一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究与流程

1.本发明涉及天然活性物质提取技术领域，具体为一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究。


背景技术：

2.积雪草[centella asiatica(l.)urban]为伞形科积雪草属植物的全草，多年生匍匐草本，主要分布于长江流域以南各地，又称崩大碗、落得打、马蹄草、连线草、半边钱等,是中国药典收载的常用中药。《神农本草经》记载其性寒、味苦、辛；具有清热利湿、解毒消肿、活血化瘀和利尿等功效。临床上多用于外科、皮肤科、传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎，还可
[0003]
用于痈肿疮毒、中暑腹泻、砂淋血淋、湿热黄疸等。
[0004]
积雪草提取物具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋病毒逆转录酶活性、调节免疫、抗
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抑郁等多种药理活性。用于治疗皮肤外科疾病如顽固性创伤，皮肤结核等。在临床上还用于
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治疗镊血管病、传染性肝炎、急性肾小球炎、流行性脑脊椎膜炎、皮肤创伤、流行性腮腺炎。
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积雪草提取物主要的有效成分包括：积雪草苷(asiaticoside)、羟基积雪草苷(madecassoside)和积雪草苷-b(asiaticoside b)，均属三萜皂苷类，被合称为积雪草总苷(《中国药典》2010版)；积雪草含有的化学成分还包括：积雪草酸、羟基积雪草酸、积雪草二糖苷、正二十七烷、2,4,6-三叔丁基苯、对羟基苯甲酸、万寿菊素、槲皮素、二十六醇辛酸酯、山奈酚、槲皮素、胡萝卜素、香草酸、丁二酸、terminoli cacid等。
[0008]
目前对于积雪草蛋白的研究非常少，采用常规提取手段，对积雪草提取后，活性、纯度和生物安全性都较低，所以我们认为有必要尝试这个领域的研究。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究，解决了扩展积雪草应用的问题，绿色环保，所得产物的生物安全性更高。
[0010]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究，包括以下步骤：
[0011]
步骤一：积雪草全草粉碎过筛，用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质，随后弃去溶剂收集积雪草粉末；
[0012]
步骤二：步骤一得到的积雪草粉末用0.1molnaoh溶液搅拌提取多次，每次2h。合并多次提取得到的提取液，得积雪草粗提取液；
[0013]
步骤三：步骤二得到的积雪草提取液调节ph至5.0，反应20min；
[0014]
步骤四：步骤三得到的积雪草提取物10000rpm离心30min，用pbs溶解即得积雪草蛋白溶液。
[0015]
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中的粉碎过筛的时间为15-30min。
[0016]
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一种利用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质的时间为10-15min。
[0017]
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤四中离心采用的离心机为台式离心机和落地式离心机中的一种。
[0018]
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤二中搅拌提取采用的设备为搅拌提取罐。
[0019]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0020]
1.本发明通过用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质，随后弃去溶剂收集积雪草粉末，再利用溶液搅拌提取多次后提取得到的提取液调节ph反应，离心用pbs溶解后得到的积雪草蛋白溶液，比起传统积雪草蛋白的提取方式，具有活性高、纯度高和生物安全性高的优点。
附图说明
[0021]
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
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图1为本发明一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究的流程图。
具体实施方式
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实施例一
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请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究，包括以下步骤：
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步骤一：积雪草全草粉碎过筛，用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质，随后弃去溶剂收集积雪草粉末；
[0026]
步骤二：步骤一得到的积雪草粉末用0.1molnaoh溶液搅拌提取多次，每次2h。合并多次提取得到的提取液，得积雪草粗提取液；
[0027]
步骤三：步骤二得到的积雪草提取液调节ph至5.0，反应20min；
[0028]
步骤四：步骤三得到的积雪草提取物10000rpm离心30min，用pbs溶解即得积雪草蛋白溶液。
[0029]
在有的技术方案中，所述步骤一中的粉碎过筛的时间为15-30min。
[0030]
在有的技术方案中，所述步骤一种利用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质的时间为10-15min。
[0031]
在有的技术方案中，所述步骤四中离心采用的离心机为台式离心机和落地式离心机中的一种。
[0032]
实验例一
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积雪草蛋白活性分析
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取10ml的具塞玻璃管加入2ml 0.1mmol/l的dpph 95％乙醇溶液，充分震荡均匀，静置10min，然后加入本实验超声预处理后的积雪草分离蛋白粗品溶液和95％乙醇溶液各2ml,分别标记为a1、a3。2ml水解液中加入2ml95％乙醇溶液,标记为a2，震荡5min,用锡箔纸包裹好，室温下黑暗避光反应30min,517nm下测定吸光度，95％乙醇溶液作为参比溶液调
零。
[0035]
计算:
[0036]
sa＝(1-(a1-a2)/a3)*100％
[0037]
式中sa:清除自由基能力，％；a1:dpph溶液 积雪草蛋白溶液吸光值；a2:95％乙醇 积雪草蛋白溶液吸光值；a3:dpph 95％乙醇溶液的吸光值。
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测试与计算得到的结果如下表1：
[0039]
传统积雪草蛋白数据参数表1如下：
[0040]
测试项目蛋白抗氧化活性参数指标低
[0041]
实施例一积雪草蛋白数据参数表2如下：
[0042]
测试项目蛋白抗氧化活性参数指标极高
[0043]
实验例二
[0044]
纯度分析
[0045]
采用hplc分析法测定以上实施例和对比传统提取得到的羟基积雪草苷产物的纯度，hplc分析的色谱条件同《中国药典》2020版一部积雪草项下的含量测定方法(第296页)，
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测试与计算得到的结果如下表1：
[0047]
传统羟基积雪草苷产物数据参数表1如下：
[0048]
测试项目蛋白纯度参数指标30％
[0049]
实施例一羟基积雪草苷产物数据参数表2如下：
[0050]
测试项目蛋白纯度参数指标90％
[0051]
根据上述实施例和对比例的结果可知，利用本发明技术方案制备的积雪草蛋白为90％左右，本发明的技术方案具有显著的进步性。
[0052]
实验例三
[0053]
生物安全性测试
[0054]
按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sn/t2329-2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》所述的实验步骤对积雪草蛋白进行生物安全性测试。采用0.9％浓度的生理盐水作为空白对照组。
[0055]
刺激评分法(简称is)计算公式如下式i。
[0056]
is《1表示无刺激，1≤is《5表示轻微刺激，5≤is《9表示中等刺激，is≥9表示强烈
[0057]
刺激。
[0058]
测试与计算得到的结果如下表1：
[0059]
传统生物安全性实验结果
[0060]
样品浓度刺激性分类生理盐水0.9％无刺激积雪草蛋白 中等刺激
[0061]
实施例一生物安全性实验结果
[0062]
样品浓度刺激性分类生理盐水0.9％无刺激积雪草蛋白 无刺激
[0063]
生物安全性测试表明，实施例一所得到的提取物的生物刺激性更低，安全性更优。
[0064]
在一种积雪草蛋白提取物的提取方法及活性研究使用的时候，积雪草全草粉碎过筛，用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质，随后弃去溶剂收集积雪草粉末，步骤一得到的积雪草粉末用0.1molnaoh溶液搅拌提取多次，每次2h。合并多次提取得到的提取液，得积雪草粗提取液，步骤二得到的积雪草提取液调节ph至5.0，反应20min，步骤三得到的积雪草提取物10000rpm离心30min，用pbs溶解即得积雪草蛋白溶液，通过用有机溶剂浸泡脱去脂溶性物质，随后弃去溶剂收集积雪草粉末，再利用溶液搅拌提取多次后提取得到的提取液调节ph反应，离心用pbs溶解后得到的积雪草蛋白溶液，比起传统积雪草蛋白的提取方式，具有活性高、纯度高和生物安全性高的优点，部件均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。