一种基于太赫兹技术检测活细胞样品的方法与流程

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种基于太赫兹技术检测活细胞样品的方法。


背景技术：

2.细胞的折射率是直接反映细胞特性的重要参数，它与细胞内部的物质组成和分布密切相关。细胞折射率已被用于监测细胞的增殖、分化、病变等生理过程，在生物医学领域得到了广泛应用。随着先进光学技术的快速发展，折射率的测量已经可以拓展至更广的频率范围。高灵敏度的太赫兹时域光谱系统(thz-tds)已经被用于获取物质在太赫兹频段(频率范围0.3～10thz)的折射率。这一频段的电磁波具有适于一系列有利于活细胞表征的独特性质：可以灵敏的获取细胞内生物分子的水合信息，从而根据细胞的水合状态判断细胞的活性和功能；同时具有较低的光子能量，不易引起破坏生物样品的电离作用，保证了检测的生物安全性。基于thz-tds对活细胞折射率、介电常数等性质的测量，有望成为一种快速、实时、无标记和非侵入的细胞检测手段，在基础科学和临床检测中有巨大的潜在应用价值。
3.然而，太赫兹波对水的吸收敏感性使活细胞样品的太赫兹光谱测量面临技术上的挑战。活细胞必须生活在水环境中，而溶剂水在检测中产生了极大的背景信号，溶剂的折射率降低了检测的信噪比。如何有效降低背景吸收，提高折射率测量的信噪比是细胞太赫兹检测的主要问题。根据现有的文献研究，为提高细胞太赫兹光谱测量的信噪比，主要采取以下两种技术手段：
4.(1)直接去除培养液：用滤纸吸取、静置干燥等手段去除贴壁培养细胞上部的多余培养液；
5.(2)采用反射式探测模式：使用反射式thz-tds技术，只获取反射棱镜表面单层细胞的光学参数。
6.上述技术手段中，直接去除培养液会损伤甚至杀死细胞，而进行反射式探测需要预先在反射棱镜表面进行长时间(通常为48小时)的细胞培养以获取单层细胞，极大降低了检测效率。此外，单层细胞的不均匀性也使上述策略容易受到人为因素的干扰。因此，上述技术手段不足以完全解决细胞太赫兹光谱测量的低信噪比问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于太赫兹技术检测活细胞样品的方法，以解决现有技术中太赫兹细胞检测中由于水介质的强吸收造成的灵敏性差、信噪比低等问题。本发明用油包水微液滴负载活细胞，用太赫兹波段透过性好的连续相试剂取代细胞周围的水介质，以提高细胞与周围介质的光谱对比度，实现高灵敏度的细胞太赫兹光谱测量。
8.本发明的目的及其技术问题的解决，可以采用以下技术方案来实现。
9.本发明提供了一种基于太赫兹技术检测活细胞样品的方法，包括以下步骤：
10.步骤1，将待测细胞样品制成细胞微液滴样品，所述细胞微液滴样品为具有反向结
构的乳液，由太赫兹波段透过性好的连续相、含细胞的分散相和生物相容性好的表面活性剂组成；
11.步骤2，提供太赫兹时域光谱装置，装置上设有可容纳步骤1中的微液滴样品进行太赫兹检测的容器；
12.步骤3，将步骤1中的微液滴样品加入步骤2中的容器中，使用太赫兹时域光谱装置获得待测细胞样品在太赫兹波段的光谱信息。
13.其中，步骤3中获得的太赫兹波段的光谱信息反映了包括细胞水合状态等细胞内物质的信息，可以实现对细胞数目的定量以及对细胞活性和细胞分化等生理状态的表征；步骤3中获得的太赫兹波段的光谱信息包括细胞样品的吸收系数、折射率、介电常数。
14.细胞微液滴是负载有细胞的微米级尺寸的水滴，它被生物相容良好的表面活性剂以反向胶束形式包裹，分散在连续相(油相)试剂中，其样品结构为反向结构的乳液。液滴外的油相试剂为非极性分子，通常在太赫兹波段具有良好的透过性；同时，液滴中只含少量的细胞外水，样品的主要信号衰减来源于细胞自身的水合水。这样，噪声信号被大大降低，细胞自身的光学性质得到最大程度的凸显；提高信噪比的同时，磷脂等表面活性剂构造的细胞微液滴可以确保细胞保持良好的生存状态，而微液滴形式的均匀乳液样品可以直接用于透射式thz-tds的快速检测，有效避免了当下技术手段中存在的常见问题，为解决细胞太赫兹光谱测量的低信噪比问题提供了新的思路。
15.作为本技术的优选技术方案，在步骤3中，还可以设有太赫兹超材料传感器，所述太赫兹超材料传感器由太赫兹超材料制成，所述微液滴样品与太赫兹超材料传感器构成待测总体。
16.太赫兹超材料为刻有亚太赫兹波长周期性结构、在太赫兹波段有滤波和谐振功能的材料，根据实际应用需求，太赫兹超材料可以放置在容纳所述微液滴样品并进行太赫兹检测的容器的内壁、中间、甚至是容器外部。
17.本发明利用太赫兹光谱装置，基于细胞微液滴，再结合太赫兹超材料，在接近生理状况下对活细胞的复折射率、介电常数等进行检测，以及超材料谐振峰的强度和峰位置变化等，并由此获得细胞的生物学信息。
18.将细胞微液滴技术与太赫兹超材料传感器结合，可以探测细胞折射率的微小变化，进一步提高了检测的灵敏度。
19.根据待测细胞样品的性质，可以选用不同类型的表面活性剂，如磷脂分子、脂肪酸甘油酯或多元醇等。
20.具体的，选用磷脂分子时，可选用一种或多种磷脂分子作为构成微液滴的表面活性剂。
21.具体的，表面活性剂可为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱、聚山梨酯或十二烷基苯磺酸钠等。
22.更具体的，如测试大肠杆菌(e.coli)、间充质干细胞、hela细胞时，选用1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱作为表面活性剂。
23.根据待测细胞样品的性质，用不同类型的缓冲液或培养基，配制不同类型、不同浓度、不同处理的细胞缓冲液构成微液滴的分散相；如测试大肠杆菌时，选用tbs缓冲液作为分散相；检测间充质干细胞、hela细胞时，选用dmem培养基作为分散相；检测病原体类型时，
以从病人身体或环境中采得的含致病菌的液体作为分散相。
24.根据所用表面活性剂的类型，可以选用不同类型的有机试剂作为连续相；如选用磷脂作为表面活性剂时，优选用十六烷作为连续相。
25.作为本技术的优选技术方案，步骤1中的细胞为原核细胞或真核细胞。
26.其中，原核细胞为杆菌，优选大肠杆菌(e.coli)；真核细胞为干细胞或肿瘤细胞；干细胞优选为间充质干细胞，肿瘤细胞优选为hela细胞。
27.作为本技术的优选技术方案，在步骤1中，细胞微液滴样品由为连续相、分散相和表面活性剂组成，其制备包括以下步骤：
28.1)将待测细胞样品制成细胞悬浮液，作为含细胞的分散相；
29.2)将表面活性剂溶解于连续相试剂中，获得含表面活性剂的连续相；
30.3)将分散相加入连续相中，通过使分散相在连续相中均匀分布的物理手段，生成含细胞的微液滴。
31.物理手段为搅拌摇匀或使用微流控芯片等，优选使用微流控芯片。
32.使用微流控芯片产生微液滴时，在流体汇聚结构处利用不混溶的分散相和连续相之间的剪切力和界面张力相互作用生成微液滴。
33.对于可承受一定程度机械操作的细胞样品，可以使用搅拌摇匀分散相连续相混合物的方式产生。
34.微液滴制备的传统方法是在混合水相、油相和表面活性剂后，对混合体系进行搅拌摇匀等机械操作。对于较为敏感的细胞样品，机械操作可能会对细胞造成损伤。通过结合微流控技术，即使用可以产生、输送细胞微液滴的微流控芯片，可以有效避免细胞损伤，并进一步实现制样和检测过程的全自动化。
35.根据待测细胞样品的性质，可以制备不同粒径大小的微液滴样品。
36.作为本技术的优选技术方案，步骤2中，太赫兹光谱装置能产生与探测的频率范围为0.3thz-10thz，即检测太赫兹波段的电磁波通过样品的吸收与色散。
37.作为本技术的优选技术方案，步骤2中，容纳微液滴样品的容器是在太赫兹波段具有透过性的可用于承载微液滴的样品池或样品腔。
38.作为本技术的优选技术方案，步骤2中，容器应由在太赫兹频段透过性良好且与样品各组分相容性好的材料制成，如石英。
39.作为本技术的优选技术方案，太赫兹超材料上的周期性结构为双条形、菱条形、缺口中间线形以及双开口环形等。
40.作为本技术的优选技术方案，在步骤3的待测总体中，微液滴样品处于太赫兹超材料传感器的周期性结构一侧。
41.作为本技术的优选技术方案，用于生成细胞微液滴的微流控芯片包括加入分散相、连续相的入口、形成微液滴的十字流体汇聚结构、用于太赫兹光谱检测的检测腔等结构，起制备、输送微液滴样品的功能和检测容器的功能。微液滴样品的液滴尺寸主要由所述十字流体汇聚结构的尺寸决定，通过增大或减小尺寸可以调节生成液滴的大小，从而适应不同类型的细胞。
42.根据本发明，由太赫兹超材料制成的太赫兹超材料传感器是一种在太赫兹波段具有特定谐振频率的超材料传感器，具有能在太赫兹波段产生滤波或谐振功能的周期性结
构，其性质取决于设计的人工结构而非构成太赫兹超材料传感器本身的材料的本征性质，其周期性结构单元的大小相当于工作波长的十分之一量级。周期性单元的性质和分布形式是多种多样的，通过改变结构可以在太赫兹波段实现单带、多带、宽带等不同的滤波功能。
43.应该理解的是，根据细胞样品的种类和其特异性太赫兹性质的频率范围，可选择不同的微流控芯片结构和不同的太赫兹超材料结构。比如，根据本发明的优选实施例，真核细胞和原核细胞可分别选择较大和较小的微流控芯片汇聚结构尺寸，以产生与细胞尺寸适宜的微液滴；菱条形、双条形超材料可分别在太赫兹波段提供一个和两个谐振峰，以适应不同的检测频率需求。太赫兹超材料结构的设计和选择应该充分考虑待测活细胞的太赫兹光学特征。
44.应该理解的是，为了确保微液滴样品的稳定性，可以根据细胞类型的不同，尤其是细胞表面电荷的不同，选择不同浓度和不同种类的表面活性剂，以保证液滴样品在检测过程中不发生变化，确保测量的准确性。
45.本发明首次创造性地引入细胞微液滴用于活细胞的太赫兹光谱探测，着重解决了细胞外基质中水造成的强背景吸收的问题。磷脂等生物相容性好的表面活性剂确保了细胞的良好活力。本发明通过结合微流控芯片实现了制样和检测过程的全自动和高通量，通过结合太赫兹超材料进一步提高了检测的灵敏性，进一步增加了实际应用价值。
46.如背景部分所述，细胞外的基质水产生的背景信号掩盖了样品中细胞在太赫兹频段的光学信息。本发明方法中，由于太赫兹透过性能良好的油相取代了大多数细胞外基质水，且表面活性剂如磷脂头部对剩余水的水合和约束效应进一步降低了其太赫兹吸收，细胞本身的太赫兹波段光学性质得到最大程度的凸显，信号干扰显著降低；同时，微液滴检测体系接近于生理环境，适用于多种类型细胞的检测，极大提高了细胞样品太赫兹检测的实用范围。
47.本发明与现有技术相比具有明显的有益效果。借由上述技术方案，本发明至少具有下列有益技术效果：
48.1)可以在避免损伤细胞的同时降低背景干扰，具有长时间实时的监测细胞的潜力；
49.2)所使用样品为均匀的细胞悬浮液，且允许的检测光程显著提高，具有更高的检测准确性；
50.3)通过结合微流控芯片实现自动制样和输送，有助于提高检测的效率，同时降低了人为操作因素造成的检测的不准确；
51.4)本方法可以用于各种类型的细胞的表征，具有更广泛的应用范围；
52.5)通过结合契合活细胞光学性质的太赫兹超材料传感器提高了检测的灵敏度，同时可以使用时域光谱、吸收系数、折射率、复介电常数、谐振峰高度和位置等光谱参数进行分析，具有更大的光谱信息量；
53.6)可以根据太赫兹光谱信息实现对细胞数量、种类、活性和生理状态等重要生物学信息灵敏监测的目的；
54.7)另外，理论上可以实现对药物针对细胞的效果和作用机理的测定，从而实现快速、高通量的药物先导化合物的初期筛选。
附图说明
55.图1是本发明实施例的微流控系统产生微液滴的示意图；
56.图2是本方法应用的一般细胞微液滴结构的示意图；
57.图3是根据本发明的实施例1探测大肠杆菌折射率的微液滴样品示意图；
58.图4是根据本发明实施例的产生细胞微液滴的微流控结构示意图；
59.图5是根据本发明实施例的太赫兹时域光谱装置示意图；
60.图6是根据本发明实施例1的双条形超材料传感器示意图；
61.图7是根据本发明的实施例1的结合超材料的石英样品检测腔设置图；
62.图8是根据本发明的实施例1探测水溶液形式的大肠杆菌样品的太赫兹透射光谱；
63.图9是根据本发明的实施例1探测微液滴形式的大肠杆菌样品的太赫兹透射光谱；
64.图10是根据本发明的实施例1探测微液滴形式大肠杆菌样品的太赫兹吸收系数与折射率光谱；
65.图11是根据本发明的实施例1未使用超材料和结合双条带形超材料探测指定浓度大肠杆菌微液滴的太赫兹吸收光谱对比；
66.图12是根据本发明的实施例2探测不同铜离子浓度处理的大肠杆菌样品的太赫兹吸收系数与折射率光谱；
67.图13是根据本发明实施例2的菱形超材料传感器示意图(左侧)，以及未使用超材料和结合该超材料探测指定浓度大肠杆菌微液滴的模拟太赫兹透射光谱对比(右侧)；
68.图14是根据本发明实施例2的长条形超材料传感器示意图(左侧)，以及未使用超材料和结合该超材料探测指定浓度大肠杆菌微液滴的模拟太赫兹透射光谱对比(右侧)；
69.图15是根据本发明的实施例3探测铜离子处理不同时间的大肠杆菌样品的太赫兹吸收系数与折射率光谱；
70.图16是根据本发明实施例3的双开口环形超材料传感器示意图(左侧)，以及未使用超材料和结合该超材料探测指定浓度大肠杆菌微液滴的模拟太赫兹透射光谱对比(右侧)；
71.图17是根据本发明实施例4探测诱导分化的间充质干细胞样品的太赫兹吸收系数与折射率光谱；
72.图18是根据本发明实施例4的缺口中间线形超材料传感器示意图(左侧)，以及未使用超材料和结合该超材料探测指定浓度大肠杆菌微液滴的模拟太赫兹透射光谱对比(右侧)；
73.图19是根据本发明实施例6，探测抗癌药物顺铂处理不同时间的hela细胞样品的太赫兹吸收系数和折射率光谱；
74.其中：
75.1-连续相；2-分散相；3-表面活性剂；4-1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱；5-三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tbs)；6-大肠杆菌；7-连续相入口；8-分散相入口；9-十字流体汇聚结构；10-管道结构；11-石英样品检测腔；12-超材料生物传感器；13-太赫兹检测光斑；14-可拆卸式边框；15-废液出口；16-飞秒激光器；17-分光片；18-泵浦光束；19-探测光束；20-发射器；21-时间延迟装置；22-接收器；23-锁相放大器；24-超材料生物传感器周期性结构单元；25-(水溶液形式)大肠杆菌细胞数量5.4
×
10
10
个；26-(水溶液形式)大肠杆
菌细胞数量7.2
×
10
10
个；27-(水溶液形式)大肠杆菌细胞数量9.0
×
10
10
个；28-(微液滴形式)大肠杆菌数细胞量5.4
×
10
10
个；29-(微液滴形式)大肠杆菌细胞数量7.2
×
10
10
个；30-(微液滴形式)大肠杆菌细胞数量9.0
×
10
10
个；31-未使用双条带形超材料；32-使用双条带形超材料；33-铜离子浓度0.1mm；34-铜离子浓度0.2mm；35-铜离子浓度0.4mm；36-未使用菱形超材料；37-使用菱形超材料；38-处理时间5分钟；39-处理时间10分钟；40-处理时间20分钟；41-未使用双开口环形超材料；42-使用双开口环形超材料；43-未经诱导分化的间充质干细胞；44-成骨诱导分化的间充质干细胞；45-未使用缺口中间线形超材料；46-使用缺口中间线形超材料；47-未经药物处理；48-处理时间12小时；49-处理时间24小时。
具体实施方式
76.下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
77.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
78.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
79.本发明提供了一种基于太赫兹技术检测活细胞样品的方法，包括：使用太赫兹时域光谱获得待测总体在太赫兹波段的光谱信息；探测中待测总体由进行太赫兹检测容器中的细胞微液滴样品和容器一侧内壁上的超材料生物传感器组成；所述细胞微液滴样品是反向胶束形式的微液滴，其中，连续相为油相，分散相为水相，磷脂分子为表面活性剂，细胞处于水相中；细胞样微液滴品由微流控芯片产生并输送于所述检测容器中。
80.本发明的方法流程如图1所示。首先，根据待测细胞的类型和尺寸设计并制备微液滴样品、产生微液滴样品的微流控芯片以及检测所需的超材料传感器结构。该方法中的微液滴样品，以如下步骤制备而成：将培养细胞置于适宜缓冲液或培养基中，形成已知浓度的细胞悬浮液，作为分散相；将溶于易挥发有机溶剂的磷脂用氮气吹干，真空干燥除去溶剂形成薄膜状磷脂，将薄膜状磷脂溶解于有机试剂中作为连续相；微液滴使用微流控芯片产生，其产生过程如图2所示，在汇集处利用不混溶的分散相和连续相之间的剪切力和界面张力相互作用生成微液滴。一般的微液滴形式如图3所示，包括连续相1，分散相2、表面活性剂3。该方法中超材料生物传感器根据所选细胞样品的种类和检测的目标频率设计定制，并紧贴检测容器内壁设置。所述细胞样品被加入检测容器，和所述超材料生物传感器组成待测总体。下一流程为通过太赫兹时域光谱设备获取待测总体的太赫兹波段的光学性质，该方法所使用的太赫兹时域光谱装置能产生和探测的频率范围为0.3thz-10thz，即太赫兹波段的电磁波通过样品产生的吸收与色散。太赫兹测试获得的光谱信息包括复折射率和复介电常数，反映的细胞的信息包括细胞内物质的水合信息和生物分子在太赫兹波段的低频振动信息。经过超材料传感器的信号放大进一步提高了检测信息的灵敏度。下一步流程为对获得
的细胞的太赫兹光谱信息进行分析，获得其揭示的细胞生理状态的信息。
81.实施例1结合双条形超材料传感器表征不同细胞数的大肠杆菌样品
82.根据本发明的方法将检测不同细胞数的大肠杆菌样品作为实施例1，其中本实施例测试样品如图4：大肠杆菌6分散于ph＝7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tbs)5中，构成分散相；表面活性剂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4。具体的，待测大肠杆菌细胞样品的制备方法如下：大肠杆菌6在l-b肉汤培养基、37℃和240rmp摇晃的情况下培育至稳定生长期，离心后使用tbs缓冲液5冲洗，然后根据od
600
值计数，配制至实验所需细菌数量构成分散相；将溶于三氯甲烷的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4用氮气吹干，抽真空除去溶剂形成薄膜状，将薄膜状磷脂溶于十六烷中，获得含表面活性剂的连续相。使用微流控芯片制成微液滴样品。
83.本实施例中所使用的微流控芯片如图5所示，使用十字流动汇集结构9产生微液滴并输送至检测容器中，具体过程如下：所述连续相和分散相分别于连续相入口7和分散相入口8输入所述芯片，于十字流体汇聚结构9处汇集并产生微液滴，此处通道尺寸为50μm；所述微液滴经由起稳定微液滴作用的管道结构10后输入石英样品检测腔11，其厚度为0.7mm，其中可设置双条形超材料12于一侧内壁上；太赫兹检测光斑13通过双条形超材料12区域，其尺寸(4mm)小于超材料尺寸(10mm)；可拆卸边框14用于更换使用超材料；系统多余废液经由废液出口15排出。
84.该微流控芯片的制作属于现有技术，此处仅作为举例而非限制地，提供制作方法如下：1)掩膜板的制作。使用ledit90制图软件绘制微通道的图案，并采用激光直写仪将图案光刻于铬板上，使用显影液与去铬液对铬板进行处理，去除参与液体后烘干制备好的铬板。2)基片清洗。通过脱脂、抛光、酸洗、水洗的方法清洗石英表面，然后将其放入到烘干机中烘烤，以利于光刻胶与基片表面产生良好的黏附效果。3)涂胶。采取旋转涂敷法在经过处理的基片表面均匀涂上适当厚度的光刻胶(az1505正性光刻胶)。4)前烘。在50℃以下使光刻胶中的溶剂挥发。5)曝光。将掩膜置于光源与光刻胶中间，用紫外光透过掩膜对光刻胶进行选择性照射。6)显影。用显影液去除应去除的部分光刻胶，获得与掩膜相同或相反的图形。7)坚膜。将基片放入到烘干机中烘烤以去除残留的溶剂和水分。8)腐蚀。以未去除光刻胶作为掩蔽层，采用氢氟酸/硝酸刻蚀剂，以湿法刻蚀方式剥离所需部分石英，以获得期望的图形。9)去胶。以氧气等离子体为去胶气体，将剩余光刻胶氧化为气体，用气泵抽出，除去剩余的光刻胶膜。10)打孔。在设计所需位置打孔，作为试剂进出口和蓄池。11)键合。将刻有微通道结构的基片和相同材质盖片清洗后贴合，在1000℃下进行热键合，冷却后得到所需微流控芯片。
85.在本实施例中，使用如图6的太赫兹时域光谱装置测试样品。飞秒激光器16产生的太赫兹脉冲用分光片17分为泵浦光束18和探测光束19，泵浦光束18的光路经过发射器20后通过上述石英样品检测腔11。探测光束19通过时间延迟装置21来调节泵浦脉冲和探测脉冲之间的时间延迟，信号由接收器22接收，通过锁相放大器23后测出信号的相位和幅值。最终可以探测出太赫兹脉冲的整个时域波形，通过傅立叶变换就可以得到被测样品的频域谱，从而获得其吸收系数和折射率、透射率等光学参数。
86.本实施例所用的双条形超材料生物传感器结构如图7所示。超材料传感器使用石英基底，其上刻制周期性整齐排列的双条形结构，长、短条带的长度分别为95μm、60μm，条带
间距为75μm，真空环境中当该超材料生物传感器于入射波垂直时在0.81和1.37thz处产生两个谐振峰。
87.该双条形超材料传感器的制作属于现有技术，此处仅作为举例而非限制地，提供制作方法如下：1)掩膜板的制作。利用ledit90制图软件绘制器件表面结构图，将需要刻蚀掉的结构绘制在软件中，并在铬版上按图采用电子束曝光制成掩膜版。在掩膜版上，需要保留的图形将变为阴影，而需要被刻蚀掉的部分则仍为透明。2)清洗材料。将掩膜版与石英片用硫酸与双氧水清洗液中进行清洗。3)光刻胶涂抹。光刻胶一般作为转移光学曝光、电子束或离子束光刻图案的媒介。光刻胶分为正光刻胶和负光刻胶，本流程中使用正胶，即感光化合物在曝光后将溶解在显影液中，而不曝光的部分则不溶解。使用甩胶机对石英晶圆(厚度为500μm)进行涂胶，首先在晶圆表面旋涂一层助粘剂(六甲基二硅氮烷)，用以增加晶圆与光刻胶之间的粘性，然后再进行涂胶，通过甩胶机的转速和甩胶时间控制涂胶厚度。最后将样品放入到烘干机中烘干，除去光刻胶中的溶剂，以控制光刻胶的敏感度并释放应力。4)紫外曝光。将涂覆有光刻胶的石英晶圆压在掩膜版下进行紫外曝光。之后将样品再次放入烘干机中进行烘干定型，以使曝光的光刻胶发生化学反映而图形更加均匀。5)显影。将样品放入到显影液(四甲基氢氧化铵)中进行显影，被曝光的光刻胶将溶解在显影液中，而未曝光的部分仍旧涂覆在样品表面。再次将样品放入烘干机中烘烤，进一步使图形定型，将残留的显影液蒸发。6)镀金属。因为直接在玻璃基片上镀金很容易脱离，所以先在基片上镀一层铬(厚度为10nm)作为粘附层，然后再镀金，此处金膜的厚度约50nm。7)去胶清洗。去胶气体为氧气，在高电压下电离生成氧离子，进而将光刻胶氧化成可挥发气体，最终被抽气泵抽走。8)划片。以单峰超材料和双峰超材料样品为例，一片石英晶圆上可以设计多块样品，加工完成后需要将这些样品用激光划开。至此，刻制有多个周期性结构的超材料传感器制作完成。
88.本实施例中，石英样品检测腔11中双条形超材料12的设置如图8所示。该超材料生物传感器12通过与条带结构24相对的一面紧贴于石英样品检测腔11的一侧内壁。具有条带结构的一面则朝向流体，流体为所述的含大肠杆菌的微液滴。综上，石英样品检测腔11中超材料生物传感器12和大肠杆菌微液滴样品组成待测总体，由太赫兹时域光谱系统检测获得太赫兹波段的光谱信息。
89.在本实施例中，分别检测了水溶液形式(即悬浮液)和根据本发明制得的微液滴形式的大肠杆菌样品。每种样品均准备1毫升。图9展示了大肠杆菌细胞数量分别为5.4
×
10
10
、7.2
×
10
10
和9.0
×
10
10
个的悬浮液形式样品25、26、27的透射光谱。可以看到，由于水环境引起了强烈的太赫兹衰减，探测到的太赫兹信号强度极低，且不同细菌数目样品所得光谱不能得到区分。由此可知，直接对缓冲液形式的细胞样品进行太赫兹检测无法有效获得细胞的相关信息，这与国内外相关研究的结论一致。
90.图10展示了微液滴形式的大肠杆菌样品28、29、30的透射光谱，对应大肠杆菌细胞数量与悬浮液形式样品相同。与水溶液形式样品相比，太赫兹信号增强了一个数量级以上，且对应3种大肠杆菌细胞数量的样品的透射光谱可以得到明显的区分。图11展示了由图10计算得到的吸收系数(α(cm-1
))和折射率(refractive index)。从图11可以看出，随着大肠杆菌细胞数量的增加，吸收系数和折射率分别呈现下降和上升的趋势。在微液滴形式的样品中，细胞外培养环境中的水含量大大降低，剩余的环境水由于反向胶束形式的磷脂头部的水合和约束效应，其吸收系数进一步降低。因此，微液滴形式的样品最大限度地突出了细
胞本身的太赫兹频段谱学信息，极大提高了检测的灵敏性，不同数目大肠杆菌的太赫兹光谱获得了显著的区分，其差异程度远高于纯水环境样品间的差别。随着样品中大肠杆菌细胞数量增加，微液滴样品的组成发生变化，细胞外缓冲液比例相对减少，太赫兹光谱所获得的折射率和介电性质更加接近大肠杆菌胞体的性质，产生了图11中的变化。这一结果体现出本发明在细胞数量分析中的良好应用效果。
91.如图12，检测了集成超材料前后大肠杆菌微液滴样品31、32的太赫兹光谱，样品中大肠杆菌细胞数量均为4.5
×
10
10
个。可以看到，当超材料放置于所述微液滴样品环境中时，于0.75和1.22thz处产生了两个谐振峰，在两频率处，太赫兹吸收系数分别由8和13cm-1
增加至76和98cm-1
，进一步增加了接近一个数量级，这对应着理论上根据吸收系数分辨不同细胞样品的检测灵敏度提高接近一个数量级。两谐振峰的频率有效覆盖了所探测的频率范围(0.4-1.8thz)，这一范围内，图11中折射率和吸收系数均因细菌数量变化产生了显著差异，所使用的超材料性质与活细胞的光学特性是契合的。由此可以说明，太赫兹超材料的集成有利于更加灵敏的探测细胞的生理指标。
92.实施例2结合菱形超材料传感器表征不同浓度铜离子处理的大肠杆菌样品
93.将本发明的方法检测经由不同浓度铜离子处理相同时间的大肠杆菌样品作为实施例2，其中本实施例测试样品参考图4：细菌样品6(含大肠杆菌细胞4.5
×
10
10
个)经铜离子处理后分散于0.5毫升，ph＝7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tbs)5中；表面活性剂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4。具体的，测试样品的制备方法如下：大肠杆菌6在l-b肉汤培养基、37℃和240rmp摇晃的情况下培育至稳定生长期，离心后使用tbs缓冲液5冲洗后根据od
600
值计数，与溶解有指定浓度铜离子的tbs缓冲液混合，其中大肠杆菌细胞数量为9.0
×
10
10
个/毫升，铜离子浓度分别为0.1mm，0.2mm和0.4mm，处理20分钟后使用tbs缓冲液洗去过量的铜离子，调整大肠杆菌细胞数量至1.0
×
10
11
个/毫升后构成分散相；将溶于三氯甲烷的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4用氮气吹干，抽真空出去溶剂形成薄膜状，将薄膜状磷脂溶于十六烷中，获得含表面活性剂的连续相。将分散相与含表面活性剂的连续相混合，其中分散相占比9％。混合后使用磁子搅拌并摇匀，制成微液滴样品。
94.本实施例中所使用的太赫兹时域光谱装置参考图6所示。其中，主要区别在于超材料传感器12采用如图14所示的菱形阵列，石英样品检测腔11中超材料12的设置如图8所示，具有条带结构的一面则朝向流体，流体为所述的含大肠杆菌的微液滴。
95.本实施例的样品太赫兹光谱如图13所示，在0.4-1.8thz范围内展示了大肠杆菌被铜离子浓度分别为0.1mm、0.2mm和0.4mm的铜离子溶液处理20分钟后的大肠杆菌样品33、34、35的吸收系数(α(cm-1
))和折射率(refractive index)。从图13可以看到，由于采用了微液滴形式的样品，检测灵敏度显著提高，不同样品的太赫兹光谱产生了显著差异。当所使用的铜离子浓度升高时，处理后的大肠杆菌样品的吸收系数和折射率提高。在本实施例中，经由细菌生长曲线的测定确定，浓度为0.1mm、0.2mm和0.4mm的铜离子处理产生了依次升高的杀死大肠杆菌的能力，故三组铜离子处理样品中，大肠杆菌的细胞活性依次降低，这与依次升高的太赫兹吸收系数和折射率对应。考虑到铜离子处理细菌会造成细胞膜的破坏和部分细胞内容物的外流，细胞内水合状态会发生改变，而太赫兹光谱对这一类变化尤其敏感。综上，本实施例中太赫兹光谱测定显示了表征不同生理状态大肠杆菌的良好效果，不同生理状态大肠杆菌样品的太赫兹性质的差异可能来源于其细胞内水合状态的不同。
96.本实施例中，提出结合菱形超材料传感器来进行更高灵敏度的检测。所提出的超材料传感器的阵列示意图及数值模拟得到的太赫兹透射光谱图如图14所示，其中集成超材料前后的大肠杆菌样品分别为36、37。可以看到，当超材料放置于所述微液滴环境后，于1.48thz处产生了一个谐振峰，使分贝形式的透射率值由1db提升至32db，提高了一个数量级以上，这说明相应的探测灵敏度得到了明显增强。谐振峰的频率1.48thz与图12所示的不同生理状态细菌样品吸收系数的主要差异区间(1-1.8thz)是契合的。
97.本实施例中，使用长条形超材料作为一个对比例，其对应超材料传感器的阵列示意图及数值模拟得到的太赫兹透射光谱如图15所示，当超材料结构更改为长条形时，所产生谐振峰的位置移动至0.93thz，偏离了上述区间(1-1.8thz)。0.93thz处样品因生理状态变化产生的吸收系数差异较小，增强此处吸收系数相应无法取得理想效果，反而不利于获取1-1.8thz范围内的吸收系数差别，不能有效提高检测的灵敏度。本对比例说明，适用于活细胞探测的超材料形状应该根据细胞的折射率和吸收性质进行特定的设计。本实施例中所使用的菱形超材料传感器更为契合所探测活细胞的光学特性，其集成有利于更加灵敏的探测本实施例中的细菌生理指标。
98.实施例3结合双开口环形超材料传感器表征铜离子处理不同时间的大肠杆菌样品
99.将本发明的方法用于检测经由指定浓度铜离子处理不同时间的大肠杆菌样品作为实施例3，其中本实施例测试样品参考图4：细菌样品6(含大肠杆菌4.5
×
10
10
个)经铜离子处理后分散于0.5毫升，ph＝7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tbs)5中；表面活性剂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4。具体的，测试样品的制备方法如下：大肠杆菌6在l-b肉汤培养基、37℃和240rmp摇晃的情况下培育至稳定生长期，离心后使用tbs缓冲液5冲洗后根据od
600
值计数，与溶解有指定浓度铜离子的tbs缓冲液混合，其中大肠杆菌细胞数量为9.0
×
10
10
个/毫升，铜离子浓度为0.4mm，分别处理5分钟、10分钟和20分钟后使用tbs缓冲液洗去过量的铜离子，调整大肠杆菌细胞数量至1.0
×
10
11
个/毫升后构成分散相；将溶于三氯甲烷的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4用氮气吹干，抽真空出去溶剂形成薄膜状，将薄膜状磷脂溶于十六烷中，获得含表面活性剂的连续相。使用微流控芯片制成微液滴样品。
100.本实施例中所使用的微流控芯片参考图5所示，使用的太赫兹时域光谱装置参考图6所示。其中，主要区别在于超材料传感器12采用如图16所示的双开口环形阵列，石英样品检测腔11中超材料12的设置如图8所示，具有条带结构的一面则朝向流体，流体为所述的含大肠杆菌的微液滴。
101.本实施例的样品太赫兹光谱如图15所示，在0.4-1.8thz范围内展示了大肠杆菌被0.4mm铜离子分别处理5、10和20分钟后的大肠杆菌样品38、39、40的吸收系数(α(cm-1
))和折射率(refractive index)。由于采用了微液滴形式的样品，检测灵敏度显著提高，本实施例中不同样品的太赫兹光谱产生了显著差异。三组处理时间不同的大肠杆菌处理组的吸收系数和折射率随处理时间增加而升高。与实施例2类似，在本实施例中，经由细菌生长曲线的测定确定，5分钟、10分钟和20分钟的铜离子处理产生了依次升高的杀死大肠杆菌的能力，故三组铜离子处理样品中，大肠杆菌的细胞活性依次降低。本实施例的结构进一步证实了本发明方法表征不同生理状态大肠杆菌的良好效果，其中，不同生理状态大肠杆菌样品的太赫兹性质的差异可能来源于其细胞内水合状态的不同。
102.本实施例中，提出结合双开口环形超材料传感器来进行更高灵敏度的检测。所提出的超材料传感器的阵列示意图及数值模拟得到的太赫兹透射光谱图如图16所示，其中集成超材料前后的大肠杆菌样品分别为41、42。可以看到，当超材料放置于所述微液滴环境后，分别于0.67和1.66thz处产生了两个谐振峰，在两频率处，分贝形式的透射率值分别由0.6和0.9db增加至26和27db，提高了一个数量级以上，这说明相应的探测灵敏度得到了明显增强。两个谐振峰分布频率覆盖的范围较大，契合本实施例中所需的探测频率范围。由此可以说明，所提出的太赫兹超材料传感器的集成有利于更加灵敏的探测本实施例中的细菌生理指标。
103.实施例4结合缺口中间线形超材料传感器表征分化前后的间充质干细胞样品
104.根据将本发明的方法用于表征分化前后的间充质干细胞样品作为实施例4，其中本实施例测试样品参考图3：将成骨诱导分化的间充质干细胞和未经诱导分化的间充质干细胞分散于dmem培养基中，构成分散相；表面活性剂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱。具体的，测试样品的制备方法如下：人脐带间充质干细胞在37℃、5％co2环境下加湿培养箱中，使用dmem培养基(低糖型，添加胎牛血清、青霉素、链霉素)培养，在成骨诱导分化的对照组的培养基质中额外添加诱导成骨分化药物地塞米松，培养基每隔一天更新一次，培养21天后标准胰蛋白酶化处理后计数，分散于培养基质中构成分散相；将溶于三氯甲烷的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4用氮气吹干，抽真空出去溶剂形成薄膜状，将薄膜状磷脂溶于十六烷中，获得含表面活性剂的连续相。使用微流控芯片制成微液滴样品。
105.本实施例中所使用的微流控芯片参考图5所示，使用的太赫兹时域光谱装置参考图6所示。其中，主要区别在于超材料传感器12采用如图18所示的缺口中间线形阵列，石英样品检测腔11中超材料12的设置如图8所示，具有条带结构的一面则朝向流体，流体为所述的含间充质干细胞的微液滴。
106.本实施例的样品太赫兹光谱如图17所示，在0.4-1.8thz范围内展示了未经诱导分化的间充质干细胞43和成骨诱导分化的间充质干细胞44样品的吸收系数(α(cm-1
))和折射率(refractive index)。图中可以看到，由于采用了微液滴形式的样品，细胞本身的太赫兹频段谱学性质被最大限度的突出，其检测灵敏度显著提高。光谱结果显示成骨诱导分化的间充质干细胞的吸收系数和折射率均高于未诱导组。细胞分化是细胞基因组在时间和空间上的选择性表达的结果，因此，细胞内部的生物分子组成和细胞的形态发生了一定程度上的变化，从而改变了细胞的水合信息。考虑到太赫兹光谱对水合信息非常敏感，这可能是造成分化前后细胞样品太赫兹光谱差异的原因之一。综上，本实施例中，本发明方法提出的微液滴检测体系显示了在表征药物诱导引发的细胞分化上的良好效果。
107.本实施例中，提出结合缺口中间线形超材料传感器来进行更高灵敏度的检测。所提出的超材料传感器的阵列示意图及数值模拟得到的太赫兹透射光谱图如图18所示，其中集成超材料前后的间充质干细胞样品分别为45、46。可以看到，当超材料放置于所述微液滴环境后，于0.71thz处产生了一个谐振峰，使分贝形式的透射率值由0.7db提升至19db，提高了一个数量级以上，这说明相应的探测灵敏度得到了明显增强。在谐振峰的频率0.7thz处，图17中不同表型细胞的吸收系数有明显区别，两者是契合的。由此可以说明，所提出的太赫兹超材料传感器的集成有利于更加灵敏的探测本实施例中细胞的生理指标。
108.以上实施例为基于微液滴检测体系表征原核细胞和真核细胞的实施示范，旨在说
明所述检测体系可以广泛应用于多种细胞，可获得的生物学信息包含细胞数目、细胞活性和细胞基因表达信息等，以说明本发明方法在临床检验、药物筛选等方面的潜力。而通过结合太赫兹超材料，探测的灵敏度可以进一步增强，同时可以针对性的获得特定波段的太赫兹光学特性。以下实施例中，将着重描述对探测体系和测试方法的设计。
109.实施例5检测病原体类型
110.将本发明的方法用于检测不同类型的病原体作为实施例5。该实施例通过检测病菌样品太赫兹波段的光学性质判断致病菌的类型。该实施例中，分散相为从病人身体或环境中采得的含致病菌的液体，微液滴形式的样品还包括含表面活性剂的连续相。常见的病原体包含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌等。不同种类细菌的细胞形态或内容物种类存在一定差异，因此在太赫兹频段展示出不同的吸收和折射率性质，由此可以判断出致病菌的类型。
111.本实施例中，微液滴形式的样品由微流控装置产生。实施例1-3表明了测定细菌样品太赫兹波段吸收系数和折射率的可行性；实施例4则表明了可以根据这些太赫兹频段光学性质分辨不同类型的细胞。特别指出的是，微流控装置可以进一步集成其他已有的微流体处理结构，从而实现细胞分选等功能。因此，预先进行细菌培养，获得特定浓度的细菌仅作为原理展示的实施例中保证检测结果准确的条件，并非必要过程。因此，实践中快速地获得病原体的微液滴样品，进行太赫兹检测是可行的。此外将太赫兹超材料引入检测体系中可以显著提高探测的灵敏度，使本实施例可用于只含微量病原体的样品检测中，大大提高本实施例的应用范围。
112.实施例6评估抗癌药物效果
113.将本发明的方法用于检测不同抗癌药物处理的hela细胞的活性作为实施例6，其中本实施例测试样品参考图3：处理后的hela细胞分散于于dmem培养基中，构成分散相；表面活性剂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱。具体的，测试样品的制备方法如下：hela细胞在37℃、5％co2环境下加湿培养箱中，使用dmem培养基(低糖型，添加胎牛血清、青霉素、链霉素)培养，培养基每隔一天更新一次，培养21天后标准胰蛋白酶化处理后计数，使用添加顺铂的dmem培养基处理不同时间，处理后分散于培养基质中构成分散相；将溶于三氯甲烷的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱4用氮气吹干，抽真空出去溶剂形成薄膜状，将薄膜状磷脂溶于十六烷中，获得含表面活性剂的连续相。使用微流控芯片制成微液滴样品。
114.该实施例为通过细胞太赫兹波段光学性质的变化实时监测抗癌药物处理后hela细胞活性的变化，从而实时评估抗癌药物的效果。抗癌药物具有不同的作用机理，但其结果均指向癌细胞的活性降低和死亡，这会引起太赫兹光谱的变化。图19中展示了用抗癌药物顺铂处理hela细胞0、12和24小时后形成的微液滴样品47、48和49的吸收系数(α(cm-1
))和折射率(refractive index)。从图19可以看到，微液滴形式的样品使细胞本身的太赫兹频段谱学性质被最大限度的突出，其检测灵敏度显著提高。光谱结果显示，对处理时间较长的细胞样品，其吸收系数和折射率均高于处理时间较短的样品。这一结果说明，将本发明方法提出的微液滴检测方法用于评估抗癌药物效果是可行的。
115.在本实施例中，如图5所示的微流控结构被设置多组，hela细胞悬浮液添加抗癌药物后作为分散相，而表面活性剂和连续相从连续相入口加入。结合所述双条形、菱条形、缺
口中间线形以及双开口环形等超材料传感器结构，可以实时监测hela细胞的太赫兹光学特性。将获得的数个太赫兹光谱，包括吸收系数、折射率、特征吸收峰变化等信息直接作为特征参数输入，建模训练基于已知抗癌效果和机理的药物处理后的太赫兹光谱变化预测抗癌药物作用效果和作用机理的及其学习模型。之后，根据未知抗癌药物处理后hela细胞的太赫兹特征参数和所述模型，可以预测抗癌新药物的抗癌效果和机理。需要指出的是，本实施例中的太赫兹光学信息并非作为判断抗癌药物效果和机理的最终手段，但作为一种低成本、快速、高通量的辅助筛选手段，可以提高药物的研发效率，而且随着人工智能和太赫兹检测装置的进步，本方法的检测准确性会不断提高，并最终具有高准确度的能力。
116.最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换均落入本发明权利要求书请求保护的范围内。