两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途及试剂盒

1.本发明属于生物技术领域，更具体涉及水产养殖中华绒螯蟹(eriocheir sinensis)“水瘪子”病诊断中的应用，具体为通过定量pcr技术测得肝胰腺中的细胞色素cyp2(cytochrome p450 cyp2)编码基因表达量显著下降，而2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1(2-aminomuconic semialdehyde dehydrogenase-like isoform x1，asd-x1)编码基因表达量显著上调，这两种酶表达量的变化可以作为诊断中华绒螯蟹“水瘪子”病的指标。此外，还涉及一种据此设计的用于这种疾病诊断的试剂盒，可以为中华绒螯蟹“水瘪子”病的相关研究提供技术支持。


背景技术：

2.中华绒螯蟹(eriocheir sinensis)，简称河蟹，是一种经济蟹类，又称河蟹、毛蟹、清水蟹、大闸蟹，为中国久负盛名的美食。河蟹杂食性动物，鱼、虾、螺、蚌、蠕虫、蚯蚓、昆虫及其幼虫等均可作为大闸蟹的动物性饵料。随着河蟹养殖产业的发展，河蟹的各种病害陆续出现，危害也日趋严重，有病毒性疾病(如白斑综合症病毒引起的白斑病)、细菌性疾病(如螺原体引起的抖抖病)、寄生虫性疾病(如微孢子虫)等。当然，最近几年对河蟹养殖危害最大的是肝胰腺萎缩综合征，俗称“水瘪子”病。在江苏、浙江、湖北、安徽省等地的河蟹主养地区，其发病情况和流行范围呈扩大之势，发生率高、涉及范围，给河蟹养殖户带来巨大的经济损失，引发了业界强烈的反响。“水瘪子”病在河蟹养殖的全年均有发生，其具体症状为：外观发暗，外壳发软(手指轻捏即下陷)，大多空肠，肝胰腺萎缩、发白甚至糜烂，附肢空瘪，失去经济价值。肝胰腺萎缩的实质是腺管萎缩。
3."水瘪子"是已成为河蟹养殖中后期爆发的主要疾病之一，死亡率较高，即使不死亡也会大大降低商品蟹的规格，无膘无膏难以上市，造成了巨大的经济损失。以肝胰腺萎缩为特征的“水瘪子”病的发病原因至今还没有定论，也缺乏清晰的诊断方法。其症状一般表现为出现爬网、上草、上岸等现象，这些螃蟹基本空腹，或有肠炎，甲壳软，螯足和步足内因肌肉萎缩而显得空瘪，爬动缓慢，肝胰脏由黄白色或白色，吃料量下降，不脱壳或脱壳困难，捞出水后比健康蟹更容易死亡，严重的情况下病蟹步足薄而软，成灰黑色，鳃丝发黑且附着污物，后期肝胰脏萎缩甚至糜烂消失，腹腔积水严重并出现大量死亡。
4.虽然肝胰腺萎缩是河蟹“水瘪子”病的主要特征之一，但这种病灶以及所表现出的其它症状都不是“水瘪子”病所特有的，弧菌病、“抖抖病”以及营养不良都可能出现这种症状。这就产生了一个很严重的问题，那就是如何将这几种病与水瘪子病区别开来。虽然很多学者都在研究中华绒螯蟹“水瘪子”病，包括病因，诊断和治疗，但由于对“水瘪子”病缺乏一个确切的诊断标准，导致不同学者所研究的病例对象并不都是真正的“水瘪子”病，因为得出的结论各不相同，严重阻碍了对这种疾病发病原因的研究和防控技术的研究。就病因而言，不同学者得出的结论相差很大，有的认为是微孢子虫、有的认为是弧菌、有的认为是病毒，没有确切定论。也有学者认为是肝胆负担、饲料营养不均衡，环境胁迫、过量使用农药等引起。目前该病害病因和病原尚不明确，众说纷纭。常常有学者会把一些不是“水瘪子”病的
病症误认为是“水瘪子”病，并据此开展的病因学探查和防控技术研究，从而得出了不一样的结论。
5.因此，迫切需要一种能够很好地将“水瘪子”病与症状类似的非“水瘪子”病区分开来的诊断技术和相应的试剂盒，以便为学术界和动保企业开展河蟹“水瘪子”病的研究提供便利以及研究结果的统一。


技术实现要素：

6.为了解决上述存在的技术问题，本发明的目的是在于提供了一种两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的用途，与健康河蟹相比，肝胰腺萎缩的河蟹其肝胰腺中细胞色素p450的cyp2(cytochrome p450 cyp2)基因表达显著下降，而2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1(2-aminomuconic semialdehyde dehydrogenase-like isoform x1，asd-x1)编码基因表达显著上调，因此，这两个蛋白表达量的同时变化可作为中华绒螯蟹肝胰腺萎缩病的诊断指标。
7.本发明的另一个目的是在于提供了一种中华绒螯蟹“水瘪子”病的诊断试剂盒，不需要绘制标准曲线，只需要测定病蟹和健康蟹肝胰腺中目标基因的相对表达量即可，大大降低了工作量。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
9.本发明的技术构思是这样的：鉴于肝胰腺萎缩是“水瘪子”病的主要症状之一，从典型的发病池塘中采集具有典型症状的“水瘪子”病河蟹，采集其肝胰腺组织。同时，从未发病的池塘，选择健康的河蟹同步采集其肝胰腺。然后，冰冻保存带回实验室，进行蛋白质组学对比分析。以观察与健康的河蟹相比，“水瘪子”病蟹的肝胰腺在蛋白质组学层面发生了哪些显著的变化，以期从中找出“水瘪子”病的生物标记分子，用于疾病的诊断。这个研究我们重复了2次，每次采集并分析了病蟹和健康蟹各5只。进行比较分析，病蟹与健康蟹相比，有46个蛋白的表达量发生显著变化(p《0.05，或p《0.01)，其中下调的蛋白为36个，上调的蛋白为10个。从两次研究结果中，找出病蟹和健康蟹之间差异表达最显著和最恒定的指标，而且病蟹中上调和下调指标各一个，以这两个指标的组合作为“水瘪子”病的生物标记，并作为其诊断指标。在2次研究中病蟹肝胰腺中表达上调均最显著的蛋白是2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1(2-aminomuconic semialdehyde dehydrogenase-like isoform x1)，2次研究中表达下调均最显著的蛋白是细胞色素p450酶系cyp2(cytochrome p450 cyp2)。最后，用这两个指标对临床上的“水瘪子”病蟹进行验证，在“水瘪子”病病例中重现了2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1表达上调，细胞色素p450酶系cyp2表达显著下调的结果。而且，在弧菌感染和“抖抖”病蟹中，发现这两个指标要么未出现变化，要么变化的趋势与“抖抖”病的不一致。验证的结果非常理想，和预期的完全一致。
10.两种蛋白在中华绒螯蟹“水瘪子”病诊断中的用途，包括中华绒螯蟹“水瘪子”病的诊断指标：与健康中华绒螯蟹相比，病蟹肝胰腺中2-氨基粘液半醛脱氢酶-like异构体x1(2-aminomuconic semialdehyde dehydrogenase-like isoform x1，asd-x1)基因的表达上调幅度为1.8-2.8倍，同时细胞色素p450酶系cyp2(cytochrome p450 cyp2)的表达下调幅度为20.2-45.5％。
11.所述的asd-x1基因表达水平和p450酶系cyp2基因表达水平是指采用定量pcr技术
测得的mrna水平。
12.定量测定所述的2-氨基粘液半醛脱氢酶-like异构体x1基因表达水平的正向和反向序列分别为seq id no:1和seq id no:2所示。
13.定量测定所述的2-氨基粘液半醛脱氢酶-like异构体x1(asd-x1)基因表达水平的正向和反向引物是基于序列seq id no:3所对应的蛋白质序列来设计的。
14.一种诊断中华绒螯蟹“水瘪子”病的实时定量pcr(qr-pcr)试剂盒，该试剂盒的内容包括：sybr premix ex taq
tm ii，1对2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1扩增的正反向引物，1对细胞色素p450(cyp2)基因扩增的正反向引物，1对内参β-actin基因的正反向引物(10μm)和双蒸水ddh2o。
15.其中，所述的sybr premix ex taq
tm ii，含有real time pcr反应的最适浓度green i，是一种2
×
浓度的premix type试剂；
16.2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1的扩增正向引物为es-cxe1-f：gttcagaagacttgcagcgt，反向引物为es-cxe1-r：ggaaaggtagtggaggctgt；
17.细胞色素p450基因的扩增正向引物为escyp-7：ccaagctggtggagacgattc，反向引物为escyp-8：agatcacgttgaccacggcc；
18.内标β-actin的扩增引物为actin-f：gcatccacgagaccacttaca/actin-r：ctcctgcttgctgatccacatc。
19.进一步的，优化后的反应体系及pcr循环参数如下：在总体积为25μl的反应液体中，含有2μl cdna模板，正反向引物(引物浓度为10μm/l)各0.5μl，12.5μl sybr premix ex taq
tm ii(2
×
)以及9.5μlddh2o。
20.反应条件如下：95℃变性30s；95℃5s,60℃30s,40个循环。
21.进一步的，使用本试剂盒之前，必须对样品采用常规方法进行河蟹肝胰腺组织mrna提取和反转录合成cdna，以作为本试剂盒的dna模板。
22.本发明具体的发明过程如下：选择3只“水瘪子”病蟹和3只健康蟹作为研究对象。这些样品的信息见表1。
23.表1用于建立诊断指标研究的样品信息
[0024][0025]
样品带回实验室后迅速采集各样品蟹的肝胰腺，保存于-80℃。将储存在-80℃的肝胰腺组织取出解冻后，于研钵中用液氮研磨，用trizol(invitrogen)试剂提取肝胰腺和肌肉组织中的总rna，用超微量紫外分光光度计进行rna纯度测定，并用无rnase活性的dnase去除基因组dna。逆转录酶(takara)将rna反转录成cdna，合成反应终体积为20μl，于-20℃保存备用。按照primescript tm 1st strand cdna synthesis kit反转录试剂盒说明书合成rt-qpcr cdna模板。real-time pcr反应采用荧光染料sybr green，在bio-rad荧光定量pcr仪上进行，以β-actin为内参基因。在总体积为25μl的反应液体中，含有2μl cdna模板，1μl正反向引物(引物浓度为10μm/l)(各0.5μl)，12.5μl sybr mix以及9.5μlddh2o。反应条件如下：95℃变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。溶解曲线显示分析结果均为特异性单峰，无引物二聚体等非特异性扩增产物，表明扩增的特异性好，产物为目的产物。为分析诊断蛋白基因在病蟹和健康蟹肝胰腺中的表达差异，以β-actin为内参基因进行校准，内参基因与两种诊断蛋白基因同时进行rt-pcr。每个rna样品做3个副孔，取平均循环阈值(ct值)。按照2
‑△△
ct
计算病蟹和健康蟹之间两种蛋白基因的表达水平差异。其中
△
ct＝ct
诊断蛋白基因-ct
内参基因
；
△△
ct＝病蟹组
△
ct-健康组
△
ct，表达水平比率以2-δδct
作为表达量的比值。得到的结果是经内参基因表达水平校准的病蟹样本中诊断蛋白基因相对于健康样本的增加或减少的倍数。用内参基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。每个螃蟹样品测3次，共9个数据。
[0026]
内标β-actin的扩增引物为actin-f：gcatccacgagaccacttaca/actin-r：ctcctgcttgctgatccacatc。
[0027]
细胞色素p450(cyp2)基因的扩增正向引物为escyp-7：ccaagctggtggagacgattc；反向引物为escyp-8：agatcacgttgaccacggcc。
[0028]
2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1的扩增正向引物为es-cxe1-f：gttcagaagacttgcagcgt，反向引物为es-cxe1-r：ggaaaggtagtggaggctgt。
[0029]
从结果图1中可以看出，细胞色素p450 cyp2和2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1在
病蟹中的表达变化趋势和蛋白质组学观察的结果是一致的。因此，这两种蛋白可以作为初步诊断肝胰腺萎缩或坏死的生物标记物。
[0030]
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0031]
1.对于河蟹“水瘪子”病现有的诊断依据主要是依靠症状和发病特点。如果发生河蟹规模性死亡并伴有肝胰腺萎缩，附肢空瘪等典型症状，那基本上可以肯定就是“水瘪子”病。但是，这种大规模发病死亡情况并不是很常见，对于更常见、更普遍的散发性病例，加上症状不典型，其诊断就会出现困惑。这种情况下，无论是对于河蟹“水瘪子”病的病原病因分析研究，防控技术研究还是其它相关的科学研究，都将存在不确定性。本发明提供的诊断指标可以很好地解决这个问题，为“水瘪子”病的相关科学研究提供可靠的病例保障，而不会被相似但不是“水瘪子”病的病例所干扰。
[0032]
2.本发明采用两种指标的诊断方案，提高了诊断结论的可靠性。
[0033]
3.本发明的诊断指标不需要绘制标准曲线，只需要测定病蟹和健康蟹肝胰腺中目标基因的相对表达量即可，大大降低了工作量。
附图说明
[0034]
图1为两种酶蛋白在“水瘪子”病蟹肝胰腺中的表达变化图。
具体实施方式
[0035]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法的部分，通常按照常规方法进行，主要参考技术文献为由萨姆布鲁克等主编科学出版社2017年出版的分子克隆实验指南(第四版)。本发明需要的商品化试剂盒，按其附带的使用说明进行操作。所有涉及mrna提取，cdna合成和定量pcr反应体系配置的操作步骤，均须采用无菌操作技术。
[0036]
本发明说明书中的河蟹肝胰腺组织mrna提取试剂盒不仅限于takara公司的产品，cdna合成试剂盒不仅限于美国赛默飞(thermo fisher scientific)公司的产品，任何符合要求的其他公司的同类试剂盒均可使用。
[0037]
实时定量qpcr反应体系除了可以使用本发明的试剂盒所提供的premix ex taq
tm ii(2
×
)之外，也可以选用商品化的同类产品，只需在premix中加入规定量的cdna模板和相应的引物对即可进行pcr扩增。
[0038]
实施例1：
[0039]
一种诊断河蟹“水瘪子”病的试剂盒，该试剂盒含有：
[0040]
1)1份河蟹肝胰腺组织dna提取操作指南
[0041]
2)sybr premix ex taq
tm ii(2
×
)：含有real time pcr反应的最适浓度green i，是一种2
×
浓度的premix type试剂，其中的tli rnaseh(耐热性rnaseh)在以cdna作为模板进行pcr反应时可以最大限度抑制由于cdna中残存mrna对pcr反应造成的阻害作用；1份操作指南及注意事项。
[0042]
3)3对扩增引物：1对河蟹β-actin基因扩增引物；1对2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1扩增引物；1对细胞色素p450(cyp2)基因扩增引物。这三对引物的序列分别为：
[0043]
内标β-actin的扩增引物为actin-f：gcatccacgagaccacttaca/actin-r：ctcctgcttgctgatccacatc。
[0044]
细胞色素p450(cyp2)基因的扩增正向引物为escyp-7：ccaagctggtggagacgattc；反向引物为escyp-8：agatcacgttgaccacggcc。
[0045]
2-氨基粘液半醛脱氢酶异构体x1的扩增正向引物为es-cxe1-f:gttcagaagacttgcagcgt，反向引物为es-cxe1-r：ggaaaggtagtggaggctgt。
[0046]
4)标准阳性dna模板：河蟹肝胰腺组织的dna(50ng/μl)；
[0047]
5)标准阴性dna模板；草鱼肝脏组织的dna(50ng/μl)；
[0048]
6)灭菌rnaase free双蒸水。
[0049]
具体操作过程如下：
[0050]
1)采用常规的商品试剂盒，提取河蟹肝胰腺组织mrna并合成cdna，按说明书要求操作。
[0051]
取0.1g中华绒螯蟹肝胰腺组织置于液氮中充分研磨，参照trizol reag操作说明进行总rna提取，然后进行rnase-free dnase处理，以消除基因dna的影响。经1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性、纯度和浓度后，应用revert aid cdna第一条链合成试剂盒(美国thermo公司)合成cdna的第一条链。也就是以rna为模板反转录合成cdna第一链，再以cdna为模板进行实时荧光定量pcr检测。
[0052]
2)实时荧光定量pcr反应体系：按下列成分加入
[0053][0054][0055]
加样完成后，上下颠倒混匀试剂，然后用离心机轻微离心收集后使用。避免用振荡器混匀，剧烈振荡会降低制品性能。操作应在冰上进行。将配制好的pcr反应用混合液，分装至pcr反应管中。添加pcr扩增用模板。使用real-time pcr扩增仪，进行pcr扩增反应。
[0056]
pcr扩增标准程序：预变性95℃30秒；pcr反应：35个循环，95℃5秒,60℃30秒；融解曲线分析：95℃0秒
×
20℃/秒，65℃15秒
×
20℃/秒，95℃0秒
×
0.1℃/秒。
[0057]
3)按照2
‑△△
ct
计算病蟹和健康蟹之间两种蛋白基因的表达水平差异。其中
△
ct＝ct
诊断蛋白基因-ct
内参基因
；
△△
ct＝病蟹组
△
ct-健康组
△
ct，表达水平比率以2-δδct
作为表达量的比值。得到的结果是经内参基因表达水平校准的病蟹样本中诊断蛋白基因相对于健康样本的增加或减少的倍数。用内参基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。每个螃蟹样品测3次，共9个数据。
[0058]
与健康中华绒螯蟹相比，如果样品蟹肝胰腺中2-氨基粘液半醛脱氢酶-like异构体x1基因的表达上调幅度为1.8-2.8倍以上，同时细胞色素p450酶系cyp2的表达下调幅度为20.2-45.5％以上，同时阳性对照有扩增信号，阴性对照无扩增信号，即可判定为“水瘪子”病。
[0059]
实施例2：
[0060]
本发明完成之后，在河蟹养殖实践中进行了验证。从不同养殖场选取11只不同病症的河蟹，检查其病症表现，并据此作出初步诊断。同时选择3只健康的河蟹作为对照，应用本发明建立的技术测定了所有14只河蟹肝胰腺中两种蛋白酶编码基因的表达水平。结果如下表2：
[0061]
表2本发明所建立的技术在水产临床上对发病河蟹进行验证的结果
[0062]
[0063][0064]
一种诊断中华绒螯蟹“水瘪子”病的指标在研究中华绒螯蟹“水瘪子”病的发病原因，或在治疗、预防中华绒螯蟹“水瘪子”病药物中的应用。其使用步骤是：
[0065]
1.样品蟹的采集：需要采集至少3只待测病蟹和至少3只健康河蟹，并尽快采集其肝胰腺样品，液氮速冻后于-80℃保存备用。
[0066]
2.总rna的提取与反转录
[0067]
将冰冻的中华绒螯蟹肝胰腺组织样品取出,参照rna提取试剂盒rnaiso
tm plus(takara)操作说明书提取总rna。使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测rna降解程度以及是否有污染检查；使用nanophotometer分光光度计检查rna纯度(od260/280比值)。
[0068]
将完整性及纯度高的rna按primescript,tmrtreagent kit with gdna eraser,perfect real time(宝生物工程(大连)有限公司)试剂盒说明进行反转录实验，将rna反转录成cdna，具体步骤如下：
[0069]
(1)去除基因组dna反应
[0070]
按以下成分于冰上配置反应混合液于0.5ml rnase free ep管中：
[0071][0072]
加好试剂的样品42℃反应2min
[0073]
(2)反转录反应合成cdna
[0074]
反应体系如下：
[0075][0076]
混匀后，37℃反应15min，85℃反应5s，反应结束后4℃保存。
[0077]
3.实时定量pcr反应
[0078]
a)以中华绒螯蟹β-actin基因为内参，每个河蟹样品设3个重复，利用abi 7500 real-time pcr仪器进行标准曲线的制作及不同基因的荧光定量。
[0079]
b)反应体系的建立
[0080]
[0081]
全部加完并轻度混匀后，闪离2s，使所有液体都集中于管底。
[0082]
c)反应程序：95℃30s；95℃5s,60.4℃34s,40个循环。