一种基于反向PCR技术验证基因敲除转化子的方法

一种基于反向pcr技术验证基因敲除转化子的方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种基于反向pcr技术验证经同源重组原理获得的基因敲除转化子的方法，更具体地，涉及一种基于反向pcr技术验证经同源重组原理获得的甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子的方法，尤其是涉及甘蔗鞭黑粉菌sshos2基因同源重组敲除转化子验证。


背景技术：

2.甘蔗是重要的经济作物，中国甘蔗的种植面积在世界范围内排第三位，国内甘蔗种植面积占总糖料种植面积的86％。每年因为真菌病害的发生，造成甘蔗产量巨大的经济损失。甘蔗真菌性病害中以甘蔗鞭黑粉病最为严重。经鉴定其病原菌是担子菌门甘蔗鞭黑粉菌。甘蔗鞭黑粉菌担孢子通过有性配合形成双核菌丝后具有侵染甘蔗的能力。然而田间想要获得更好的防治效果，就需要充分了解影响其致病性的分子机理。在植物病理学研究中，反向遗传学是研究真菌致病性的重要手段之一。在甘蔗鞭黑粉菌致病性机理研究中，通过基因敲除了解目的基因在甘蔗鞭黑粉菌中的功能也是了解甘蔗鞭黑粉菌致病机理最直接有效的方法。
3.基因敲除主要涉及基因鉴定、基因敲除、转化子验证、表型分析。由于基因敲除效率尤其是在甘蔗鞭黑粉菌研究中基因敲除效率不高，因此往往需要通过大量筛选基因突变转化子来获得成功的基因缺失突变体。在转化子验证中，现有技术中通常是以southern blot作为转化子验证的主要手段，例如中国专利cn103525854a公开了采用southern blot对高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株进行验证，southern blot主要实验步骤为：1)dna提取2)dna消解3)探针标记4)分子杂交5)免疫显色。由于southern blot实验过程中需要的试剂成本较高且实验过程持续约一周时间，这严重影响了后续实验的进程。因此在甘蔗鞭黑粉菌的基因敲除研究中亟需提供一种成本低、高通量、高效率、准确性高的基因敲除转化子验证方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服甘蔗鞭黑粉菌研究中现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于反向pcr技术验证基因敲除转化子的方法。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
6.一种基于反向pcr技术验证同源重组基因敲除转化子的方法，包括如下步骤：
7.s1.通过目的基因检测引物检测经基因同源重组原理获得的基因敲除转化子是否含有目的基因，进行初步验证；
8.s2.随机挑选不含目的基因的转化子进行摇菌培养，离心收集菌体，提取基因组dna，通过后续反向pcr验证其正确性；
9.s3.在同源重组的抗性基因标签上设计反向pcr扩增引物，再在反向pcr扩增引物设计位点外侧的序列上选取相同的限制性内切酶位点，要求一侧的限制性内切酶位点位于
其中一个同源臂附近的基因组上，另一侧的限制性内切酶位点位于抗性基因标签上，且在反向pcr扩增引物设计位点内侧的序列上不存在该相同的限制性内切酶位点；
10.s4.采用步骤s3选取的限制性内切酶位点对应的限制性内切酶对步骤s2的基因组dna进行消解，消解后再对限制性内对切酶失活处理，接着用dna连接酶连接成环状dna分子；
11.s5.以步骤s4连接后的环状dna分子为模板，采用步骤s3设计的反向pcr扩增引物进行pcr扩增反应，再将pcr产物电泳检测，若扩增条带与预设大小一致，则判定敲除成功，反之，则判定敲除不成功。
12.本发明通过对反向pcr技术进行优化使其成功应用于经同源重组原理获得的基因敲除转化子验证中，通过在已知的同源重组抗性基因标签上设计反向pcr扩增引物，再在反向pcr扩增引物两侧选择相同的限制性内切酶位点，要求其中一个限制性内切酶位点位于同源臂附近基因组位置上，另一个限制性内切酶位点位于抗性基因标签上，根据反向pcr扩增引物及酶切位点的位置，得到预设的扩增片段大小，再根据检测实际的转化子样品，若检测的电泳条带单一且与预设大小一致，可判定为基因敲除成功，即成功获得基因敲除转化子。
13.优选地，步骤s4 dna消解为将基因组dna在含限制性内切酶的消解体系中36℃～38℃孵育3～5小时。
14.进一步优选地，步骤s4 dna消解为将基因组dna在含限制性内切酶的消解体系中37℃孵育3～5小时。
15.优选地，所述消解体系为基因组dna1μg，限制性内切酶1μl，cutsmart buffer3μl，ddh2o补至30μl。
16.优选地，步骤s4对限制性内切酶失活处理采用热失活的方式。不同的限制性内切酶失活的温度不同，一般在65～80℃下20～30min就可失活。
17.优选地，步骤s4所述dna连接酶为t4-dna连接酶。
18.进一步优选地，dna连接酶连接体系为t4 dna连接酶1μl，t4-dna连接酶缓冲液2μl，dna消解产物10μl，ddh2o补至20μl。
19.进一步优选地，dna连接酶连接条件为15～17℃孵育6～12h。
20.再优选地，dna连接酶连接条件为16℃孵育过夜。
21.优选地，要求选择的限制性内切酶位点使酶切、连接环状后的dna分子一般不超过4kb。由于普通pcr的实际上限为3～4kb，因此选择合适的限制性内切酶以产生大小适于环化及反向pcr的片段的末端片段。有时候为产生对反向pcr大小适当的dna片段可采用两种限制性内切酶消化处理，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用klenow或噬菌体t4dna聚合酶修理。
22.优选地，所述基因敲除转化子为甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明将反向pcr技术成功应用于经基因同源重组原理获得的基因敲除转化子的验证中，通过在已知的同源重组抗性基因标签上设计反向pcr扩增引物，再在反向pcr扩增引物两侧选择相同的限制性内切酶位点，要求其中一个限制性内切酶位点位于同源臂附近基因组位置上，另一个限制性内切酶位点位于抗性基因标签上，根据反向pcr扩增引物及酶
切位点的位置，得到预设的扩增片段大小，再根据检测实际的转化子样品，若检测的电泳条带单一且与预设大小一致，可判定为基因敲除成功，即成功获得基因敲除转化子。相比于通过southern blot方法验证基因敲除转化子，反向pcr在实施过程中有着众多优势：成本低、高通量、高效率、准确性高等，尤其适用于经基因同源重组原理获得的甘蔗鞭黑粉菌转化子的验证。
附图说明
25.图1为实施例2通过反向pcr验证sshos2基因缺失突变体酶切位点的位置及反向pcr凝胶电泳结果图。其中图1中a为酶切位点在同源重组的sshos2基因缺失突变体序列中的位置图，b为反向pcr凝胶电泳结果图。
26.图2为实施例2sshos2缺失突变体菌落结果图。
具体实施方式
27.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
28.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
29.实施例1反向pcr技术验证基因敲除转化子的设计
30.1、酶切位点选择及引物设计：在同源重组的抗性基因标签上设计反向pcr扩增引物，再在反向pcr扩增引物设计位点外侧的序列上选取相同的限制性内切酶位点，要求其中一个限制性内切酶位点位于其中一个同源臂附近的基因组上，另一个限制性内切酶位点位于抗性基因标签上，且在反向pcr扩增引物设计位点内侧的序列上不存在该相同的限制性内切酶位点。
31.2、采用反向pcr技术进行检测，具体包括如下步骤：
32.1)dna消解需要37℃孵育3～5小时，消解反应体系如下表1所示：
33.表1反向pcr dna消解体系
[0034][0035]
*以neb内切酶为例
[0036]
2)在进行消解dna连接前需要对消解体系内的内切酶失火。内切酶失活采用热失活的方法(以neb公司的ecoliⅰ为例，失活条件为65℃20分钟)。失活后根据表2配制连接体系，配制好的连接体系16℃孵育过夜。连接体系如下表2所示：
[0037]
表2反向pcr连接体系
[0038][0039][0040]
*以neb dna连接酶为例
[0041]
3)连接后的消解产物，取1μl作为模板即可。pcr结束通过凝胶电泳分离片段，根据dnamarker判断条带大小是否与预设大小一致，进一步确认可以通过测序。具体体系如下表3所示：
[0042]
表3反向pcr体系和pcr程序
[0043][0044]
*注：退火温度以及延伸时间根据实际条带大小改动
[0045]
实施例2sshos2基因缺失突变体验验证
[0046]
本实施例以sshos2(ncbi no.:spsc_01917)基因缺失突变体验证为例，具体步骤如下：
[0047]
根据甘蔗鞭黑粉菌基因组数据(gca_900002365.1)获得甘蔗鞭黑粉菌sshos2基因及其上下游序列。通过pcr技术分别扩增基因上/下同源臂、潮霉素抗性标签，以融合pcr技术将其拼接以完成sshos2基因敲除片段的构建。构建好的基因敲除片段通过peg介导的甘蔗鞭黑粉菌原生质体转化技术，将敲除片段分别转入甘蔗鞭黑粉菌不同交配型( ：wt17、-：wt18)中。28℃培养约7天后平板上长出转化子，以水煮的方式粗提转化子dna并以此为模板，以pcr技术检测转化子是否含有目的基因。目的基因检测引物为：sshos2-tg-f:5
’‑
aagccatctacaaggacgc-3’；sshos2-tg-r:5
’‑
tggaaatgtctgtctcgcc-3’。再随机挑选不含目的基因的转化子通过反向pcr验证其正确性：将挑选的不含有目的基因的转化子菌块转移到yeps培养基中28℃200rpm摇菌约1～2天。两天后通过离心收集菌体，用真菌dna提取试剂盒对转化子菌体进行基因组dna提取(试剂盒品牌不限)。提取好的基因组dna按照实施例1步骤进行操作。
[0048]
其中反向pcr引物为：
[0049]
sshos2-r：5
’‑
cgcgtctgctgctccatacaagcca-3’；
[0050]
sshos2-f：5
’‑
ccgtctggaccgatggctgtgtaga-3’；
[0051]
酶切位点的设置如图1a所示，根据同源重组的sshos2基因缺失突变体序列特点，设置酶切位点为ecorⅰ，所述ecorⅰ位点分别位于潮霉素(hph)抗性标签的下游反向pcr引物位点外侧，及下游同源重组臂上。
[0052]
转化子菌体基因组dna经酶切消解，连接成环后再反向pcr扩增，反向pcr扩增产物通过凝胶电泳分离条带，根据图1b可知条带大小约为3380bp，凝胶电泳条带单一且与预设大小一致，可判定为基因敲除成功。
[0053]
黑粉菌属真菌通过不同交配型(“ ”和
“‑”
)的担孢子有性配合后形成双核菌丝，这一过程是其获得侵染能力的关键步骤。根据文献可知hos2在玉米瘤黑粉菌同源编码蛋白是玉米瘤黑粉菌有性配合/菌丝生长的关键基因。将甘蔗鞭黑粉菌野生菌担孢子wt17( )、wt18(-)(甘蔗黑粉病菌担孢子wt17、wt18从甘蔗黑粉病冬孢子经萌发后分离所得，经鉴定二者分别为“ ”和
“‑”
的单倍体，能相互识别，进行有性配合产生双核菌丝)，经反向pcr验证后挑选的wt18的sshos2基因敲除转化子：sshos2
△
41、sshos2
△
51及wt17的sshos2基因敲除转化子：sshos2
△
12、sshos2
△
13进行两两有性配合。经过两两有性配合后结果如图2所示，只有wt17、wt18野生型可以进行有性配合产生双核菌丝，而甘蔗鞭黑粉菌sshos2基因缺失突变体在有性配合/菌丝生长存在严重缺陷，无法进行有性配合产生双核体菌丝。结果与其在玉米瘤黑粉菌同源蛋白表型一致，可知本发明通过反向pcr技术验证成功的sshos2转化子为正确的sshos2基因缺失突变体。表明反向pcr技术可应用于经基因同源重组原理获得的基因敲除转化子的验证，相比于通过southern blot方法验证基因敲除转化子，反向pcr在实施过程中有着众多优势：成本低、高通量、高效率、准确性高等。