激光捕获显微切割方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种激光捕获显微切割方法。


背景技术：

2.目前，激光捕获显微切割技术是通过显微镜选择靶细胞，之后划出所需要的目标区域，激光沿着所划的轨迹切割细胞到收集管中，再进行下游分析，实现快速方便地从组织切片中分离和纯化单一类型的细胞群或单个细胞，无组织类型的限制，应用颇广。
3.但是由于激光能量较高，对组织目标区域的生物完整性均有一定的破坏，对后续的下游分析造成影响；现有的直接切片设置有保护膜，可对目标区域进行切割获取，但是，由于直接切片的价格高昂，增加成本，不利用推广应用。


技术实现要素：

4.本发明提供一种激光捕获显微切割方法，用以解决现有技术中直接切片中设置保护膜导致成本高昂的缺陷，实现降低取样成本，同时保证切割部位组织细胞的生物学完整性，提高下游结分析的准确性。
5.本发明提供一种激光捕获显微切割方法，包括如下步骤：s10、确定组织的目标区域，控制激光捕获显微切割仪对目标区域外侧的组织进行切割，形成第一切割边界；s20、若第一切割边界与目标区域的轮廓重合，则在第一切割边界的外侧划定第二切割边界；若第一切割边界大范围大于目标区域的轮廓范围，则在第一切割边界内侧，沿目标区域的轮廓划定第二切割边界；控制激光捕获显微切割仪沿第二切割边界进行切割；s30、控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行切割清除，获得组织切片；s40、对组织切片进行处理，以备下游分析。
6.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s10步骤中，还包括：将组织放置于载玻片上，且组织的目标区域与载玻片贴合。
7.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，s20步骤中，还包括：若在第一切割边界的外侧划定第二切割边界，则采用标记笔划定第二切割边界；若沿目标区域的轮廓划定第二切割边界，则在所述s10步骤中，采用标记笔划定第一切割边界。
8.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s30步骤中，具体包括：控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行切割成多个组织块，进而对组织块进行清除，获得组织切片。
9.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s40步骤包括如下步骤：s41、将组织切片放入染色罐的去离子水中，经设定时间后，取出组织切片，将载玻
片背面和组织切片周围的去离子水去除，完成对组织切片的再水化。
10.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s41步骤中，设定时间大于或等于5分钟。
11.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s40步骤还包括如下步骤：s42、通过移液枪将组织切片从载玻片上取下，并将取下的组织切片收集成球形结构，放入收集管，以备下游分析。
12.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s42步骤还包括如下步骤：s421、标记收集管，将设定长度的移液枪头装配于移液器上，在移液枪头的尖端注入设定体积的去离子水。
13.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述收集管的容积为0.65毫升，所述移液器的容积为20微升~1000微升，所述移液枪头的设定长度为0.5厘米~1厘米，所述去离子水的设定体积为20微升~60微升。
14.根据本发明提供的一种激光捕获显微切割方法，所述s42步骤还包括如下步骤：s422、将移液枪头的尖端与组织切片相对放置，在载玻片上滴加等离子水，使组织切片漂浮于等离子水中，释放移液器的柱塞，将等离子水和组织切片吸入移液枪头的尖端，再将移液枪头内的等离子水和组织切片放入收集管内，对收集管上盖，以备下游分析。
15.本发明的有益效果如下：本发明提供的激光捕获显微切割方法，包括如下步骤：s10、确定组织的目标区域，控制激光捕获显微切割仪沿目标区域的轮廓对组织进行切割，形成第一切割边界；s20、若第一切割边界与目标区域的轮廓重合，则在第一切割边界的外侧划定第二切割边界；若第一切割边界大范围大于目标区域的轮廓范围，则在第一切割边界内侧，沿目标区域的轮廓划定第二切割边界；控制激光捕获显微切割仪沿第二切割边界进行切割；s30、控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行切割成多个组织块，进而对组织块进行清除，获得组织切片；s40、对组织切片进行处理，以备下游分析，省去保护膜的设置，降低取样成本，同时保证了组织的目标区域切割部位组织细胞的生物学完整性，提高下游结分析的准确性。
16.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1是本发明提供的激光捕获显微切割方法的流程示意图。
具体实施方式
19.下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
20.在本发明实施例的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明实施例的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
21.在本发明实施例的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明实施例中的具体含义。
22.在本发明实施例中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
23.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明实施例的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
24.如图1所示，本发明提供一种激光捕获显微切割方法，包括如下步骤：s10、确定组织的目标区域，控制激光捕获显微切割仪对目标区域外侧的组织进行切割，形成第一切割边界；s20、若第一切割边界与目标区域的轮廓重合，则在第一切割边界的外侧划定第二切割边界；若第一切割边界大范围大于目标区域的轮廓范围，则在第一切割边界内侧，沿目标区域的轮廓划定第二切割边界；控制激光捕获显微切割仪沿第二切割边界进行切割；s30、控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行切割清除，获得组织切片；s40、对组织切片进行处理，以备下游分析。
25.在一个实施例中，所述s10步骤中，还包括：将组织放置于载玻片上，且组织的目标区域与载玻片贴合。
26.在一个实施例中，所述s10步骤中，还包括：在控制激光捕获显微切割仪沿目标区域的轮廓对组织进行切割过程中，实时观察切割进度。
27.在一个实施例中，所述s20步骤中，还包括：
若在第一切割边界的外侧划定第二切割边界，则采用标记笔划定第二切割边界；若沿目标区域的轮廓划定第二切割边界，则在所述s10步骤中，采用标记笔划定第一切割边界。
28.在一个实施例中，所述s30步骤中，具体包括：控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行切割成多个组织块，进而对组织块进行清除，获得组织切片。
29.在一个实施例中，所述s40步骤包括如下步骤：s41、将组织切片放入染色罐的去离子水中，经设定时间后，取出组织切片，将载玻片背面和组织切片周围的去离子水去除，完成对组织切片的再水化。
30.在一个实施例中，所述s41步骤中，设定时间大于或等于5分钟。
31.在一个实施例中，所述s40步骤还包括如下步骤：s42、通过移液枪将组织切片从载玻片上取下，并将取下的组织切片收集成球形结构，放入收集管，以备下游分析。
32.在一个实施例中，所述s42步骤还包括如下步骤：s421、标记收集管，将设定长度的移液枪头装配于移液器上，在移液枪头的尖端注入设定体积的去离子水。
33.在一个实施例中，所述收集管的容积为0.65毫升，所述移液器的容积为20微升~1000微升，所述移液枪头的设定长度为0.5厘米~1厘米，所述去离子水的设定体积为20微升~60微升。
34.在一个实施例中，所述s42步骤还包括如下步骤：s422、将移液枪头的尖端与组织切片相对放置，在载玻片上滴加等离子水，使组织切片漂浮于等离子水中，释放移液器的柱塞，将等离子水和组织切片吸入移液枪头的尖端，再将移液枪头内的等离子水和组织切片放入收集管内，对收集管上盖，以备下游分析。
35.本发明体用的一种激光捕获显微切割方法，具体包括如下步骤：s10、确定组织的目标区域，再将组织放置于载玻片上，使得组织的目标区域与载玻片的正面贴合，需要说明的是，载玻片的承载面积大于第二切割边界的面积。
36.操作激光捕获显微切割仪，进入软件的区域烧蚀消融部分，并取消消融复选框，将载玻片放置于激光捕获显微切割仪的显微切割平台，启动显微切割功能，其中，需要说明的是，载玻片倒置，即组织与显微切割平台接触，载玻片位于组织的上方，载玻片的背面朝上，激光捕获显微切割仪发射的激光由下向上进行发射，并对应照射于组织上。
37.选择激光捕获显微切割仪的切割活动组功能，激光沿目标区域的轮廓对组织进行切割，完成切割后，组织对应的切割部形成第一切割边界，不会对目标区域内的靶细胞造成损伤，保证目标区域的生物完整性。需要说明的是，由于组织的一部分与载玻片贴合，且贴合力大于组织的自身重力，所以完成第一次切割后的目标区域的外侧的组织不会掉落。
38.在控制激光捕获显微切割仪沿目标区域的轮廓对组织进行切割过程中，实时观察切口，实现对切割进度的观察，当完成对目标区域的组织轮廓的完全切割后，关闭激光捕获切割仪。
39.s20、取下载玻片，通过标记笔在组织上划定第二切割边界，第二切割边界位于第一切割边界的外侧，也就是说，第二切割边界内的面积大于第一切割边界内的面积。
40.需要再次说明的是，组织放置于载玻片上时，需要保证第二切割边界内的组织部分与载玻片全部贴合，保证贴合力大于组织的重力。
41.操作激光捕获切割仪，进入软件的区域烧蚀消融部分，并取消消融复选框，启动显微切割功能，将载玻片倒置于激光捕获显微切割仪的显微切割平台，控制激光沿第二切割边界进行第二次切割。
42.完成第二次切割后，第二切割边界周围的组织自动掉落至回收管内，此时，第二切割边界内的组织依旧保持与载玻片的贴合。
43.需要说明的是，为了便于描述，设定第一切割边界与第二切割边界之间为消融区域。
44.s30、控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织，即对消融区域内的组织进行切割，以形成多个组织块，进而对组织块进行消融清除，确保消融区域内的组织完全脱离载玻片，并掉落至回收管内，最终目标区域内的组织为组织切片，且组织切片依旧保持与载玻片的贴合，关停激光捕获显微切割仪，取下载玻片。
45.s40、对载玻片上的组织切片进行处理，以备下游分析。具体的，包括如下步骤：s41、将载玻片和组织切片均放入染色罐的去离子水中，浸泡设定时间，设定时间大于或等于5分钟。本实施例中，设定时间为5分钟。
46.完成浸泡后，将载玻片和组织切片取出，此时，组织切片仍与载玻片保持贴合。将载玻片背面和组织切片周围的去离子水去除，完成对组织切片的再水化。
47.需要说明的是，可采用卫生棉或卫生纸对载玻片背面和组织切片周围的去离子水进行清理，组织切片上需残留去离子水。本实施例中，采用卫生纸进行清理。
48.s42、通过移液枪将组织切片从载玻片上取下，并将取下的组织切片收集成球形结构，放入收集管，以备下游分析。具体的，包括如下步骤：s421、准备收集装置，标记容积为0.65毫升的收集管，在容积为20微升~1000微升的加样枪头的尖端切下长度0.5厘米~1厘米，作为移液枪头，并将移液枪头对应装配于移液器上，移液器的容积为20微升~1000微升。
49.向移液器中注入20微升~60微升的去离子水。
50.本实施例中，选用容积为200微升的加样枪头的尖端进行切取，切取的移液枪头长度为1厘米，移液器的容积为40微升，向移液器中注入40微升的去离子水。
51.用上述制备的收集装置进行组织切片的刮取，通过移液枪头的尖端对组织切片进行刮取，使组织切片与载玻片分离。
52.需要说明的是，若刮取困难，可采用刀片进行辅助刮取，分离的铣刨形成一团组织碎片或分离的薄片，通过操作移液枪头的尖端，将组织切片汇集成一个球形结构，以确保组织切片与载玻片的脱离。
53.s422、收集组织切片的组织细胞，将移液枪头的尖端靠近组织切片，并保持相对设置。挤压移液器，在载玻片上释放移液器内的去离子水，使球形结构的组织切片漂浮在去离子水上，需要说明的是，不可将移液器内的去离子水全部释放，同时，不可让移液枪头与去离子水分离。
54.再将移液器的柱塞迅速释放，使得载玻片上的去离子水和球形结构的组织切片被移液器吸回至移液枪头的尖端。
55.再将移液枪头内的等离子水和组织切片放入收集管内，对收集管上盖，以备下游分析。
56.在一个具体实施例中，先用标记笔划定第二切割边界，控制激光捕获显微切割仪沿第二切割边界进行切割，使第二切割边界外侧的组织依靠自身重力脱离载玻片；再控制激光捕获显微切割仪沿目标区域的轮廓对组织进行切割，形成第一切割边界。可以理解的是，本发明提供的激光捕获显微切割方法中，可优先沿目标区域的轮廓进行切割，再对目标区域以外的组织进行切割；也可优先对目标区域以外的组织进行切割，再沿目标区域的轮廓进行切割。
57.在一个具体实施例中，可控制激光捕获显微切割仪对位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行整体消融清除。
58.需要说明的是，本发明中的载玻片为相比于直接切片价格低廉的普通玻片以及其他廉价玻片，均适用于本方法。
59.本发明提供的激光捕获显微切割方法，包括如下步骤：s10、确定组织的目标区域，控制激光捕获显微切割仪对目标区域外侧的组织进行切割，形成第一切割边界；s20、若第一切割边界与目标区域的轮廓重合，则在第一切割边界的外侧划定第二切割边界；若第一切割边界大范围大于目标区域的轮廓范围，则在第一切割边界内侧，沿目标区域的轮廓划定第二切割边界；控制激光捕获显微切割仪沿第二切割边界进行切割；s30、控制激光捕获显微切割仪将位于第一切割边界和第二切割边界之间的组织进行切割清除，获得组织切片；s40、对组织切片进行处理，以备下游分析，省去保护膜的设置，降低取样成本，同时保证了组织的目标区域切割部位组织细胞的生物学完整性，提高下游结分析的准确性。
60.以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。
61.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。