃；采取不分流进样；fid检测器温度为300℃。
48.检测结果具体如图5所示。
49.实施例3～6
50.与实施例2不同的是，在这些实施例中的菲浓度分别如下表所示
[0051][0052]
在其他条件同等的情况下培养七天后，萃取培养体系中剩余的菲进行测定，结果如图6所示：该菌对浓度100mg/l以下的菲7天降解率在90％以上，当菲浓度为200、300mg/l时，7天降解率在50～70％之间，而当菲浓度高达500mg/l时7天降解率仍维持在60％以上，说明该菌株对不同浓度菲都表现出良好的降解能力。
[0053]
实施例7～9
[0054]
与实施例2不同的是，在这些实施例中的培养温度分别如下表所示：
[0055][0056]
在其他条件同等的情况下培养七天后，萃取培养体系中剩余的菲进行测定，结果如图7所示，在16～28℃范围内，菲的降解率处于一个较低水平，而当温度到达37℃，降解率升高接近80％，温度处于42℃菲降解维持在60％水平。这表明phe11菌株生长适应温度较广且相对更适合于高温条件下环境中菲的去除，这有利于我国一年四季尤其是在北方石油开
采地区开展菲污染土壤原位修复。
[0057]
实施例10～14
[0058]
与实施例2不同的是，在这些实施例中，均向msm培养基中加入nacl，并使nacl的浓度分别如下表所示：
[0059][0060]
在其他条件同等的情况下培养七天后，萃取培养体系中剩余的菲进行测定，结果如图8所示：当培养体系中nacl浓度小于3％时，降解率在60％左右；而当nacl浓度超过3％时，phe11对菲的7天降解率呈现梯度下降趋势；不过当nacl浓度达到9％时该菌仍维持对菲的7天降解率仍维持在30％左右，说明该菌对盐离子浓度敏感，但对盐离子耐受性很强。
[0061]
实施例15～19
[0062]
与实施例2不同的是，在这些实施例中，先对msm培养基的ph(实施例2为自然ph)进行调整后再接种，具体如下表所示：
[0063][0064]
在其他条件同等的情况下培养七天后，萃取培养体系中剩余的菲进行测定，具体如图9所示：ph值对于菌株phe11降解菲的影响不大，菌株phe11对菲的降解在五个ph值条件下七天降解率都维持在60％以上，不过在ph＝8时降解率较高。
[0065]
实施例20～23
[0066]
与实施例2不同的是，在这些实施例中，菌株的接种量具体见下表：
[0067][0068]
在其他条件同等的情况下培养七天后，萃取培养体系中剩余的菲进行测定，结果如图10所示：当phe11菌株的接种量在3％以下时，不同的接种量对降解率的影响差异不大，而当接种量超过3％相对降解率变化差异显著，尤其当接种量为6％时菲的降解率超过了80％。
[0069]
实施例24～27
[0070]
与实施例4不同的是，在这些实施例中，msm培养基中添加的是其他多环芳烃(除了苯并芘含量为50mg/l，其他均为100mg/l)，具体见下表所示：
[0071][0072]
在其他条件同等的情况下培养七天后，萃取培养体系中剩余的相应多环芳烃进行测定，结果如图11所示：在相同培养条件下phe11对芴的降解率达到80％以上，而对于菲则完全降解达到100％，对于高环多环芳烃芘、荧蒽和苯并菲的降解效果也不错，七天降解率分别达到了50％、15％、10％。这也进一步说明了随着多环芳烃的苯环数量增加，其对生物毒性越大，生物的利用率低，降解过程越复杂，相应的降解周期也会增长。
[0073]
总体来说菌株phe11对于多种多环芳烃具有良好的降解能力，尤其对于低环多环芳烃的降解率超过了90％，而且对于四环及四环以上的多环芳烃降解效果也相当显著，这
有利于该菌实际运用于多种多环芳烃共存的复合污染区。
[0074]
实施例28
[0075]
与实施例4不同的是，本实施例的msm培养基中添加有海藻糖脂，设有两组，海藻糖脂的浓度分别为20mg/l、100mg/l。
[0076]
培养三天后分别取出两种浓度各一批测定菲的降解率，7天后取出剩下一批测定降解率，结果如图12所示：当海藻糖脂在低浓度20mg/l情况下，海藻糖脂的存在对菲的降解几乎没有什么影响；当海藻糖脂在高浓度100mg/l情况下，在培养前期对该菌株降解菲存在一定的抑制作用，而在培养中后期能很好地促进该菌株降解菲，降解效率提高了降解20％。
[0077]
即低浓度海藻糖脂对该菌株降解菲无明显影响，高浓度海藻糖脂能有效提高该菌株对菲的降解率。
[0078]
实施例29
[0079]
从-80℃超低温冰箱中取出保藏的菌株，接种至lb固体培养基中活化过夜；挑出单菌落接种至10毫升lb液体培养基中培养至od
600
＝1。在48孔板中分别配置含有20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、500mg/l五个浓度梯度的八种重金属离子溶液(配置液为：10*103的重金属离子母液和lb液体培养基)。然后将培养至od
600
＝1的phe11菌液按照5％的接种量接入该重金属溶液中，置于28℃，180r/min摇床中培养，每隔12h观察一次并记录其生长状况。
[0080]
结果如图13和下表所示：菌株phe11对cd
2
、pb
2
、zn
2
和mn
2
均具有很好的耐受性，对cu
2
、fe
3
也有较大的耐受性，而对cro
42-、co
2
等离子耐受性较低，这可能与不同重金属对phe11代谢菲相关酶系作用机制不同有关。
[0081][0082][0083]
注： 能生长；-不能生长
[0084]
上述结果表明该菌株具有广泛的抗重金属能力，有利于该菌定值于多环芳烃、重金属复合污染的土壤或水体。
[0085]
本发明所列举的各参数的上下限、区间取值都能实现很好的降解效果，在此不一一列举实施例。
[0086]
综上所述，本发明提供的菌株phe11对芘、苯并芘、菲、芴和荧蒽等有机污染物具有高效快速的降解能力，还具有广泛的盐度、ph值、温度适应力和重金属耐受力，是对受多环芳烃类有机污染物的土壤或水体进行生物修复的优秀微生物材料。
[0087]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0088][0089]