一种快速检测发酵液中ARA含量及总油的方法与流程

一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法
技术领域
1.本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法。


背景技术：

2.发酵液中ara含量及含油检测是一项繁琐的工作，需经过高温提油、甲酯化、溶剂萃取、上机检测等繁琐步骤，耗时长、溶剂消耗多、不环保且成本高。因此，开发出一种适用于ara发酵液体系的快速检测方法具有现实意义。
3.目前，核磁共振含量测定仪利用核磁共振技术，基于嵌入式开发平台和数字信号处理技术，可实现含油作物含油率的快速测定。但是难以实现ara含量的测定，所适用的检测领域有很大的局限性。
4.近红外分析技术因具有快速、无损、高效、成本低等优点，应用领域广泛，它是近红外设备、化学计量软件和近红外模型三者的有机结合。近红外技术是依据样品中化学成分产生的光谱吸收峰位置和强度而进行的定量分析。应用nir光谱进行检测的技术关键是在两者间建立一种定量的函数关系。基本流程包括：首先收集具有代表性的样品(其组成及变化范围接近于要分析的样品)，利用标准的化学方法对样品进行化学成分测定，然后采集样品的光谱数据，通过化学计量软件将光谱数据和化学分析检测数据进行回归计算，确定函数关系，然后建立近红外模型；在分析样品时，先对待测样品进行扫描，根据待测样品的光谱数据，利用建立的近红外模型，可以计算出待测样品的成分含量。现有公开技术中并没有检测发酵液中ara的近红外分析方法，而ara发酵液中的高山被孢霉为丝状菌体，其形态有别于酵母、藻类呈卵形、椭圆形、球形等形态规整的菌体，导致直接采用常规方法的样品近红外采集的光谱数据难以建立准确的模型。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，通过样品前处理，提高检测结果的准确性。
6.本发明提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，采用近红外光谱分析计术，包括模型建立和测样步骤；所述模型建立和测样步骤中均进行样品前处理：将发酵液中的菌体处理至菌体含水量小于等于30％后置于杯体中。
7.近红外技术是近红外设备、化学计量软件和近红外模型三者的有机结合。现有技术中普遍认为，近红外模型是近红外设备能否准确检测的核心和关键，因此，针对现有近红外方法不能准确测定发酵液中ara含量的问题，研究人员着重于改进模型，即努力在样品的近红外光谱数据与化学分析检测数据间寻找更为合适的函数关系。而本发明另辟蹊径，发现在模型建立和测样步骤中均进行样品前处理，即将发酵液中的菌体处理至菌体含水量小于等于30％并将其用杯体盛放，而不是传统的塑料袋装发酵液，可明显提高检测结果的准确性。
8.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，将发酵液中的菌体处理至含水量为15～25％。该操作可通过清洗菌体后再通过离心甩干、挤干、拭干水分等方式组合或单独操作实现，其中清洗菌体主要是洗去菌体上附着的培养基成分、颗粒等。
9.本发明研究发现，将发酵液中的菌体处理至含水量为15～25％的湿菌体，比处理至含水量小于10％的干菌体，其检测结果更准确。本发明中将发酵液中的菌体处理成湿菌体可通过清洗菌体后再采用过滤、离心甩干、挤干、拭干等方法，若要处理成干菌体，可进一步进行烘干步骤。其中清洗菌体主要是洗去菌体上附着的培养基成分、颗粒等。
10.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，采用的近红外光谱仪为ft9700，所述杯体为ft9700配套的样品杯。
11.近红外设备与近红外模型也是相关的，本发明采用的近红外光谱仪为ft9700，其具体参数如下：
12.光源种类：采用空气冷却的、预校准的、热点稳定的卤钨灯光源。分束器：宽范围多镀层caf2。
13.减振装置：光学台与底盘隔离，防震性能好。
14.仪器密封干燥：光学台，样品室，检测器室，有独立干燥密封。
15.分辨率：0.2-6.4nm，1390nm处(近红外区)或者1cm-1
到64cm-1
可调。
16.噪声：《15uabs(1分钟，rms)。
17.光谱范围：700-2500nm(14300-4000cm-1
)。
18.波长准确度：优于0.028nm(1670nm处)；或优于0.1cm-1
(6000cm-1
处)。
19.波长重复性：优于0.004nm(1390nm处)；或优于0.02cm-1
(7200cm-1
处)。
20.该型号的近红外光谱仪配备有样品杯，材质为蓝宝石。一般待测样为发酵液时，本领域技术人员检测通常采用塑料袋装，本发明发现使用该样品杯装效果更好。
21.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，所述近红外光谱仪的光谱范围为700-2500nm，建立模型时选取所述光谱范围内的近红外光谱数据。
22.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，所述模型建立包括将样品的近红外光谱数据分别与ara含量实测值、总油实测值建立一一对应关系，得到近红外模型。
23.需要说明的是，建立一一对应关系实际都是通过计算机软件进行拟合。本发明具体实施方式中采用的unscrambler建模软件，当在计算机中输入样品的近红外光谱数据以及ara含量实测值、总油实测值后，利用该软件即可得到近红外模型。
24.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，所述ara含量实测值基于现有标准化学检测方法获得；所述总油实测值基于核磁共振检测方法获得。总之，ara含量实测值、总油实测值均是通过已知的标准方法测得。
25.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，所述模型建立步骤中，样品的数量大于100个。样品数量越多，模型检测准确性越高。
26.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，所述近红外模型的预测标准偏差可小于1％，相关系数大于0.98。
27.近红外模型的准确性可以参考模型本身的secv(预测标准偏差)和r2(相关系数)，secv越小，r2越大，说明近红外模型准确性越高。本发明所得近红外模型的准确性较高。
28.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，进行所述测样步骤后，将测得的近红外光谱数据导入建立的近红外模型中，经results plus软件计算得到待测样的ara含量及总油。
29.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法测得样品，ara含量结果偏差小于1％的概率可达到84％，含油量结果偏差小于1％的概率可达到65％。
30.根据本发明提供的快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，所述发酵液为高山被孢霉发酵液。
31.本发明提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，通过在近红外分析法的模型建立和测样步骤中均进行样品前处理，即将发酵液中的菌体处理至菌体含水量小于等于30％并将其用杯体盛放，而不是传统的塑料袋装发酵液，可明显提高检测结果的准确性。
附图说明
32.图1为实施例1所得ara含量模型图；
33.图2为实施例1所得总油模型图；
34.图3为实施例2所得ara含量模型图；
35.图4为实施例2所得总油模型图；
36.图5为实施例3所得ara含量模型图；
37.图6为实施例3所得总油模型图；
38.图7为实施例2方法ara含量预测偏差分布比例图；
39.图8为实施例2方法总油预测偏差分布比例图；
40.图9为实施例3方法ara含量预测偏差分布比例图；
41.图10为实施例3方法总油预测偏差分布比例图；
42.图11为实施例1方法ara含量预测偏差分布比例图；
43.图12为实施例1方法总油预测偏差分布比例图。
具体实施方式
44.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.若无特别说明，本发明实施例所涉及原料均可通过市售获得。
46.实施例1
47.本实施例提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，具体步骤如下：
48.1、模型建立
49.1.1收集ara发酵液样品：所收集样品其组成接近待测样品，样品数量为148。
50.1.2样品前处理：将ara发酵液通过纱布过滤掉液体，用自来水冲洗菌体，4000r/min离心10mins后，再挤干水分至含水量约为23％，将所得湿菌体倒入ft9700的样品杯，铺平(样品表面看不到透过的光)，备用。
51.其中湿菌体的含水量测定方法为：挤干水分的菌体称取质量m1，置于105℃烘箱中烘至恒重，质量为m2。
52.含水量＝(m1-m2)/m1*100％
53.1.3近红外光谱数据采集：将上述前处理得到的样品放置于ft9700仪器的检测室中进行检测，采集光谱范围700-2500nm内的近红外光谱数据。
54.1.4获取ara含量实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取0.1g左右菌体置于5ml容量瓶中，加入1mlnaoh-ch3oh摇匀，置于60℃水浴锅中反应30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。30min后，取出容量瓶，加入1mlbf
3-ch3oh溶液，摇匀，加入60℃水浴锅水浴30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。处理好的样品取出摇匀冷却至室温，加入几毫升正己烷，摇匀、静置、取上清过膜，gc检测。
55.1.5获取总油实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取5g左右菌体于萃取滤纸筒中，提脂瓶干燥恒重后记录其质量，安装好提脂装置，加入30ml无水乙醚，反应两个小时后，将乙醚氮吹至干，置于105℃烘箱中两个小时，取出冷却后再次称重，根据前后质量差计算得出总油含量。
56.注意此处1.3、1.4和1.5的顺序可任意调换。
57.1.6模型建立：将近红外光谱数据和ara含量实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得ara含量模型(如图1所示)；
58.将近红外光谱数据和总油实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得总油模型(如图2所示)。
59.2、待测样检测
60.取待测样，按1.2进行前处理，处理得到的样品按1.3进行近红外光谱数据采集，将采集到的光谱数据分别导入上述ara含量模型和总油模型，经results plus软件计算得到ara含量和总油。
61.实施例2
62.本实施例提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，具体步骤如下：
63.1、模型建立
64.1.1收集ara发酵液样品：样品数量为270；
65.1.2样品前处理：将ara发酵液通过纱布过滤掉液体，用自来水冲洗菌体，再烘干水分至含水量约为9.8％，将所得干菌体倒入ft9700的样品杯，铺平，备用；
66.1.3近红外光谱数据采集：将上述前处理得到的样品放置于ft9700仪器的检测室中进行检测，采集光谱范围700-2500nm内的近红外光谱数据；
67.1.4获取ara含量实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取0.1g左右菌体置于5ml容量瓶中，加入1mlnaoh-ch3oh摇匀，置于60℃水浴锅中反应30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。30min后，取出容量瓶，加入1mlbf
3-ch3oh溶液，摇匀，加入60℃水浴锅水浴30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。处理好的样品取出摇匀冷却至室温，加入几毫升正己烷，摇匀、静置、取上清过膜，gc检测。
68.1.5获取总油实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取5g左右菌体于萃取滤纸筒中，提脂瓶干燥恒重后记录其质量，安装好提脂装置，加入30ml无水乙醚，反应两个小时后，将乙醚氮吹至干，置于105℃烘箱中两个小时，取出冷却后再次称重，根据前后质量差计算
得出总油含量。
69.注意此处1.3、1.4和1.5的顺序可任意调换；
70.1.6模型建立：将近红外光谱数据和ara含量实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得ara含量模型(如图3所示)；
71.将近红外光谱数据和总油实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得总油模型(如图4所示)。
72.2、待测样检测
73.取待测样，按1.2进行前处理，处理得到的样品按1.3进行近红外光谱数据采集，将采集到的光谱数据分别导入上述ara含量模型和总油模型，经results plus软件计算得到ara含量和总油。
74.实施例3
75.本实施例提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，具体步骤如下：
76.1、模型建立
77.1.1收集ara发酵液样品：样品数量为290；
78.1.2样品前处理：将ara发酵液通过纱布过滤掉液体，用自来水冲洗菌体，再烘干水分至含水量约为9.5％(同实施例2的烘干处理方法)，将所得干菌体用塑料袋密封保存，备用；
79.1.3近红外光谱数据采集：将上述前处理得到的样品放置于ft9700仪器的检测室中进行检测，采集光谱范围700-2500nm内的近红外光谱数据；
80.1.4获取ara含量实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取0.1g左右菌体置于5ml容量瓶中，加入1mlnaoh-ch3oh摇匀，置于60℃水浴锅中反应30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。30min后，取出容量瓶，加入1mlbf
3-ch3oh溶液，摇匀，加入60℃水浴锅水浴30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。处理好的样品取出摇匀冷却至室温，加入几毫升正己烷，摇匀、静置、取上清过膜，gc检测。
81.1.5获取总油实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取5g左右菌体于萃取滤纸筒中，提脂瓶干燥恒重后记录其质量，安装好提脂装置，加入30ml无水乙醚，反应两个小时后，将乙醚氮吹至干，置于105℃烘箱中两个小时，取出冷却后再次称重，根据前后质量差计算得出总油含量。
82.注意此处1.3、1.4和1.5的顺序可任意调换。
83.1.6模型建立：将近红外光谱数据和ara含量实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得ara含量模型(如图5所示)；
84.将近红外光谱数据和总油实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得总油模型(如图6所示)。
85.2、待测样检测
86.取待测样，按1.2进行前处理，处理得到的样品按1.3进行近红外光谱数据采集，将采集到的光谱数据分别导入上述ara含量模型和总油模型，经results plus软件计算得到ara含量和总油。
87.模型参数
88.将实施例1-3中的模型参数统计如下：
89.表1
[0090][0091]
由以上结果可以看出，近红外光谱与干菌体、湿菌体的总油、ara都具有高度线性相关性(r2》0.95)，检测结果准确性(secv越小越好)从高到低依次为湿菌体杯装》干菌体杯装》干菌体袋装。
[0092]
盲样验证
[0093]
实施例1-3的方法进行盲样验证，一共49个样品，现将近红外预测结果和标准方法检测结果统计如下：
[0094]
表2
[0095]
[0096][0097]
为了更直观地了解盲样预测的偏差情况，将偏差分为《0.5、0.5-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、》2.0，共5个等级，并统计了在49个样品中所占的比例，结果如图7-12所示。
[0098]
由以上结果看出，湿菌体模型参数比干菌体杯装模型参数更好，在盲样验证中，采用湿菌体建立的模型84％的盲样的ara预测偏差在1％之内，65％的盲样总油偏差在1％之内，优于干菌体杯装模型验证结果77％的盲样ara预测偏差在1％之内，63％的盲样总油偏差在1％之内。
[0099]
对比例1
[0100]
本对比例提供一种快速检测发酵液中ara含量及总油的方法，具体步骤如下：
[0101]
1、模型建立
[0102]
1.1收集ara发酵液样品：样品倒入ft9700的样品杯；
[0103]
1.2近红外光谱数据采集：将收集的样品放置于ft9700仪器的检测室中进行检测，采集光谱范围700-2500nm内的近红外光谱数据；
[0104]
1.3获取ara含量实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取0.1g左右菌体置于5ml容量瓶中，加入1mlnaoh-ch3oh摇匀，置于60℃水浴锅中反应30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。30min后，取出容量瓶，加入1mlbf
3-ch3oh溶液，摇匀，加入60℃水浴锅水浴30min，每隔7～8分钟取出摇匀一次。处理好的样品取出摇匀冷却至室温，加入几毫升正己烷，摇匀、静置、取上清过膜，gc检测。
[0105]
1.4获取总油实测值：取部分发酵液烘干得菌体，称取5g左右菌体于萃取滤纸筒中，提脂瓶干燥恒重后记录其质量，安装好提脂装置，加入30ml无水乙醚，反应两个小时后，将乙醚氮吹至干，置于105℃烘箱中两个小时，取出冷却后再次称重，根据前后质量差计算得出总油含量。
[0106]
注意此处1.2、1.3和1.4的顺序可任意调换。
[0107]
1.5模型建立：将近红外光谱数据和ara含量实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得ara含量模型；
[0108]
将近红外光谱数据和总油实测值录入计算机中，利用unscrambler软件拟合，获得总油模型。
[0109]
2、待测样检测
[0110]
取待测样，倒入ft9700的样品杯，按1.2进行近红外光谱数据采集，将采集到的光谱数据分别导入上述ara含量模型和总油模型，经results plus软件计算得到ara含量和总油。
[0111]
对比例1得到的模型进行样品验证，结果出现了数据偏差较大，且数据不稳定，具体如下：
[0112]
表3
[0113][0114]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。