一种用于肝癌分子分型的肿瘤内微生物组及应用

1.本发明涉及癌症分子分型技术领域，特别涉及一种用于肝癌分子分型的肿瘤内微生物组及应用。


背景技术：

2.肝癌是一种具有高度异质性的侵袭性恶性肿瘤，在全世界范围内发病率及病死率均位居前列，常在慢性乙型肝炎基础上演变而来。尽管现有的治疗措施，包括手术切除、射频消融、分子靶向及免疫治疗已取得了一定疗效，但由于肝癌的高度异质性，即使同一临床分期的患者其临床结局及治疗效果也存在显著差异，因此进一步探索新的肝癌分子分型，筛选可用于肝癌预后风险度评估的标志物，对于肝癌的个体化精准诊疗具有至关重要的意义。
3.随着高通量测序技术的推广，基于基因组学的肝癌分子分型方法为开展更有效的个体化治疗提供了依据。lee等通过分析91例肝癌患者的基因表达数据集，利用无监督分类方法鉴定出两种与肝癌临床预后密切相关的分子分型。boyault等通过分析肝癌的转录组-基因型-表型相关性，确定了六类与肝癌临床及基因特征相关的肝癌分子分型(g1-g6)。hoshida研究团队通过对来自全球八个独立队列的基因表达数据进行荟萃分析，鉴定出三类与临床参数(肿瘤大小、肿瘤分化程度及血清甲胎蛋白水平)相关的肝癌分子分型(s1-s3)。上述分子分型均依托基因表达谱，而不同肝癌样本间基因表达谱的异质性高，故重复性较差，提示多组学分子分型的必要性。
4.近年来，肿瘤微生物组学发展迅猛，被视为促肿瘤微环境的重要组成部分，能够调控多种消化道肿瘤的发生发展及转归。guo等利用宏基因组测序分析了不同亚型胰腺导管腺癌(pdac)的肿瘤内微生物特征，发现肿瘤内微生物能够促进侵袭性表型-基底样pdac的形成，揭示了pdac肿瘤异质性的微生物基础。这项研究结果为基于肿瘤内微生物组开发肿瘤分子分型，揭示肿瘤异质性提供了直接的证据。然而目前基于微生物组的肝癌分子分型的相关研究和临床意义尚无报道。


技术实现要素：

5.本发明为了解决上述技术问题,提供了一种用于肝癌分子分型的肿瘤内微生物组及应用。
6.第一方面，本发明提供了一种用于肝癌分子分型的肿瘤内微生物组，是采用以下技术方案得以实现的。
7.一种用于肝癌分子分型的肿瘤内微生物组，所述肝癌分子分型为细菌优势亚型和病毒优势亚型；细菌优势亚型以肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌为优势微生物，病毒优势亚型以乙型肝炎病毒为优势微生物。
8.本技术的两种分子分型的临床病理特征、无病生存期、基因表达特征及肿瘤免疫微环境存在明显差异。
9.进一步的，所述细菌优势亚型和病毒优势亚型根据肝癌组织内乙肝病毒相对丰度≤15.5％且大肠埃希菌相对丰度≥1％进行区分鉴定。
10.第二方面，本技术提供了肿瘤内微生物组的一种用途，是采用以下技术方案得以实现的。
11.一种检测上述肿瘤内微生物组的试剂在制备肝癌分子分型试剂盒中的应用。
12.进一步的，所述试剂用于检测肝癌组织内乙肝病毒相对丰度和大肠埃希菌相对丰度。
13.第三方面，本发明提供了一种肝癌分子分型的试剂盒，是采用以下技术方案得以实现的。
14.一种肝癌分子分型的试剂盒，包括检测肝癌组织内乙肝病毒相对丰度和大肠埃希菌相对丰度的试剂。
15.第四方面，本技术提供了肿瘤内微生物组的另一种用途，是采用以下技术方案得以实现的。
16.一种检测上述肿瘤内微生物组的试剂在制备预测肝癌预后的产品中的应用。
17.进一步的，所述试剂用于检测肝癌组织内乙肝病毒相对丰度和大肠埃希菌相对丰度。
18.第五方面，本技术提供了一种预测肝癌预后的产品，是采用以下技术方案得以实现的。
19.一种预测肝癌预后的产品，包括检测肝癌组织内乙肝病毒相对丰度和大肠埃希菌相对丰度的试剂。
20.本技术具有以下有益效果。
21.本发明通过微生物宏基因组测序技术、转录组技术、生物信息学分析技术及免疫组织化学染色技术，基于肝癌内微生物组特征鉴定出两种肝癌分子分型，其中细菌优势亚型肝癌肿瘤直径更大，且更易发生包膜侵犯，预后更差。同时，细菌优势亚型具有更加活跃的脂代谢过程和更强抑制性的肿瘤免疫微环境。本发明基于肿瘤内微生物组的肝癌分子分型可以作为一个新的肝癌预后标志物，对肝癌内微生物组的检测可用以揭示肝癌的异质性，对肝癌患者进行预后风险度评估。
附图说明
22.图1是本发明基于宏基因组测序检测癌组织、配对癌旁组织、慢乙肝组织及阴性对照组的微生物构成相对丰度图(门水平及种水平)；
23.图2是本发明基于肝癌组织内微生物组构成鉴定两种肝癌分子分型的微生物相对丰度图及其相关性热图；
24.图3是本发明两种肝癌分子分型的临床、病理特征及预后差异分析图；
25.图4是本发明两种肝癌分子分型的分子特征及肿瘤免疫微环境差异分析图。
具体实施方式
26.下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的说明。
27.一、实验方法
28.1.临床样本收集
29.本发明共纳入两个队列，队列一收集来自于2020年7月至2021年4月期间肝胆肿瘤科就诊并接受部分肝脏切除手术治疗的肝细胞癌患者癌组织及配对癌旁组织样本各30例；队列二收集来自于肝病科就诊并接受肝穿刺活检术的慢乙肝患者慢乙肝组织12例。队列一包括26名男性和4名女性，中位年龄为57岁；队列二包括8名男性和4名女性，中位年龄42.5岁。队列一患者全部确诊为肝细胞癌，在进行肝切除手术前未进行包括化疗或放疗在内的治疗，术后随访中位时间为12个月；队列二患者全部确诊为慢乙肝，不存在酒精性肝病、自身免疫性肝病及恶性肿瘤等疾病。
30.2.微生物宏基因组测序
31.(1)肝组织采集
32.癌组织及癌旁组织：标本离体后立即无菌条件下采集癌组织及癌旁组织，避开坏死组织，取样至少5g，分装至无菌无酶冻存管中，并立即放入液氮中，于30min内冻存于-80℃冰箱；
33.肝穿刺组织：肝穿刺术中无菌条件下采集肝穿刺组织，长度至少4mm，置于无菌无酶冻存管中，并立即放入液氮中，于30min内冻存于-80℃冰箱。
34.(2)肝组织核酸提取
35.①
取样：枪头捣取绿豆大小的组织于研磨管中，吸取添加缓冲液ga 200μl，将组织入浸泡液。
36.②
破壁处理：打开omni组织匀浆仪，设置参数，放入样本，进行破壁处理。
37.③
短暂离心后向第2步的组织匀浆产物中立即加入160μl缓冲液ga和20μlproteinase k溶液，涡旋混匀，56℃孵育20min，直至样本消化完全。
38.④
短暂离心后加入200μl缓冲液gb，充分混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10s，溶液应变清亮。
39.⑤
短暂离心后将第2步反应产物全部转移至新的1.5ml离心管，加入300μl的无水乙醇，颠倒混匀。
40.⑥
短暂离心后将上一步所得溶液都加到吸附柱cr2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，弃去废液，将吸附柱cr2重新放回收集管中。
41.⑦
向吸附柱cr2中加入500μl缓冲液gd(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃去废液，将吸附柱cr2重新放回收集管中。
42.⑧
向吸附柱cr2中加入600μl漂洗液pw(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃去废液，将吸附柱cr2放回收集管中。
43.⑨
重复上一步骤。空转离心2min，将吸附柱cr2转移至新的1.5ml离心管中，打开盖子，室温放置2min，直至吸附柱cr2中的酒精挥发完全。
44.⑩
向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液tb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。提取dna定量。
45.(3)dna文库构建及高通量测序
46.dna文库的构建按照测序商illumina的流程进行。首先完成dna片段化，然后进行illumina hiseq测序，流程如下：
47.(3.1)dna片段化
48.①
室温下解冻5
×
ttbl，上下颠倒混匀后备用。确认5
×
ts是否处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。
49.②
在灭菌pcr管中配置如下反应体系：
[0050][0051]
③
使用移液器
③
轻轻吹打20次，使其充分混匀。
[0052]
④
将反应pcr管置于pcr仪中，运行如下反应程序：
[0053][0054]
⑤
反应完成后立即向产物中加入5μl 5
×
ts，使用移液器轻轻吹打充分使其混匀，置于室温下放置5min。
[0055]
(3.2)pcr富集
[0056]
①
将pcr管置于冰上，配置如下反应体系：
[0057][0058]
②
使用移液器轻轻吹打使其充分混匀，将反应pcr管置于pcr仪中，运行如下
[0059]
反应程序:
[0060][0061]
(3.3)扩增产物长度分选
[0062]
配置80％浓度的乙醇，将磁珠平衡至室温，并涡旋振荡使其充分混匀；向40μl提取产物中加入10μl ddh2o和80μl(1.6
×
)震荡混匀的agencourt ampure xp磁珠溶液，通过反复吹打或震荡混匀，室温静置结合5min；置于磁力架上，待所有磁珠均被磁力架吸附而溶液变澄清，用移液器去除管中上清溶液。后将产物继续放置在磁力架上，加入200μl 80％浓度的乙醇静置30s，用移液器去除上层乙醇溶液；重复上一步骤；尽量将上一步残留的乙醇溶液去除掉，室温下静置晾干；加入25μl ddh2o，将被吸附于管壁的磁珠吹打混匀，室温下静置结合5min；置于磁力架上，待溶液澄清，吸取20μl洗脱液转移至新1.5ml离心管，-20℃保存。
[0063]
(3.4)文库质量检测及高通量测序
[0064]
使用qubit进行文库浓度测定，agilent 2100bioanalyzer进行文库长度测定。库检合格后按照有效浓度及目标下机数据量的需求把不同文库合并后进行illumina next seq 550平台测序。
[0065]
(3.5)数据处理及生物信息学分析
[0066]
使用readfq对获得的原始数据(raw data)进行预处理，得到有效数据(clean data)后用于后续分析。具体处理步骤如下：去掉过短的、低质量的碱基，利用burrows-wheeler aligner对比人类基因组(hg38)，过滤掉来源于宿主的reads。经处理后的测序序列与微生物基因组数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)比对以鉴定微生物种类。以与数据库比对上的序列计算，将比对得到序列的丰度和非特异性序列的丰度相加，所得结果即为该物种丰度。利用非度量多维尺度分析(nmds)对30例癌组织样本进行归类，从而区分不同分子分型。
[0067]
3.转录组测序
[0068]
(1)肝组织rna提取
[0069]
①
取肝组织样本进行破碎和匀浆化，加入600μl裂解液rlt plus，涡旋混匀。
[0070]
②
所有液体转移到置于2ml收集管中的gdna eliminator旋转柱上。以≥10,000rpm的速度离心1min。丢弃柱子，并保留2ml收集管中的液体。向液体中加入1倍体积(350μl)的70％浓度乙醇，然后用移液器将其充分混合。
[0071]
③
将不超过700μl的样品(包括任何沉淀物)转移到置于2ml收集管中的rneasy离
心柱中。合上盖子，并以≥10,000rpm的速度离心1min，丢弃滤出物。
[0072]
④
将700μl rw1缓冲液添加到rneasy mini旋转柱中(在2ml收集管中)。合上盖子，并以≥10,000rpm的速度离心1min，丢弃滤出物。
[0073]
⑤
将500μl缓冲液rpe加入rneasy离心柱，合上盖子，并以≥10,000rpm的速度离心1min，丢弃滤出物。
[0074]
⑥
将500μl缓冲液rpe加入rneasy离心柱，轻轻合上盖子，并以≥10,000rpm的速度离心2min。
[0075]
⑦
将rneasy离心柱放在新的2ml收集管中，全速离心1min。
[0076]
⑧
将rneasy离心柱放在新的1.5ml收集管中，将30μl无rnase水直接添加到离心柱膜上，关闭盖子，并以≥10,000rpm的速度离心1min以洗脱rna。
[0077]
⑨
应用agilent 2100bioanalyzer精确检测rna的完整性和总量。
[0078]
(2)文库构建与质检
[0079]
取total rna，利用oligo(dt)磁珠富集具有polya尾的mrna，随后在fragmentation buffer中用二价阳离子将获得的mrna随机打断。然后以片段化的mrna作为模板，以随机寡核苷酸作为引物，在m-mulv逆转录酶体系中合成cdna的第一条链，然后用rnaseh降解掉rna链，并在dna polymerase i体系下，以dntps为原料来合成cdna第二条链。纯化后的双链cdna再经过末端修复、加a尾及连接测序接头，随后用ampure xp beads筛选长度在370-420bp左右的cdna进行pcr扩增并再次使用ampure xp beads进行pcr产物纯化，最终获得测序文库。测序文库构建成功后，使用qubit2.0 fluorometer初步定量测定，稀释文库至1.5ng/μl,然后使用agilent 2100bioanalyzer对测序文库的insert size进行检测，insert size符合要求后，利用qrt-pcr对测序文库有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。
[0080]
(3)上机测序
[0081]
测序文库库检合格后，将不同的测序文库按照有效浓度和目标下机数据量的需求pooling后进行illumina测序。illumina测序的原理是边合成边测序，在测序的流动池中加入四种荧光标记的dntp、dna聚合酶以及接头引物从而进行扩增，每加入一个荧光标记的dntp就能释放出对应的荧光，而测序仪通过捕获其荧光信号并利用计算机软件将荧光信号转化为测序峰，就能获得待测片段的序列信息。
[0082]
(4)表达矩阵预处理
[0083]
原始数据使用fastp(v 0.20.0)软件进行质控，过滤掉接头和低质量reads得到clean reads，质控后的数据比对rrna数据库，比对软件为bowite2(v2.2.4)，其rrna数据来源于silva(v138.1)，获得去除rrna后的reads。将经过质量控制且去除rrna后所获得的reads比对到人基因组，人基因组版本为grch38.101，比对软件为hisat2(v2.2.1)，所得结果是后续分析的基础。在rna-seq分析中，本技术可以通过定位到基因组区域或基因外显子区reads的计数来估计基因的表达水平。本研究采用featurecounts(v2.0.1)软件对各样本进行基因表达水平分析，并利用subread(v2.0.1)计算其相对表达量。
[0084]
(5)差异表达基因及富集分析
[0085]
对于有生物学重复的数据，本技术采用deseq2软件进行基因差异表达显著性分析，显著性差异表达基因筛选标准为p《0.01且|log2foldchange|≥1；使用
rclusterprofiler软件包进行go富集分析，差异表达基因筛选的阈值为p《0.01。go要包含3个分支，分别为生物学过程(bp)、细胞组分(cc)及分子功能(mf)。当go terms的padj《0.05，被认为显著富集。
[0086]
(6)生物信息学分析
[0087]
利用epic及cibersort分析软件对肿瘤免疫微环境中的免疫细胞浸润情况进行分析。epic是一款利用肿瘤样本rna-seq表达矩阵评估样本免疫细胞构成的软件，其可以计算8种免疫细胞类型的相对比例。cibersort是基于线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的软件，可利用肿瘤样本rna-seq表达矩阵评估22种免疫细胞的占比从而评估免疫细胞浸润情况。
[0088]
4.免疫组织化学染色
[0089]
(1)病理切片制备
[0090]
手术切除标本离体后立即浸入10％的中性福尔马林里进行固定，固定完之后标本送到病理科。小标本需要固定4-6个小时，大标本需要固定6-12个小时，固定完之后进行取材，置于全自动脱水机中脱水16个小时处理标本。处理过程包括组织进行固定、透明、脱水、浸蜡，处理后进行石蜡包埋，放在切片机上进行切片，厚度大约为3-4μm。
[0091]
(2)实验流程
[0092]
①
石蜡切片脱蜡：(石蜡切片染色前应置于60℃烤箱内2h)
[0093]
a)二甲苯i、ii和ⅲ中各30min；
[0094]
b)梯度酒精：100％i和ii各5min；95％，5min；80％，5min；70％，5min；
[0095]
c)蒸馏水洗：5min，共3次；
[0096]
②
微波抗原修复：用枸橼酸钠(ph＝6.0)进行微波修复，将切片置于灰盒中，枸橼酸钠淹没切片，高火5min，小火15min，后晾至室温。后磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤:5min，共3次；
[0097]
③
过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3％h2o2，室温避光封闭25min；封闭时间根据不同指标适度调整；pbs洗涤：5min，共3次；
[0098]
④
滴加一抗：将片子甩干后，直接滴加cd3、cd8、cd68、cd163、pd-l1抗体，每张切片50μl，置于湿盒内，4℃过夜。第二天于室温下复温1-2h；pbs洗涤：5min，共3次；
[0099]
⑤
滴加增强剂50μl，室温孵育30min，pbs洗涤，5min，3次；
[0100]
⑥
每张切片上滴加鼠/兔通用型二抗50μl，室温孵育30min，pbs洗涤5min，3次；
[0101]
⑧
dab显色：显色3-5min，直颜色不再变化时蒸馏水终止显色；苏木素复染核，盐酸酒精显红，氨水返蓝；
[0102]
⑨
酒精梯度脱水干燥：70％，5min；80％，5min；95％，5min；100％，5min；二甲苯透明：二甲苯i、ii、ⅲ各15min；
[0103]
⑩
中性树胶封片。
[0104]
(3)免疫组化染色结果判定
[0105]
cd3、cd8、cd68、cd163、pd-l1为hcc细胞细胞膜或细胞浆染色。对于cd3、cd8、cd68和cd163的评判，首先在100
×
视野下观察整张切片，然后再选择5个不重叠的200
×
视野，分别计数阳性染色细胞，最后取平均值作为最终结果。对于pd-l1的评判，首先在100
×
视野下观察整张切片，选择pd-l1密度最高的热点区域观察，随机选择5个400
×
视野计数阳性染色
细胞，最后取平均值作为最终结果。
[0106]
二、实验结果
[0107]
1.本研究共对72例肝组织样本进行微生物宏基因组测序，包括30例肝癌癌组织及其配对癌旁组织，12例慢乙肝肝穿刺组织，共鉴定出146种微生物，其中乙型肝炎病毒被广泛检测到，细菌占据较大比例。在细菌门水平，变形菌门、厚壁菌门以及放线菌门为优势菌门(图1a)；在种水平，肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为优势菌种(图1b)。
[0108]
2.本发明通过nmds分析，鉴定出两种基于肿瘤内微生物组的肝癌分子分型—细菌优势亚型(bacteria-t)及病毒优势亚型(virus-t)(图2a)。两种分子分型间具有不同的微生物特征，其中bacteria-t以肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌为优势微生物，virus-t以乙型肝炎病毒为优势微生物(图2b)，spearman相关性分析表明两种分子分型间具有明显不同的聚类趋势(图2c)。
[0109]
另外，本技术尝试利用乙型肝炎病毒、大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的相对丰度确定两种分子分型间的区分阈值，受试者工作特征曲线显示当乙肝病毒相对丰度≤15.5％且大肠埃希菌相对丰度≥1％时能够完美区分bacteria-t及virus-t(曲线下面积auc＝1.000，特异度与灵敏度均为1.000)，而肺炎克雷伯菌并不能区分两种分子分型(auc＝0.699)。
[0110]
3.本发明还进行了两种分子分型患者间性别、年龄、吸烟史、肝硬化病史、肝功能、tnm分期、bclc分期、肿瘤大小、包膜侵犯、肿瘤坏死、卫星结节、分化程度、微血管侵犯等临床病理指标的差异分析。与virus-t相比，bacteria-t肿瘤直径更大且更易发生包膜侵犯，而其他指标无统计学差异(p＞0.05)(图3a)。此外，本发明进一步分析了两种分子分型患者间无病生存期(dfs)之间的差异，结果表明与virus-t相比，bacteria-t分型dfs有缩短趋势(图3b)，但无统计学差异，这可能与样本例数、随访时间等有关。
[0111]
4.本发明还进行了两种分子分型间基因表达特征及肿瘤免疫微环境的差异分析。首先，本技术利用p《0.01且|log2fc|≥1作为阈值进行差异基因筛选，bacteria-t及virus-t间共筛选出323个差异表达基因，其中virus-t相较于bacteria-t共162个基因上调，161个基因下调。本技术通过绘制聚类分析热图表征不同分子分型间的差异基因表达，结果表明两种分子分型在细胞代谢和免疫过程具有明显差异的分子特征(图4a)。通过go富集分析发现差异表达基因主要富集于免疫球蛋白生成(immunoglobulin production)、免疫反应分子介质生成(production of molecular mediator of immune response)、淋巴细胞介导免疫(lymphocyte mediated immunity)及脂质代谢过程的正调控(positive regulation of lipid metabolic process)等生物学过程，以及类固醇羟化酶活性(steroid hydroxylase activity)、低密度脂蛋白颗粒结合(low-density lipoprotein particle binding)等分子功能，提示bacteria-t相比于virus-t，具有更加活跃的脂代谢过程。
[0112]
进一步的，本技术对两种分子分型间的肿瘤免疫微环境进行差异分析。首先，本技术通过epic计算基因表达数据来估计免疫细胞和肿瘤细胞的比例，结果表明bacteria-t中巨噬细胞浸润比例低于virus-t，差异具有统计学意义(p＝0.015)，而cd4 t细胞、cd8 t细胞、b细胞和nk细胞浸润比例差异无统计学差异(p》0.05)(图4b)。进一步的，本技术基于转录组数据利用cibersort对免疫细胞亚型进行进一步分析，结果表明不同分子分型间单核细胞(moncytes)浸润存在统计学差异(p＝0.034)，但其总体所占比例较少；结合epic免疫
浸润分析结果，本技术重点关注巨噬细胞及其亚型浸润比例，结果表明相比于virus-t，bacteria-t表现为m2亚型高浸润及m1亚型低浸润趋势，虽然差异无统计学意义(p＞0.05)(图4c)。进一步的，本技术为了进行验证，利用免疫组织化学染色技术对两种分子分型癌组织的石蜡组织切片进行染色，分别用cd3、cd8、cd68、cd163及pd-l1对肝癌肿瘤微环境中的t细胞、cd8 t细胞、巨噬细胞、m2型巨噬细胞及免疫检查点进行表征。结果表明与virus-t相比，bacteria-t中巨噬细胞浸润降低(p＝0.042)、m2型巨噬细胞浸润升高(p＝0.028)，差异均具有统计学意义；而t细胞、cd8 t细胞浸润及免疫检查点在不同分子分型间差异无统计学意义(p＞0.05)。提示bacteria-t相比于virus-t，具有更强抑制性的肿瘤免疫微环境，其主要表现为m2型巨噬细胞浸润比例升高(图4d)。
[0113]
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。