利巴韦林在制备抗蜱传脑炎病毒药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及利巴韦林在制备抗蜱传脑炎病毒药物中的应用。


背景技术：

2.利巴韦林(ribavirin)是一种人工合成的鸟苷核苷类似物，于1972年首次合成。1986年，利巴韦林首次获批，用于治疗呼吸道合胞病毒感染。研究表明利巴韦林对多种dna和rna病毒具有抗病毒活性，包括登革病毒、日本脑炎病毒、寨卡病毒、黄热病病毒等。利巴韦林已用于治疗呼吸道合胞病毒、拉沙病毒及丙型肝炎病毒感染。
3.利巴韦林的化学分子式为c8h
12
n4o5，化学结构式如下图：
[0004][0005]
蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，tbev)是造成人中枢神经系统病变的自然疫源性疾病蜱传脑炎的病原体。蜱传脑炎由蜱叮咬传播，致死率高达40％以上，主要流行于欧洲、亚洲的许多地区。蜱传脑炎呈高发病趋势，正逐渐成为全球性公共健康问题。目前尚无有效的抗病毒治疗药物。蜱传脑炎病毒为高致病性的第一类病原微生物，蜱传脑炎病毒的研究只能在生物安全三级实验室开展。研究人员致力于研发可有效抗蜱传脑炎病毒的药物。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供利巴韦林在制备抗蜱传脑炎病毒药物中的应用。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008]
本发明的第一个方面是提供利巴韦林在制备抗蜱传脑炎病毒药物中的应用。
[0009]
所述抗蜱传脑炎病毒药物是以利巴韦林为唯一的活性成份，或包含利巴韦林的药物组合物。
[0010]
所述包含利巴韦林的药物组合物是指利巴韦林与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
[0011]
所述抗蜱传脑炎病毒药物中利巴韦林的含量为0.1～99wt％；优选为0.5～90wt％。
[0012]
所述抗蜱传脑炎病毒药物是指预防或治疗蜱传脑炎病毒感染的药物。
[0013]
所述辅料为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、崩裂剂、香味剂、甜味剂中的至少一种。所述药学上允许的一种或多种辅料是指药学领域常规的药物辅料，其中，稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙或碳酸氢钠；也可以在药物组合物中加入其他辅助剂如香味剂和/或甜味剂。
[0014]
所述利巴韦林可以和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。
[0015]
所述药物制剂是胶囊剂、混悬剂、片剂、粉剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂中的至少一种。所述药物制剂可采用医学领域常规的方法，将利巴韦林作为全部或部分活性成分，与药剂学上的常规药用辅料制成各种药物制剂。当口服时，可将其制备成常规的固体制剂，如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将其制备成注射剂。
[0016]
所述药物制剂的给药方式为口服、注射。
[0017]
所述利巴韦林的化学结构式如下：
[0018][0019]
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
[0020]
本发明利用人肝癌细胞huh-7和人肺腺癌细胞a549，检测利巴韦林的抗蜱传脑炎病毒活性。实验结果证实，利巴韦林可有效抑制蜱传脑炎病毒感染靶细胞，对感染细胞具有明显的保护作用，显著抑制细胞内蜱传脑炎病毒的复制增殖，能够作为抗蜱传脑炎病毒药物，具有进一步的开发前景。
附图说明
[0021]
图1：利巴韦林对a549细胞存活率的影响；不同浓度的利巴韦林处理细胞48小时，mts法检测细胞存活率；0μg/ml为无利巴韦林处理的对照组；student’s t-test分析统计学差异，*p＜0.05。
[0022]
图2：利巴韦林对蜱传脑炎病毒感染a549细胞的保护作用；利巴韦林处理病毒感染的细胞48小时，显微镜下观察病毒致细胞病变效应；mock为不感染病毒的对照组，0μg/ml为蜱传脑炎病毒感染组，50μg/ml为50μg/ml利巴韦林处理的病毒感染组，显微镜倍数为100
×
。
[0023]
图3：利巴韦林抑制蜱传脑炎病毒感染a549细胞内病毒抗原的表达；不同浓度的利巴韦林与病毒处理细胞48小时，免疫荧光法检测病毒抗原的表达；0μg/ml为蜱传脑炎病毒感染组，pbs为药物溶剂对照组，显微镜倍数为100
×
。
[0024]
图4：利巴韦林降低蜱传脑炎病毒感染a549细胞内的病毒rna水平；不同浓度的利巴韦林与病毒处理细胞48小时，实时荧光定量pcr法检测细胞内的病毒rna水平；0μg/ml为
蜱传脑炎病毒感染组，pbs为药物溶剂对照组；student’s t-test分析统计学差异，**p＜0.005，****p＜0.001。
[0025]
图5：利巴韦林降低蜱传脑炎病毒感染a549细胞上清中的病毒滴度；不同浓度的利巴韦林与病毒处理细胞48小时，空斑实验检测细胞上清中的病毒滴度；0μg/ml为蜱传脑炎病毒感染组，pbs为药物溶剂对照组；student’s t-test分析统计学差异，***p＜0.002，****p＜0.001。
具体实施方式
[0026]
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0027]
本发明实施例所用的利巴韦林可以通过市售方式购买得到。
[0028]
实施例1
[0029]
一、实验材料
[0030]
1.药物库与利巴韦林：包括2580种美国食品药品监督管理局(food and drug administration，fda)认证药物的药物库为美国selleck chemicals公司产品，利巴韦林为美国emd millipore公司产品。
[0031]
2.蜱传脑炎病毒与病毒抗体：蜱传脑炎病毒与病毒免疫小鼠的腹水，由海军军医大学生物安全三级实验室保存。病毒感染实验在该实验室开展。病毒滴度以空斑形成单位(plaque forming unit，pfu/ml)表示。
[0032]
3.细胞：人肝癌细胞huh-7和人肺腺癌细胞a549购自中国科学院上海细胞所，由海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室保存。
[0033]
4.细胞培养试剂：含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％青霉素和链霉素的dmem完全培养基，0.05％胰酶-乙二胺四乙酸，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs)，均为美国gibco公司产品。
[0034]
5.牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)：美国affymetrix公司。
[0035]
6.alexa fluor 488标记山羊抗鼠igg、dapi封固剂：英国abcam公司产品。
[0036]
7.cell titeraqueous细胞增殖检测试剂盒(mts)：美国promega公司产品。
[0037]
8.羧甲基纤维素钠：美国sigma-aldrich公司。
[0038]
9.m-mlv逆转录酶、dntp mix、eastep qpcr master mix：美国promega公司。
[0039]
10.随机引物、蜱传脑炎病毒引物、甘油醛三磷酸脱氢酶(gapdh)内参引物：北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0040]
二、实验方法及结果
[0041]
(一)7种抗病毒药物的抗蜱传脑炎病毒活性
[0042]
生长状态佳的人肝癌细胞huh-7接种于96孔细胞培养板，37℃、5％co2培养箱培养12小时，细胞密度约为95％。根据药物库的使用说明，采用相应溶剂溶解药物，制备10mm药物储存液，dmem完全培养基稀释至药物使用浓度为40μm。本课题研究，蜱传脑炎病毒的感染复数(multiplicity of infection，moi)均采用0.1。蜱传脑炎病毒与稀释的药物在水平摇床快速混匀(1:1体积比)，加入含细胞的96孔培养板，药物终浓度为10μm。同时，设置病毒感
染对照组与药物溶剂对照组，药物组、对照组均为3孔/每组。培养24小时后通过检测蜱传脑炎病毒抗原的免疫荧光法评估药物对病毒的抑制活性，全自动细胞成像多功能微孔板检测系统扫描96孔细胞培养板，gen53.10软件进行图像采集与数据处理。计算药物对病毒的抑制率：病毒组感染率(每孔病毒感染细胞数/每孔细胞总数)-药物组感染率(每孔病毒感染细胞数/每孔细胞总数)。7种抗病毒药物对蜱传脑炎病毒的抑制率见表1。
[0043]
表1 7种抗病毒药物对蜱传脑炎病毒的抑制率
[0044][0045]
根据上述药物研究进展，结合药物在药物库中的作用描述，选择利巴韦林进行抗蜱传脑炎病毒的研究。
[0046]
(二)利巴韦林对a549细胞的毒性作用
[0047]
首先，检测利巴韦林对a549细胞的毒性作用，以确定抗蜱传脑炎病毒活性的药物浓度范围。a549细胞接种于96孔细胞培养板，培养至细胞密度约为100％。吸弃孔内培养液，加入dmem完全培养基稀释的不同浓度利巴韦林(药物组)，设置对照组(加入dmem完全培养基)与空白组(无细胞而仅有dmem完全培养基)，每组均设置3孔。培养48小时后，加入mts溶液，使用多功能酶标仪检测od
490
值。计算细胞存活率：od
药物组-od
空白组
/od
对照组-od
空白组
。如附图1所示，当利巴韦林浓度小于或等于200μg/ml时，其对a549细胞无明显毒性作用；当其浓度至300μg/ml时对细胞的毒性作用较强，与对照组的细胞存活率相比，300μg/ml利巴韦林处理组细胞活率的降低具有统计学差异(p＜0.05)。结果表明，利巴韦林在较大的浓度范围内对a549细胞无毒性作用。
[0048]
(三)利巴韦林对蜱传脑炎病毒感染a549细胞的保护作用
[0049]
基于上述利巴韦林对a549细胞毒性作用的检测结果，观察50μg/ml利巴韦林对蜱传脑炎病毒感染细胞的保护作用。a549细胞接种于12孔细胞培养板，培养至细胞密度约100％。吸弃孔内培养液，加入利巴韦林(终浓度50μg/ml)和病毒(moi＝0.1)，设置不感染病毒的细胞对照(mock组)、病毒感染对照(0μg/ml组)。培养48小时，显微镜下观察病毒致细胞病变效应。如附图2所示，与mock组细胞相比，病毒感染的a549细胞出现明显病变，表现为胞体皱缩、细胞间隙增大、细胞脱落。50μg/ml利巴韦林则对病毒感染的细胞具有保护作用，表现为上述病毒致细胞病变效应明显减弱，并且病变细胞数目减少。结果表明，利巴韦林对蜱传脑炎病毒感染的a549细胞具有保护作用。
[0050]
(四)利巴韦林抑制a549细胞中蜱传脑炎病毒抗原的表达
[0051]
在对蜱传脑炎病毒易感的人肺腺癌细胞a549，验证利巴韦林的抗病毒活性。a549细胞接种于96孔细胞培养板，培养至细胞密度约90％，蜱传脑炎病毒感染细胞(moi＝0.1)，
同时加入不同浓度的利巴韦林。设置病毒感染对照(0μg/ml组)、药物溶剂对照(pbs组)，每组设置3孔。培养48小时后，免疫荧光法检测病毒抗原的表达，经全自动细胞成像多功能微孔板检测系统扫描，采集图像。如附图3所示，利巴韦林在a549细胞表现较强的抗病毒活性，可抑制病毒抗原的表达(阳性信号-绿色荧光)，且呈浓度依赖性抑制。gen53.10软件进行数据处理与分析，发现60μg/ml利巴韦林的抑制率高达89％。利巴韦林处理后病毒感染细胞百分率见表2。采用graphpad prism 8.0软件，计算药物半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration，ic
50
)。在a549细胞利巴韦林ic
50
为35.57μg/ml。结果表明，利巴韦林抑制蜱传脑炎病毒感染a549细胞中病毒抗原的表达。
[0052]
表2利巴韦林处理a549细胞的蜱传脑炎病毒感染细胞百分率
[0053][0054]
(五)利巴韦林抑制a549细胞中蜱传脑炎病毒rna的合成
[0055]
接下来研究利巴韦林对蜱传脑炎病毒rna合成与病毒增殖的影响。a549细胞接种于12孔细胞培养板，培养至细胞密度约100％。吸弃孔内培养液，加入不同浓度利巴韦林和蜱传脑炎病毒(moi＝0.1)，设置病毒感染对照(0组)、药物溶剂对照(pbs组)，每组设置3孔。培养48小时，分别收集培养上清(用于空斑实验检测病毒滴度)和trizol细胞裂解物(用于实时荧光定量pcr检测病毒rna)。trizol抽提细胞总rna，用随机引物反转录为cdna。以gapdh基因为内参，采用实时荧光定量pcr法检测利巴韦林处理蜱传脑炎病毒感染细胞内的病毒rna水平。gapdh引物序列：正向引物5
′‑
tgggctacactgagcaccag-3
′
，反向引物5
′‑
aagtggtcgttgagggcaat-3
′
；蜱传脑炎病毒引物序列：正向引物5
′‑
tggayttyagacaggaaycaacaca-3
′
，反向引物5
′‑
tccagagactytgrtcdgtgtgga-3
′
。检测结果显示，在利巴韦林处理的a549细胞，病毒rna水平呈利巴韦林浓度依赖性降低。如附图4所示，与病毒感染组相比，10μg/ml利巴韦林即显著降低病毒rna水平(p＜0.005)，而20μg/ml、50μg/ml利巴韦林则呈现更强的抑制作用(p＜0.001)。pbs药物溶剂对照组的病毒rna水平与病毒感染组相比无明显差异。因此，利巴韦林显著降低蜱传脑炎病毒感染a549细胞内的病毒rna水平，抑制蜱传脑炎病毒的复制。
[0056]
(六)利巴韦林降低a549细胞上清中蜱传脑炎病毒的滴度
[0057]
使用上述收集的细胞培养上清，采用空斑实验检测利巴韦林处理蜱传脑炎病毒感染a549细胞上清中的病毒滴度。猪肾细胞pk-15接种于12孔细胞培养板，长至细胞单层，dmem完全培养基10倍梯度稀释收集的培养上清，加至细胞单层，每组设置3孔，37℃培养箱吸附3小时，加入2％羧甲基纤维素钠覆盖液培养6天，4％多聚甲醛固定，1％结晶紫染色，计数病毒空斑数目，确定病毒滴度。结果显示，在利巴韦林处理的a549细胞，病毒滴度呈利巴韦林浓度依赖性降低。如附图5所示，与病毒感染组相比，10μg/ml利巴韦林显著降低病毒滴度(p＜0.002)，20μg/ml、50μg/ml利巴韦林则呈现更强的抑制作用(p＜0.001)。pbs药物溶
剂对照组的病毒滴度与病毒感染组相比无明显差异。蜱传脑炎病毒产量的降低与利巴韦林浓度的关系见表3。因此，利巴韦林可显著降低蜱传脑炎病毒感染a549细胞上清中的病毒滴度，抑制蜱传脑炎病毒的增殖。
[0058]
表3利巴韦林处理a549细胞上清中蜱传脑炎病毒滴度
[0059][0060]
上述体外实验结果表明，利巴韦林具有显著的抗蜱传脑炎病毒感染活性，可用于制备抗蜱传脑炎病毒的药物。
[0061]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
[0062]
[0063]