结合OX40的抗体或抗原结合片段的制作方法

结合ox40的抗体或抗原结合片段
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及结合ox40的抗体或抗原结合片段、结合ox40的纳米抗体及其用途。


背景技术：

2.免疫治疗目前被认为是癌症治疗的主要替代方法之一
[1
–
3]
。特别是，免疫疗法通过抑制或激活免疫检查点分子，例如pd-1/pd-l1通路(程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡1配体1)
[4
–
6]
，ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞抗原4)
[7,8]
，lag-3(淋巴细胞活化基因) [9]
、ox40
[10]
、tim-3(t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)
[11]
、kir(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)
[12]
和tigit(t细胞免疫球蛋白和itim结构域)
[13]
来逆转肿瘤的免疫逃逸。
[0003]
ox40，又称cd134、tnfrsf4或act35，是一种在cd4 和cd8 t细胞以及中性粒细胞和nk细胞中表达的膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子超家族成员。 ox40是一种分子量为约50kd的i型跨膜糖蛋白，其胞外区具有191个氨基酸残基，包含了三个完整的以及一个稍短的富含半胱氨酸的结构域(crds)。ox40是t细胞表面的正性共刺激分子，不表达于静息的t细胞表面，而在t细胞活化后24-72小时有较高的表达，与其配体ox40l(又称cd252或tnfsf4)结合以传递共刺激信号。ox40/ox40l信号在 t细胞的活化、增殖以及抑制凋亡过程中发挥着非常重要的作用。有研究表明，ox40通过多种信号途径(如nf-κb途径)，刺激t细胞分泌大量细胞因子，并分化为记忆和效应 t细胞
[14-16]
。在非小细胞肺癌、卵巢癌、进展期胃癌，晚期结直肠癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤中，肿瘤浸润性淋巴细胞中ox40的高表达与良好的预后有关
[17-23]
。靶向激动剂抗ox40单克隆抗体联合免疫治疗可提高胶质母细胞瘤小鼠的存活率，t辅助细胞1型 (th1)的抗肿瘤免疫效应得到显著增强；联合抗pd-1/ox40的单克隆抗体治疗可显著抑制小鼠卵巢癌的肿瘤生长，使得脾脏中的cd8 t细胞产生高水平的ifn-γ并经肿瘤抗原刺激后，表现出抗原特异性的细胞溶解活性
[24-26]
。此外，ox40共刺激消除了组成性表达 ox40的foxp3 treg细胞的抑制功能
[10,27-28]
。可见，ox40激活效应t细胞并抑制调节t细胞，正向调控刺激肿瘤免疫。基于这些特点，ox40受体被认为是新型肿瘤免疫治疗有希望的靶点之一。
[0004]
除其配体ox40l外，目前已开发出几种用于介导ox40激活的激动剂抗体，目前正处于早期的临床阶段。例如pogalizumab，也可称moxr0916或rg7888，是一种人源化的效应激动剂igg1单克隆靶向ox40抗体，目前已在临床上与阿特珠单抗(atezolizumab)联合用于晚期实体瘤的治疗，初期结果显示，该联合用药显示出良好的依从性
[28]
。此外， medi0562，ibi101和bgb-a445等激动剂抗体也已经进入临床并用于多种类型的抗肿瘤治疗。尽管如此，仍需进一步设计和开发出功能更优的具有差异化的ox40激动剂抗体，以此来降低临床试验潜在的风险。


技术实现要素：

[0005]
在本公开的第一方面，提供了结合ox40的抗体及其抗原结合片段，其中所述抗体
或抗原结合片段包括重链可变区(vh)，所述vh包括具有选自seq id no:1-12所示的氨基酸序列的一个或多个cdr。
[0006]
gsifsvyv(seq id no:1)。
[0007]
itpfddnt(seq id no:2)。
[0008]
aadwewpeyny(seq id no:3)。
[0009]
gfifsayf(seq id no:4)。
[0010]
insnddit(seq id no:5)。
[0011]
aawlgaenygy(seq id no:6)。
[0012]
gsildsnl(seq id no:7)。
[0013]
insyddnt(seq id no:8)。
[0014]
aaqvfvgwpytdqmhdy(seq id no:9)。
[0015]
gsiydfdv(seq id no:10)。
[0016]
insfgdit(seq id no:11)。
[0017]
aadwhvliqqvlgy(seq id no:12)。
[0018]
在一些实施方案中，所述vh包括cdr1、cdr2和cdr3，其中：
[0019]
所述cdr1具有seq id no:1、4、7或10所示的氨基酸序列；
[0020]
所述cdr2具有seq id no:2、5、8或11所示的氨基酸序列；和
[0021]
所述cdr3具有seq id no:3、6、9或12所示的氨基酸序列。
[0022]
在一些实施方案中，所述vh包括：
[0023]
a)分别具有seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；
[0024]
b)分别具有seq id no:4、5和6所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；
[0025]
c)分别具有seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0026]
d)分别具有seq id no:10、11和12所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。
[0027]
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子间的非随机的结合反应，如抗体及其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方案中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指抗体以小于大约10-5
m，例如小于大约10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、或10-10
m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。本文所用“k
d”是指，特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
[0028]
如本文所用，术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。术语“抗原”是在机体内能诱发免疫应答且与抗体特异性结合的物质，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、半抗原或上述物质的组合。抗体与抗原的结合依靠二者间形成的相互作用来介导，包括氢键、范德华力、离子键以及疏水键。抗原表面与抗体结合的区域为“抗原决定簇”或“表位”。
[0029]
本公开所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体还包括鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体以及其它来源的抗体。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，fc效应功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识
别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。换句话说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一个抗原结合结构域的分子。
[0030]
如本文所用，“可变区”(重链可变区vh和轻链可变区vl)表示直接参与抗体和抗原的结合的重链和轻链部分。每个vh和vl区由以下顺序从n末端到c末端排列的三个高变区或互补决定区(cdr)和四个框架区(fr)组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
[0031]
如本文所用，术语“cdr”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个cdr，其称为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的确切边界根据不同的系统而不同定义。kabat等人(kabatetal,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了限定三个cdr的残基边界。这些cdr可以称为kabatcdr。每个互补决定区可以包含由kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基。chothia等人(chothia&lesk,j.mol.biol,196:901-917(1987)和chothiaetal.,nature342:877-883(1989))发现，kabatcdr内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有多样性。这些子部分分别称为l1、l2和l3或h1、h2和h3，其中“l”和“h”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为chothiacdr，其具有与kabatcdr重叠的边界。还有其它cdr边界定义可以不严格遵循上述系统之一，但是仍将与kabatcdr重叠。本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的cdr，尽管优选实施方案使用kabat或chothia定义的cdr
[0032]
在一些实施方案中，所述抗体为单价、二价或多价抗体。
[0033]
在一些实施方案中，所述抗体为单特异性、双特异性或多特异性抗体。
[0034]
在一些实施方案中，所述抗体为双特异性抗体，其包含结合ox40的第一抗原结合臂和结合另一抗原或ox40分子上的另一表位的第二抗原结合臂，其中所述第一抗原结合臂包含如上文中定义的重链可变区(vh)。
[0035]
在一些实施方案中，所述抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
[0036]
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为5类(同种型)：iga、igd、ige、igg和igm，其还可以进一步分成不同的亚型，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为λ链或κ链。本公开的抗体可以是任何上述种类或亚类。
[0037]
在一些实施方案中，本公开的抗体选自igg、iga、igm、ige和igd同种型。在一些实施方案中，本公开的抗体是igg，例如选自igg1、igg2、igg3和igg4亚型。
[0038]
如本文所用，术语“抗原结合片段”包括但不限于：fab片段，其具有vl、cl、vh和ch1域；fab'片段，其是在ch1域的c端具有一个或多个半胱氨酸残基的fab片段；fd片段，其具有vh和ch1域；fd'片段，其具有vh和ch1域和在ch1域的c端的一个或多个半胱氨酸残基；fv片段和scfv，其具有抗体的单一臂的vl和vh域；dab片段，其由vh域或vl域组成；分离的cdr区；f(ab')2片段，其是包含由铰链区处的二硫桥连接的两个fab'片段的二价片段；单链抗体分子(例如单链fv；scfv)；具有两个抗原结合位点的"二价抗体(diabody)"，其包含同一多肽链中与轻链可变域(vl)连接的重链可变域(vh)；"线性抗体"，其包含一对串联fd区
段(vh-ch1-vh-ch1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；和任何前述物质的修饰的形式，其保留了抗原结合活性。
[0039]
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗原结合片段选自fab 片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fd片段、fd’片段、fv片段、scfv片段、ds-scfv片段、dab 片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。
[0040]
在本公开的第二方面，提供了结合ox40的纳米抗体(nanobody，又称为单域抗体或 vhh)，其中所述纳米抗体包括具有选自seq id no:1-12所示的氨基酸序列的一个或多个cdr。
[0041]
在一些实施方案中，所述纳米抗体包括cdr1、cdr2以及cdr3，其中：
[0042]
所述cdr1具有seq id no:1,4,7或10所示的氨基酸序列；
[0043]
所述cdr2具有seq id no:2,5,8或11所示的氨基酸序列；和
[0044]
所述cdr3具有seq id no:3,6,9或12所示的氨基酸序列。
[0045]
在本公开的纳米抗体的一些实施方案中，所述纳米抗体包括：
[0046]
a)分别具有seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；
[0047]
b)分别具有seq id no:4、5和6所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；
[0048]
c)分别具有seq id no:7、8和9所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；或
[0049]
d)分别具有seq id no:10、11和12所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。
[0050]
在一些实施方案中，所述纳米抗体包括重链框架区，所述重链框架区的至少一部分来自小鼠抗体、骆驼抗体、人抗体、灵长类抗体或其突变体中的至少一种。
[0051]
在一些实施方案中，所述纳米抗体具有seq id no:13-16任一项所示的氨基酸序列或与seq id no:13-16任一项具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。例如，所述纳米抗体可以具有与seq id no:13-16任一项具有至少85％，至少90％，至少95，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
[0052]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgsifsvyvmgwfrqapgkgrelvaaitpfd dntyypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaadwewpeynywg qgtqvtvss(seq id no:13)。
[0053]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfifsayfmgwfrqapgkgrelvaainsnd dityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaawlgaenygywgq gtqvtvss(seq id no:14)。
[0054]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgsildsnlmgwfrqapgkgrelvasinsyd dntyypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaaqvfvgwpytdqm hdywgqgtqvtvss(seq id no:15)。
[0055]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgsiydfdvmgwfrqapgkgrelvaainsf gdityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaadwhvliqqvlgy wgqgtqvtvss(seq id no:16)。
[0056]
在本文中，seq id no:13所示氨基酸序列对应被称为ox40 bc3-1的纳米抗体；seqid no:14所示氨基酸序列对应被称为ox40 bc3-4的纳米抗体；seq id no:15所示氨基酸序列对应被称为ox40 bc3-6的纳米抗体；seq id no:16所示氨基酸序列对应被称为 ox40 bc3-7的纳米抗体。
[0057]
如本领域技术人员所理解的，两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性可以通过参数“序列一致性”描述。出可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列一致性的百分比。可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列一致性的百分比。此类数学算法的非限制性实例包括myers和miller(1988)cabios 4:11-17的算法、smith 等
(1981)adv.appl.math.2:482的局部同源性算法、needleman和wunsch(1970)j.mol. biol.48:443-453的同源性比对算法、pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci. 85:2444-2448的用于搜索同源性的方法、和karlin和altschul(1990)proc.natl.acad.sci. usa 87:2264的算法的修改形式，记载于karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-5877的算法。通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的实例包括但不限于 pc/gene程序的clustal、align程序(version 2.0)、和wisconsin遗传学软件包的gap、 bestfit、blast、fasta、和tfasta。可以例如通过使用初始参数实施使用这些程序的比对。
[0058]
例如，所述纳米抗体可以具有在seq id no:13-16任一项所示的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰不改变抗体的cdr序列，即在可变区的框架区(fr)中进行所述氨基酸修饰。
[0059]
在一些实施方案中，所述一个或几个氨基酸修饰是指1-10个氨基酸修饰或1-5个氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
[0060]
在一些实施方案中，所述氨基酸修饰选自氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是氨基酸取代，例如保守取代。此类保守取代优选为以下组(a)至(e)中的一个氨基酸残基被相同组中的另一个氨基酸残基的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala，ser，thr，pro和gly；(b)带负电荷的残基及其酰胺：asp，asn，glu和gln；(c)带正电荷的残基：his，arg和lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：met，leu，he，val和cys；(e)芳香族残基：phe，tyr和trp。
[0061]
在本公开的第三方面，提供了分离的核酸分子，其编码根据本公开的第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或根据本公开的第二方面的纳米抗体。在一些实施方案中，所述核酸分子为dna。在另一些实施方案中，所述核酸分子为rna。
[0062]
在一些实施方案中，所述核酸分子具有seq id no:17-20任一项所示的核苷酸序列或与seq id no:17-20任一项具有至少80％序列一致性的核苷酸序列。例如，所述核酸分子可以具有与seq id no:17-20任一项具有至少85％，至少90％，至少95，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。
[0063]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctct ctgagactgagctgtgccgcctccggctctatctttagtgtttatgttatgggctgg ttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctgctattaccccgtttg atgataatacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagac aacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacag ccgtgtattactgcgccgctgactgggaatggccggaatataattattggggacaa ggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:17)
[0064]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctct ctgagactgagctgtgccgcctccggctttatctttagtgcttattttatgggctgg ttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctgctattaactcgaatg atgatattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagaca acgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacagc cgtgtattactgcgccgcttggctgggtgctgaaaactatggctattggggacaag gcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:18)
[0065]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctct ctgagactgagctgtgccgcctccggcagtatcttagactctaatcttatgggctg gttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctagtattaactcgtat gatgataatacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagaga caacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacaca gccgtgtattactgcgccgctcaggttttcgttggttggccgtacactgaccagat gcatgactattggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:19)
[0066]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctct ctgagactgagctgtgccgcctccggcagtatctatgactttgatgttatgggctg gttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctgctattaactcgttt ggcgatattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagaga caacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacaca gccgtgtattactgcgccgctgactggcatgttctgatccagcaggttcttggttat tggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:20)
[0067]
具有seq id no:17所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seq id no:13所示氨基酸序列的纳米抗体；具有seq id no:18所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seq id no:14 所示氨基酸序列的纳米抗体；具有seq id no:19所示核苷酸序列的核酸分子编码具有 seq id no:15所示氨基酸序列的纳米抗体；具有seq id no:20所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seq id no:16所示氨基酸序列的纳米抗体。
[0068]
在本公开的第四方面，提供了核酸构建体或载体，例如表达载体，其包括根据本公开的第三方面的核酸分子。在一些实施方案中，所述载体是真核表达载体。在另一些实施方案中，所述载体是原核细胞表达载体。
[0069]
本文所用“载体”是指可以将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。而当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内获得表达。载体是本领域技术人员公认的、包括但不限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)柯斯质粒； (4)人工染色体，如酵母人工染色体、细菌人工染色体或p1来源的人工染色体；(5)噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及(6)动物病毒，如逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、孢疹病毒、痘病毒、杆状病毒。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不局限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因；此外，载体还可以含有复制起始位点。
[0070]
在本公开的第五方面，提供了细胞，其包括根据本公开第三方面的核酸分子或根据本公开第四方面的核酸构建体或载体，例如表达载体。
[0071]
在本公开的第六方面，提供了抗体缀合物，其包含本公开的结合ox40的抗体或抗原结合片段或纳米抗体，所述抗体或抗原结合片段或纳米抗体与任选的治疗剂，诊断剂或显像剂(例如细胞毒性分子、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质或酶)缀合。在一些实施方案中，所述治疗剂可以是细胞毒性分子，例如小分子化合物。
[0072]
在本公开的第七方面，提供了药物组合物，其包括本公开的结合ox40的抗体或抗原结合片段、纳米抗体或抗体缀合物，以及药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。
[0073]
短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，短语“药学上可接受的载体、
赋形剂和/或稀释剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂或溶剂包封材料，其涉及维持本公开的抗体或其抗原结合片段的稳定性、溶解度或活性。
[0074]
本公开的组合物可以经配制用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用。例如，本公开的组合物可以经配制用于肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制剂。
[0075]
在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的试剂。
[0076]
如本文所用，术语“化疗药物”是指具有在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中的治疗有用性的任何化学试剂。如本文所用的化学治疗剂包括化学剂和生物剂。这些试剂发挥功能以抑制癌细胞实现持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，以及各种抗新生物药物。
[0077]
在本公开的第八方面，提供了在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的结合ox40的抗体或抗原结合片段、纳米抗体、抗体缀合物或药物组合物的步骤。
[0078]
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性处理，其中目的是反转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的状况的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果减少一种或多种症状或临床标志物，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”，也就是说，“治疗”不仅包括症状的改善，而且还包括在缺乏治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的停止，至少减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减少疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、和缓解(不管是部分还是全部)，无论是可检测的还是检测不到的。
[0079]
如本文所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如人类。术语受试者还包括“非人哺乳动物”，例如如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。在优选的实施方案中，所述受试者是人类受试者。
[0080]
癌症的具体实例包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；胶质母细胞瘤；肝癌；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；b 细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病等。
[0081]
在优选的实施方案中，所述癌症选自结直肠癌和胶质母细胞癌。
[0082]
在上述方法的一些实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种另外的疗法的步骤。例如，在一些实施方案中，所述疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术疗法。
[0083]
在本公开的第九方面，提供了本公开的结合ox40的抗体或抗原结合片段、纳米抗
体、抗体缀合物或药物组合物，其用于在受试者中治疗癌症。在优选的实施方案中，所述癌症选自结直肠癌和胶质母细胞癌。
[0084]
在本公开的第十方面，提供了本公开的结合ox40的抗体或抗原结合片段、纳米抗体、抗体缀合物或药物组合物在制备用于在受试者中治疗癌症的药物中的用途。在优选的实施方案中，所述癌症选自结直肠癌和胶质母细胞癌。
[0085]
在本公开的第十一方面，提供了用于检测ox40的试剂盒，其包含本公开的结合 ox40的抗体或抗原结合片段、纳米抗体或抗体缀合物。
[0086]
在本公开的第十二方面，提供了本公开的结合ox40的抗体或抗原结合片段、纳米抗体或抗体缀合物在制备用于检测ox40的试剂盒中的用途。
[0087]
下面将描述更多的方面和优点，在所附附图的以下描述中，其至少一部分将是清楚的，和/或对于本领域普通技术人员而言，根据下文所述的实施例将是显而易见的。
附图说明
[0088]
图1为l929-hox40细胞株的人ox40蛋白表达的facs分析结果；
[0089]
图2为jurkat-hox40细胞株的人ox40蛋白表达的facs分析结果；
[0090]
图3为facs检测抗ox40纳米抗体与l929-hox40细胞株的结合反应的结果；
[0091]
图4为facs检测抗ox40纳米抗体与jurkat-hox40细胞株的结合反应的结果；
[0092]
图5为使用荧光素酶方法检测jurkat/nfkb-luc-hox40稳转细胞株经pma/ionomycin 刺激后nfkb re-luciferase的表达水平的结果；
[0093]
图6为facs检测jurkat/nfkb-luc-hox40稳转细胞株hox40的表达水平的结果；
[0094]
图7为facs检测l929-hcd32b稳转细胞株hcd32b的表达水平的结果；
[0095]
图8为nfkb报告基因实验检测抗ox40纳米抗体对nfkb信号通路的激活作用的结果；
[0096]
图9为使用nfkb报告基因方法，检测jurkat/nfkb-luc-hox40稳转细胞株中抗ox40 纳米抗体与hox40l竞争结合人ox40蛋白的结果；
[0097]
图10为facs检测l929-ox40细胞株中ox40纳米抗体与hox40l竞争结合人ox40蛋白的结果；
[0098]
图11为用facs检测经pha激活后t细胞表面ox40的表达水平的结果；
[0099]
图12为基于pbmc激活实验，用facs检测抗ox40纳米抗体与t细胞表面hox40的结合反应的结果；
[0100]
图13为facs检测抗ox40纳米抗体与经瞬时转染表达人ox40不同表位的cho-s细胞的结合的结果。
具体实施方式
[0101]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0102]
实施例1ox40 vhh-fc纳米抗体的制备
[0103]
1.噬菌体抗体库的筛选
[0104]
(1)将ox40-mfc蛋白(30μg/ml溶解于pbs，100μl/孔)包被于96孔nunc maxisorp免疫板上，4℃过夜；
[0105]
(2)用2％牛奶(溶解于pbs)室温封闭2h后，pbst清洗2-4次；
[0106]
(3)每个文库取约10
13
个噬菌体(溶解于2％牛奶；pbst)，加入至4个包被孔中，室温震荡孵育2h。
[0107]
(4)用pbst清洗包被板10次，然后每孔加入100μl 100mm hcl。室温震荡洗脱5min 后，吸出洗脱液至ep管中，并加入1/8体积的1.0m tris-hcl(ph 11)进行中和；
[0108]
(5)用洗脱的噬菌体侵染3ml处于对数生长期的感受态大肠杆菌ss320(od600不超过1.0)。37℃，220rpm培养30min后取出200μl侵染产物保存。向剩余菌液加入 m13ko7辅助噬菌体(终浓度至10
10
个/ml)继续培养1h。
[0109]
(6)将上述培养液转移接种至50ml 2yt培养基(carb

，kan

)中,37℃，220rpm 过夜培养。
[0110]
(7)重复步骤(1)至步骤(6)进行第二轮和第三轮的筛选。
[0111]
(8)三轮筛选后将第二、三轮的侵染产物分别涂布到lb/carb

平板上，37℃过夜培养；
[0112]
(9)次日挑菌至包含浓度为10
10
个/ml的辅助噬菌体的2yt培养基(carb

)中过夜培养。
[0113]
(10)用elisa方法鉴定单克隆培养上清中噬菌体与ox40-mfc的结合，挑选阳性克隆进行sanger测序。
[0114]
通过三个批次的重复筛选(每个批次筛选3轮)，共得到对ox40-mfc具有高结合活性的4个不同的阳性克隆序列(见表1)。
[0115]
表1.抗体克隆的结合活性和序列
[0116]
[0117][0118]
2.vhh-fc抗体表达纯化
[0119]
用pcr方法扩增噬菌体上清中上述的4个阳性克隆vhh核苷酸序列，用in
‑‑
hd cloning kit试剂盒(购自takara)融合至带有编码接头和人igg fc片段(hfc)的 cmv-12gs-fc载体上。随后将构建好的质粒对expicho细胞并配套转染试剂盒(购自 gibco)进行瞬时蛋白分泌表达并扩大培养，7天后收集细胞培养液，4000rpm离心15分钟去除细胞杂质等成分，得到含有ox40蛋白胞外区的培养上清液。
[0120]
将收获的ox40上清液上样到protein a亲和层析柱(购自ge)，同时检测紫外吸收值的变化(a280nm)，并用20mm醋酸钠(ph3.5)洗脱，进而得到上述4种靶向ox40的人源化纳米抗体。
[0121]
实施例2ox40 vhh-fc抗体与表达ox40的细胞株的特异性结合
[0122]
2.1表达ox40蛋白的稳定细胞株的构建
[0123]
将编码全长人ox40蛋白的氨基酸序列(序列来源于ncbi数据库，蛋白序列号为 np_003318.1)的核苷酸序列克隆到pcmv3-hygromycin载体以制备携带人ox40蛋白编码序列的质粒(此处称为pcmv3-hox40-hygro)。使用上述质粒分别转染l929和jurkat 细胞系。转染后的l929和jurkat细胞分别在含500μg/ml潮霉素的dmem 10％fbs和 rpmi1640 10％fbs培养液中选择性培养，一周后挑取存活的细胞。用有限稀释法在96 孔培养板中进行克隆，约2周后选择部分单克隆扩增至24孔板中，并在约3～4天后扩增至 6孔板中。对扩增后的单克隆用抗人ox40抗体经流式检测进行筛选。选择长势较好，荧光强度较高，单克隆的细胞系继续扩大培养(潮霉素浓度减半)并液氮冻存。得到表达人 ox40蛋白的l929和jurkat稳定细胞株，称为l929-hox40和jurkat-hox40稳定细胞株。
[0124]
如图1和图2中的结果所示，筛选得到的l929-hox40和jurkat-hox40细胞株稳定表达人ox40。
[0125]
2.2facs检测抗体与l929-hox40细胞的结合
[0126]
将实施例2.1中构建的l929-hox40稳定细胞株在细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度。使用pbs洗涤后，用0.25％trypsin(购自thermofisher)消化成单细胞悬液，用含10％ fbs培养液进行中和后进行计数。1000rpm离心5分钟后用facs缓冲液(pbs 1％fbs) 重悬至2
×
106细胞/ml，以每孔200μl加入96孔facs培养板中，1000rpm离心5分钟后去上清。加入一系列浓度梯度的抗人ox40待测抗体或同种型对照，每孔200μl，4℃避光孵育1小时。1000rpm离心5分钟后加入每孔200μl pe荧光标记的抗人fc二抗(购自 invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用facs缓冲液洗涤2次，随后加入每孔200μl含1％多聚甲醛的pbs缓冲液重悬细胞，用facs仪器(bd accuri c6)进行检测和分析。
[0127]
结果如图3所示，抗人ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6和bc3-7均能够特异性结合细胞表面的hox40蛋白。其中同种型对照为人igg，阳性对照为moxr-0916，图中的mfi 为所测细胞群的平均荧光强度值。抗体与l929-hox40细胞结合的最大平均荧光强度值和ec50值如表2中所示。
[0128]
表2:抗体与稳定表达ox40蛋白的l929-hox40细胞株的结合
[0129][0130]
2.3facs检测抗体与jurkat-hox40细胞的结合
[0131]
将实施例2.1中构建的jurkat-hox40稳定细胞株在细胞培养瓶中扩大培养，取对
数生长期的细胞进行计数。将细胞1000rpm离心5分钟后用facs缓冲液(pbs 1％fbs)重悬至2
×
106细胞/ml，以每孔200μl加入96孔facs培养板中。1000rpm离心5分钟后去上清，加入一系列浓度梯度的抗人ox40纯化待测抗体或同种型对照，每孔200μl，4℃避光孵育1小时，1000rpm离心5分钟后加入每孔200μl pe荧光标记的抗人fc二抗(购自 invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用facs缓冲液洗涤2次，加入每孔200μl含1％多聚甲醛的pbs缓冲液重悬细胞，用facs仪器(bd accuri c6)进行检测和分析。
[0132]
结果如图4所示，抗人ox40待测抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6和bc3-7均能够特异性结合细胞表面的hox40蛋白。其中同种型对照为人igg，阳性对照为moxr-0916，图中的 mfi为所测细胞群的平均荧光强度值。抗体与jurkat-hox40细胞株结合的最大平均荧光强度值和ec50值如表3中所示。
[0133]
表3：抗体与稳定表达ox40蛋白的jurkat-hox40细胞株结合
[0134][0135][0136]
实施例3ox40 vhh-fc抗体激活nf-kb信号通路
[0137]
3.1jurkat/nfkb-luc-hox40稳定细胞系的构建
[0138]
将pgl4.32[luc2p/nf-kb-re/hygro]质粒(购自promega)转染至jurkat细胞，用含潮霉素和10％fbs的rpmi1640培养液进行培养，筛选得到稳定表达nf-kb-re-luc的jurkat 细胞株jurkat/nf-kb-luc。进一步构建ox40慢病毒质粒，包装慢病毒后感染jurkat-nf-kb
‑ꢀ
luc细胞。将感染的细胞用含潮霉素和10％fbs的rpmi1640培养液培养，筛选得到稳定表达nf-kb-re-luc和ox40的jurkat细胞株，称为jurkat/nf-kb-luc-hox40。
[0139]
图5显示了nf-kb报告基因的实验结果，表明筛选得到的jurkat/nf-kb-luc-hox40细胞株稳定表达nf-kb-re荧光素酶。图6显示了facs检测结果。该结果表明筛选得到的 jurkat/nf-kb-luc-hox40细胞株稳定表达hox40。
[0140]
3.2l929-cd32b稳定细胞系的构建
[0141]
使用携带hcd32b基因的质粒转染l929细胞系。转染的细胞在含600μg/ml潮霉素的dmem 10％fbs培养基中选择性培养，挑取存活的细胞进行克隆，用有限稀释法在 96孔培养板中进行亚克隆。约2周后选择部分单克隆扩增至24孔板中，并在约3～4天后扩增至6孔板中。对扩增后的克隆用cd32b抗体(购自stemcell)经流式检测进行筛选。图 7显示了facs检测结果，表明筛选得到的l929-hcd32b细胞株稳定表达hcd32b。
[0142]
3.3nf-kb报告基因实验
[0143]
将实施例3.2中筛选得到的l929-hcd32b细胞扩大培养，收集细胞后用含10％fbs的 dmem培养液重悬，将细胞以2
×
104/孔的密度接种于96孔培养板中。过夜后弃去上清，以5
×
104/孔的细胞密度加入3.1中筛选得到的jurkat/nf-kb-luc-hox40细胞，再加入一系列浓度梯度的抗人ox40待测抗体或同种型对照，放入co2细胞培养箱中继续培养5小时。用one-glo荧光素酶检测系统(购自promega)测定荧光素酶的含量。
[0144]
结果如图8所示，其中同种型对照为人igg，阳性对照为moxr-0916，rlu代表相对的发光信号值。该结果表明抗人ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6和bc3-7均能够显著激活nf-kb信号通路。
[0145]
表4：抗体激活nf-kb信号通路
[0146]
抗体最大值(rlu)ec
50
(pm)同种型对照2650/bc3-153365209.2bc3-455747175.1bc3-650273162.4bc3-748390129.8moxr-091629821216.9
[0147]
实施例4抗人ox40抗体对ox40和ox40l蛋白结合的抑制作用
[0148]
4.1通过报告基因法检测抗人ox40抗体对ox40和ox40l蛋白结合的抑制作用
[0149]
使用实施例3.1构建的jurkat/nf-kb-luc-hox40细胞，以5
×
104/孔的细胞密度加入96 孔细胞培养板中。将稀释至0.3μ./ml浓度的ox40l蛋白和一系列梯度稀释的抗人ox40 抗体或同种型对照同时加入细胞，在co2培养箱中孵育5小时后进行荧光素酶含量测定。结果如图9所示，该结果表明抗人ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6和bc3-7能够抑制 ox40l与ox40的结合，表明这些抗体与ox40l存在表位竞争关系。
[0150]
4.2facs检测抗人ox40抗体对ox40和ox40l蛋白结合的抑制作用
[0151]
将实施例2.1中构建的l929-hox40稳定细胞株在细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度。细胞使用pbs洗涤后，用0.25％trypsin(购自thermofisher)消化为单细胞悬液，用含 10％fbs培养液进行中和后进行计数。将细胞以1000rpm离心5分钟后用facs缓冲液 (pbs 1％fbs)重悬至2
×
106细胞/ml。按照每孔200μl加入96孔facs培养板中， 1000rpm离心5分钟后弃上清，同时加入0.5μg/ml浓度的抗人ox40抗体或同种型对照和一系列梯度稀释的ox40l蛋白，4℃避光孵育1小时。1000rpm离心5分钟后加入每孔200μlpe荧光标记的抗人fc二抗(购自invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用facs缓冲液洗涤2 次，每孔加入200μl含1％多聚甲醛的pbs缓冲液重悬细胞，用facs仪器(bd accuri c6) 进行检测和分析。
[0152]
结果如图10所示。该结果表明抗人ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6和bc3-7均与 ox40l竞争与ox40的结合，进一步表明这些抗体与ox40l存在表位竞争关系。
[0153]
实施例5抗人ox40抗体与t细胞表面的ox40结合
[0154]
5.1将冻存的pbmc细胞(购自allcells)以0.5
×
106个细胞/ml的接种密度复苏于含10％fbs的rpmi 1640培养液中，同时添加2μg/ml的pha和2μg/ml的il-2，放置培养箱中孵育48小时后收集细胞。将细胞以1000rpm离心5分钟后用facs缓冲液(pbs 1％fbs) 重悬至2
×
106细胞/ml，按照每孔200μl加入96孔facs培养板中。1000rpm离心5分钟后弃上清，以每孔5ul的体积加入apc荧光标记的a抗人ox40抗体(购自biolegend)，检测经 pha激活pbmc中的t细胞后，t细胞表面ox40的表达水平。
[0155]
结果如图11所示，表明静息的t细胞不表达ox40。经pha激活后，活化的t细胞表达高水平的ox40。
[0156]
5.2将冻存的pbmc细胞(购自allcells)以0.5
×
106个细胞/ml的接种密度复苏于含 10％fbs的rpmi 1640培养液中，同时添加2μg/ml的pha和2μg/ml的il-2，放置培养箱中孵育48小时后收集细胞。将细胞以1000rpm离心5分钟后用facs缓冲液(pbs 1％fbs) 重悬至3
×
106细胞/ml，按照每孔200μl加入96孔facs培养板中。1000rpm离心5分钟后弃上清，加入一系列梯度稀释的抗ox40抗体，4℃避光孵育1小时；1000rpm离心5分钟后加入每孔200μl pe荧光标记的抗人fc二抗(购自invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用 facs缓冲液洗涤2次，每孔加入200μl含1％多聚甲醛的pbs重悬细胞，用facs仪器(bdaccuri c6)进行检测和分析。
[0157]
结果如图12所示，图中的mfi为所测细胞群的平均荧光强度值。该结果表明，抗人 ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6和bc3-7能够以浓度依赖的方式特异性结合活化后的t 细胞表面的hox40蛋白。
[0158]
实施例6抗人ox40抗体的抗原表位鉴定
[0159]
6.1构建表达人ox40不同结构域的质粒
[0160]
以pcmv3质粒为骨架，构建缺失crd1结构域的ox40(人源)截短型表达载体，命名为pcmv3-sp-ox40(crd2-3-4)(human)；构建缺失crd1和crd2(人源)的截短型表达载体，命名为pcmv3-sp-ox40(crd3-4)(human)；构建缺失人源cdr1和crd2，用鼠源crd3替代人源crd3，且包含人源crd4结构域的嵌合型表达载体，命名为pcmv3
‑ꢀ
sp-ox40(crd3mus-crd4human)；构建鼠源全长ox40表达载体，命名为pcmv3
‑ꢀ
ox40(mus)；构建人源全长ox40表达载体，命名为pcmv3-ox40(human)。
[0161]
6.2facs鉴定抗人ox40抗体的抗原表位
[0162]
ox40表达载体的瞬时转染：复苏cho-s细胞，传代至少2次后，将细胞以1
×
106细胞 /孔的密度接种到6孔板中。第二天用pei转染的方法将以上表达ox40的不同结构域的表达载体转染至cho-s细胞中。转染后24h，将抗人ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6、bc3
‑ꢀ
7与转染细胞孵育，并通过facs检测抗体与细胞的结合。如图13中的结果所示，抗人 ox40抗体bc3-1、bc3-4、bc3-6、bc3-7与chos-ox40(crd2-3-4human)和chos
‑ꢀ
ox40(human)结合，而与chos，chos-ox40(mus),chos-ox40(crd3-4human)和 chos-ox40(crd3mus-crd4human)均不结合。上述结果表明bc3-1,bc3-4,bc3-6和 bc3-7与ox40的抗原表位位于crd2中。
[0163]
在本技术全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献，已发布的专利，已公开的专利申请和同时待审的专利申请)的内容在此明确地全文引入作为参考。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均与本领域普通技术人员通常已知的含义一致。
[0164]
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在所附权利要求的范围内。
[0165]
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