硫氮掺杂疏水性碳点用于β-胡萝卜素荧光探针检测方法

硫氮掺杂疏水性碳点用于
β-胡萝卜素荧光探针检测方法
技术领域
1.本发明属于化学分析检测技术领域，具体为一种硫氮掺杂疏水性碳点用于β-胡萝卜素荧光探针检测方法。


背景技术：

2.β-胡萝卜素是一种重要的营养性添加剂和天然色素，不仅具有维生素 a 的生物活性，药用和营养价值很高，对婴幼儿的生长和视觉发育起重要作用，有提高机体免疫力、预防心血管疾病、防癌抗癌等功能。由于人体自身不能合成β-胡萝卜素，其每日所获得的β-胡萝卜素均来自饮食摄入，也可通过添加于食品中获取。目前，β-胡萝卜素的测定方法有高效液相色谱法、光度法、液相色谱-质谱联用法等。
3.碳点是一类粒径小于10nm的新型碳材料，因其制备容易、成本低、光致发光(pl)、生物相容性好、耐盐和光辐照引起的猝灭等优点而备受关注。碳点的形成经过氧化、聚合、碳化、钝化等过程，它们表面具有丰富的官能团，取决于前驱体、合成方法和实验条件，可以对目标物质进行选择性识别，用于荧光探针检测。目前所报道的碳点基本是水溶性的，所以目标分子也基本是水溶性的，疏水性碳点主要集中在对光学性能及抗菌性能研究，用于荧光探针检测的基本未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种硫氮掺杂疏水性碳点用于β-胡萝卜素荧光探针检测方法；本发明以柠檬酸、5,5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）、三聚氰胺为前驱，采用热解法制备了高荧光产率的硫氮掺杂疏水性碳点（h-s,n/cds），基于内滤效应，β-胡萝卜素选择性使h-s,n/cds荧光猝灭，其荧光猝灭强度与β-胡萝卜素呈线性关系，由此建立β-胡萝卜素荧光检测新方法，本发明方法具有特异性强，可能共存的其他类胡萝卜素、维生素a及维生素e等都不产生干扰，同时具有检测灵敏度高、操作简单、快速等特点；将本发明建立的方法与gb 5009.83-2016 食品安全国家标准食品中胡萝卜素的测定方法比对，结果一致，方法具有准确性。
5.本发明利用探针快速检测β-胡萝卜素的方法如下：（1）β-胡萝卜素工作曲线制作在10ml具塞比色管中加入β-胡萝卜素标准溶液、浓度1mg/ml的硫氮掺杂疏水性碳点（h-s,n/cds）50~100
µ
l，用ph5.0的柠檬酸-无水乙醇溶液稀释至5ml，摇匀，其中β-胡萝卜素在具塞比色管中浓度在0.01~10
µ
g/g范围，静置5~10min，在350nm激发波长下，在405nm发射波长处测定荧光强度，以β-胡萝卜素浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；（2）样品处理 螺旋藻片：取螺旋藻片样品，研细，准确称取试样0.20~0.30g于25ml带塞量筒中，用石油醚-丙酮混合液超声30min，静置10~20min后，吸取上层液体，然后残渣再用石油
醚-丙酮混合液超声提取2次，收集合并上层液体并旋转蒸发至干，将干燥残渣用二氯甲烷溶解，转移至棕色容量瓶中并定容至25ml，制得样品测定液；所述旋转蒸发温度为40℃
±
2℃，石油醚-丙酮混合液是体积百分比80%的石油醚和体积百分20%的丙酮混合制得；
②ꢀ
复合预混合饲料样品：将1.00~2.00g 复合预混合饲料添加至装有1g edta（乙二胺四乙酸）的三角瓶中然后加入浓度1m的l-抗坏血酸乙醇溶液50ml、1m的氢氧化钾溶液10ml，在45~55℃下水浴超声20min，将该溶液转移至盛有石油醚的分液漏斗中，用水洗三角瓶，洗液并入分液漏斗，萃取后水相转移至另一分液漏斗中，用石油醚重复提取两次，收集合并石油醚相旋转蒸发至干，固体用二氯甲烷溶解，转移至棕色容量瓶并定容至25ml，制得样品测定液；所述旋转蒸发温度为40℃
±
2℃； 蔬菜样品：准确称取蔬菜1.00~2.00g，切碎并置于研钵内充分研磨10min，加入无水乙醇后移至圆底烧瓶内，在50~60℃水浴锅中恒温浸提180min，提取结束后将上清液滤出，滤渣离心处理，并再次取上清液，合并上清液，旋转蒸发至干，转移到棕色容量瓶中并用无水乙醇定容至25ml，制得样品测定液；所述旋转蒸发温度为40℃
±
2℃，离心是在1000~3000 r/min下处理5~10min；（3）样品测定：取步骤（2）制备的样品测定液2~3ml，加入硫氮掺杂疏水性碳点（h-s,n/cds）50~100
µ
l，用ph5.0的柠檬酸-无水乙醇溶液稀释至5ml，摇匀，静置5~10min，在350nm激发波长下，在405nm发射波长处测定荧光强度，代入步骤（1）回归方程，计算样品β-胡萝卜素含量。
6.所述硫氮掺杂疏水性碳点是将5,5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）0.5~0.7g、三聚氰胺0.2~0.5g、柠檬酸0.1~0.3g溶解于50~80ml冰乙酸中，超声处理20~30min，转移至聚四氟乙烯反应釜，在200~220℃下加热8~10h，自然冷却后，将反应液倒入1~1.5l的沸水中，搅拌30~40min，抽滤，固体真空干燥即得硫氮掺杂疏水性碳点。
7.所述真空干燥在40~50℃干燥24h。
8.本发明的优点在于：1、本发明利用水热法合成荧光产率高的疏水性硫氮掺杂碳点，基于β-胡萝卜素选择性使疏水性硫氮掺杂碳点荧光猝灭，建立高灵敏、选择性强β-胡萝卜素荧光检测新方法；2、本发明制备的疏水性硫氮掺杂碳点与β-胡萝卜素有相当好的相溶性，可能共存的其他类胡萝卜素、维生素a及e等都不产生干扰，本发明方法具有选择性强、操作简单、快速、灵敏等特点；3、将建立的方法用于实际样品测定时，通过与gb 5009.83-2016 食品安全国家标准食品中胡萝卜素的测定方法比对，结果一致，方法具有准确性。
附图说明
9.图1为实施例1中β-胡萝卜素对h-s,n/cds的荧光猝灭荧光光谱图；图2为实施例1中β-胡萝卜素对h-s,n/cds的荧光猝灭线性方程图；图3为共存物质（蕃茄红素、叶黄素、玉米黄质、维生素a、维生素e、藻青素等）对β-胡萝卜素的影响结果，其中black为不添加物质。
具体实施方式
10.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
11.实施例1：螺旋藻片中β-胡萝卜素的测定1、硫氮掺杂疏水性碳点制备：称取5,5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）0.5g、三聚氰胺0.2g、柠檬酸0.1g溶解于50ml冰乙酸，超声处理25min，转移至聚四氟乙烯反应釜，于200℃加热10h，自然冷却后，将反应液倒入1l的沸水中，搅拌30min，抽滤，得到的固体在40℃下真空干燥24h，得硫氮掺杂疏水性碳点；2、β-胡萝卜素工作曲线制作：在10ml具塞比色管中加入β-胡萝卜素标准溶液、浓度为1mg/ml的硫氮掺杂疏水性碳点（h-s,n/cds）100
µ
l，用ph5.0的柠檬酸-无水乙醇溶液稀释至5ml，摇匀，其中β-胡萝卜素在具塞比色管中浓度在0.01~10
µ
g/g范围，静置10min，在350nm激发波长下，在405nm发射波长处测定荧光强度，以β-胡萝卜素浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1及图2，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1；表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围；3、方法特异性考察：将可能与β-胡萝卜素共存的物质（蕃茄红素、叶黄素、玉米黄质、维生素a、维生素e、藻青素等）分别替换β-胡萝卜素并加入到本实施例检测体系中，检测本发明方法体系的特异性，体系中β-胡萝卜素、共存物质浓度均为1μg/g，结果显示仅有β-胡萝卜素有明显的猝灭作用，虽然蕃茄红素也有一点作用，但在实际样本中，其浓度一般远低于β-胡萝卜素，其干扰可以忽略不计，方法具有好的选择特异性；4、螺旋藻片中β-胡萝卜素的测定（1）样品处理：取20片样品，研细，准确称取试样0.20g于25ml带塞量筒中，加入石油醚-丙酮混合液（体积百分比80%的石油醚和体积百分20%的丙酮混合）10ml，超声提取30min，静置10-20min，吸取上层黄色液体，然后残渣再用石油醚-丙酮混合液超声提取2次，收集合并上层液体并转入旋转蒸发仪，于旋转蒸发仪上40℃蒸发至干，干燥的提取液用二氯甲烷溶解，转移到棕色容量瓶中并定容至25 ml，制得样品测定液；（2）样品测定：取步骤（1）样品测定液2ml，加入1mg/ml硫氮掺杂疏水性碳点（h-s,n/cds）100
µ
l，用ph5.0的柠檬酸-无水乙醇溶液稀释至5ml，摇匀，静置10min，在350nm激发波长下，在405nm发射波长处测定荧光强度，代入步骤2回归方程，计算样品β-胡萝卜素含量为402.4 mg/kg；（3）回收率与精密度实验：在螺旋藻片样品中分别添加3个不同浓度的β-胡萝卜素标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差rsd，结果见表2；测得β-胡萝卜素的加标回收率在96.7％～98.3％，rsd在2.56％～3.15％，本方法有好的的准确性和精密度；表2 样品加标回收率及rsd（n = 3）
。
12.实施例2：复合预混合饲料样品中β-胡萝卜素的测定1、硫氮掺杂疏水性碳点制备：称取5,5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）0.7g、三聚氰胺0.5g、柠檬酸0.3g溶解于80ml冰乙酸，超声处理30min，转移至聚四氟乙烯反应釜，于220℃加热8h，自然冷却后，将反应液倒入1.5l的沸水中，搅拌40min，抽滤，得到的固体经真空干燥，得硫氮掺杂疏水性碳点；2、β-胡萝卜素工作曲线制作：同实施例1；3、复合预混合饲料样品中β-胡萝卜素的测定（1）样品处理：称取 2.00g 复合预混合饲料于装有1g edta 的三角瓶中，然后加入浓度1m l-抗坏血酸乙醇溶液50ml、1m氢氧化钾溶液10ml，混匀后在50℃水浴超声20min；将该溶液转移至盛有80ml石油醚的分液漏斗中，用水洗三角瓶，洗液并入分液漏斗中，萃取后水相转移至另一分液漏斗中，用50ml石油醚重复提取两次，收集合并石油醚相于旋转蒸发仪上40℃蒸发至干，将提取液残渣用二氯甲烷溶解，转移到棕色容量瓶并定容至25ml，制得样品测定液；（2）样品测定：取步骤（1）1样品测定液3ml，加入1mg/ml硫氮掺杂疏水性碳点100
µ
l，用ph5.0的柠檬酸-无水乙醇溶液稀释至5ml，摇匀，静置8min，在350nm激发波长下，在405nm发射波长处测定荧光强度，代入步骤2回归方程，计算样品β-胡萝卜素含量，样品β-胡萝卜素含量为未检出。
13.实施例3：胡萝卜中β-胡萝卜素的测定1、硫氮掺杂疏水性碳点制备：硫氮掺杂疏水性碳点是将5,5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）0.6g、三聚氰胺0.3g、柠檬酸0.2g溶解于70ml冰乙酸中，超声处理20min，转移至聚四氟乙烯反应釜，在210℃下加热9h，自然冷却后，将反应液倒入1.2l的沸水中，搅拌35min，抽滤，固体真空干燥即得硫氮掺杂疏水性碳点；2、β-胡萝卜素工作曲线制作：同实施例1。同实施例1。
14.3、胡萝卜中β-胡萝卜素的测定（1）样品处理：准确称取胡萝卜1.00g，切碎并置于研钵内充分研磨10min，加入60ml无水乙醇后移至圆底烧瓶内，在55℃水浴锅中恒温浸提180min，提取结束后将上清液滤出，滤渣在1000r/min下离心处理10min，并再次取上清液；将所得上清液合并，于旋转蒸发仪上42℃蒸发至干，转移到棕色容量瓶中并用无水乙醇定容至25ml，制得样品测定液；（2）样品测定：同实施例1，样品β-胡萝卜素含量为48.6 mg/kg。
15.实施例4：南瓜样品β-胡萝卜素的测定1、硫氮掺杂疏水性碳点制备：同实施例1。
16.2、β-胡萝卜素工作曲线制作：同实施例1。同实施例1。
17.3、南瓜中β-胡萝卜素的测定
（1）样品处理：准确称取南瓜2.00g，切碎并置于研钵内充分研磨10min，加入60ml无水乙醇后移至圆底烧瓶内，在55℃水浴锅中恒温浸提180min，提取结束后将上清液滤出，滤渣在2000r/min下离心处理7min，并再次取上清液；将所得上清液合并，于旋转蒸发仪上42℃蒸发至干，转移到棕色容量瓶中并用无水乙醇定容至25ml，制得样品测定液；（2）样品测定：同实施例1，样品β-胡萝卜素含量为21.1 mg/kg。
18.将实施例1-4方法与国家标准gb 5009.83-2016 食品安全国家标准食品中胡萝卜素的测定方法进行比对，结果见表3，从结果可以看出，两种方法结果一致；表3 对比实验结果（mg/kg）本发明建立的β-胡萝卜素荧光探针测定法具有特异性强，所用时间短，操作简便，灵敏度高等优点，在实际检测中具有较强优势。