一种茶树油纳米乳液及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及水产养殖，属于水产动物营养与饲料技术领域，具体涉及一种茶树油纳米乳液及其制备方法与应用。


背景技术：

2.茶树，又称互叶白千层，桃金娘科白千层属，从其新鲜枝叶蒸馏得到无色至淡黄色具有芳香气味的油状液体即为茶树油。茶树原产于澳大利亚，后于1993年引入我国，现主要产区为广西。近年来茶树油因具有广谱抑菌以及抗氧化等生物学活性受到了广泛关注，其利用方式也大大增加，但是由于对其抗菌机理了解不够深入，对于茶树油相关产品的研发利用仍有较大空间。
3.茶树油具有100多种成份，按化学组分主要分为三类：4-松油醇型、1，8桉叶素型以及异松油烯型。carson等认为茶树油主要活性成分可能是松油烯-4-醇和α-萜烯醇，相关的研究也证明了这两种物质可以有效抑制微生物生长。但是对于茶树油有效活性物质，并不应该单纯认为是其中某种物质，程峰也认为茶树油抑菌效果是多种成份的协同作用。
4.茶树油具备多种生物学活性：(1)抗菌活性。茶树油具有广谱的抗菌活性，对真菌、细菌等微生物抑制效果良好。研究表明，茶树油对支原体、李斯特菌、黑曲霉等的生长具有较好的抑制作用。赵星辰等认为茶树油对金黄色葡萄球菌的抑制效果主要是通过抑制细胞间黏附素和细胞外dna的合成和释放，
5.从而影响被膜生长进而起到抑菌作用。(2)抗病毒。garozzo等认为茶树油中的4-松油烯，异松油烯等组分可以通过干扰a/pr/8亚型h1n1流感病毒脱壳从而引起病毒死亡。(3)抗炎。liu等发现茶树油可以有效抑制机体受李斯特杆菌刺激后激活的nlrp3炎症途径蛋白的表达。koh等也发现茶树油能明显抑制组织胺引起的红斑等炎症反应。(4)抗肿瘤。研究表明，茶树油具有体外抗乳腺癌细胞活性，并且对正常细胞无毒。(5)抗氧化。singh等认为茶树油的抗氧化能力来源于其化学组成中较多的酚酸类和帖类物质。王淑楠等在仔猪饲料中加入茶树油，发现茶树油对仔猪胸腺及肝脏发育，并且降低了腹泻概率。
6.近年来茶树油因具有广谱抗菌活性，并且作为天然提取物，低毒环保无残留，而被视为抗生素替代物，受到人们的广泛关注。研究表明茶树油不仅具有广谱抗菌活性，还具有抗氧化，抗炎和防腐等功能，目前广泛应用于食品，医疗等领域。目前茶树油在动物上的试验正在逐步开展。董丽等在仔猪上的研究发现，饲料中添加100mg/kg茶树油可以提高机体的抗氧化能力，并且其效果优于抗生素。等将感染小瓜虫的细鳞鲳(piaractus mesopotamicus)每天浸泡于50μl/l茶树油中2h，经过持续五天的治疗后发现细鳞鲳存活率为53.3％，并且无不良反应，而对照组全部死亡。baldissera等认为使用茶树油进行预防性治疗可以有效改善克林雷氏鲶(rhamdia quelen)感染嗜水气单胞菌后的免疫反应。因此，茶树油具有作为饲料添加剂的潜力。
7.目前，纳米乳液在精油方面应用较多，可以改善精油的水溶性以及挥发性。侯克洪等以羟丙基-β-环糊精与酪蛋白酸钠作乳化剂对肉桂精油进行乳化，得到稳定性较好的纳
米乳液，并且对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌抑菌效果均优于精油。ozogul等认为西柚皮精油纳米乳液抑菌效果优于西柚皮精油，但是其杀菌效果还有待进一步研究，也就是说，纳米乳液具有比原液更好的效果，但是再茶树油纳米乳液制备方向却依然是空白，目前还未有比较明确的研究报道茶树油纳米乳液最佳的配方配伍，这也是本技术中要解决的关键技术点之一。
8.克氏原螯虾(procambarus clarkii)，又称淡水小龙虾，原产于美国及墨西哥，后经日本传入我国。其营养丰富，深受消费者喜爱，是我国重要的淡水经济虾类。目前在我国有20多个省份养殖克氏原螯虾，是第六大淡水养殖品种。近年来，克氏原螯虾除了食品加工外，还可提取内源酶，甲壳素、虾青素等，这也进一步扩大了克氏原螯虾的需求。但是随着养殖规模的扩大，疾病暴发也愈加频繁。为了减少疾病带来的损失导致了抗生素耐药性，化学药物残留，以及对环境的污染。因此，如何让克氏原螯虾产业绿色发展，寻找抗生素替代物的研究势在必行。
9.虾青素是一种酮式类胡萝卜素，具有强抗氧化、抗炎、神经保护、抗肿瘤以及着色等生物学活性。虾青素在虾蟹体内广泛存在，具有十分重要的作用，但是却不能自身合成，只能通过食物摄取。大量研究表明，饲料中添加虾青素对于甲壳动物具有改善色素沉着，繁殖能力，免疫力等积极作用。王军辉等研究表明，饲料中添加400mg/kg虾青素可以有效提升锦鲤(cyprinus carpio)生长性能，着色效果以及抗氧化能力。li等认为在血鹦鹉(amphilophus citrinellus
×
cichlasoma synspilum)饲料中补充虾青素可以提高血鹦鹉鱼的生长性能及抗氧化能力。cheng等发现在克氏原螯虾饲料中添加400mg/kg虾青素可以显著提高其生长性能及非特异性免疫。目前虾青素主要通过雨生红球藻(haematococcus pluvialis)等藻类提取或人工合成而来，但是价格昂贵，成本较高，限制了其在水产养殖中的应用。目前，已经证实了植物源提取物对养殖动物具有促生长效果，那么为了降低饲料成本，能否在少量添加虾青素的前提下，通过添加植物源提取物来保证或提高克氏原螯虾生长性能呢？
10.为了更好提高养殖动物生长性能，将多种饲料添加剂搭配使用或许比单一使用具有更好的效果。在蛋鸡及仔猪上的研究表明，将薄荷油与茶多酚配伍可以提高热应激能力。何旺泉等的研究表明，饲料中添加精油与有机酸可以提高凡纳宾对虾(litopenaeus vannamei)生长及免疫能力。但是饲料中添加茶树油与虾青素相关研究未见报道，其是否对克氏原螯虾有影响尚不清楚。
11.在当前禁抗背景下，绿色抗生素替代物的研究迫在眉睫。茶树油具有广谱抗菌等多种生物活性，并且无污染无残留。但是目前对于茶树油的作用机制了解较少，对于其利用也有所局限，且其在动物上的应用试验主要集中在陆生动物上，在水产动物上的应用研究开展较少，在克氏原螯虾上的研究更是未见报道。
12.鉴于此，本技术探索茶树油乳液配方及其适宜添加量，探究其对克氏原螯虾生长性能，抗氧化能力以及相关基因表达是否具有改善效果，促进克氏原螯虾生长与免疫性能，为其在配合饲料中的使用提供参考依据。


技术实现要素：

13.针对现有技术的不足，本发明提供了一种茶树油纳米乳液及其制备方法与应用，
首先探究的是新的一种茶树油纳米乳液的最佳配方配伍，接着针对目前水产养殖的克氏原螯虾，进一步探究将新的一种茶树油纳米乳液应用在克氏原螯虾的养殖上对其生长和免疫的影响，进而确定新研发的一种茶树油纳米乳液能够在未见报道的克氏原螯虾的养殖上产生积极的作用和效果。
14.较为完整的，本发明提出的主要技术思路有三点：
15.其一，茶树油纳米乳液配方的筛选：以乳液粒径、多分散系数(pdi)、zeta-电位值以及乳液颗粒形态等指标探索茶树油纳米乳液配方中表面活性剂，助表面活性剂，表面活性剂助表面活性剂质量比(km)以及油相水相比例进行筛选。结果表明：适宜茶树油纳米乳液配方为：2.5％大豆卵磷脂为表面活性剂，2.5％正丙醇为助表面活性剂，10％茶树油，85％水。此条件下，茶树油纳米乳液粒径为102.931
±
1.606nm，pdi为0.135
±
0.005，zeta电位为-53.5
±
1.809mv，乳液颗粒均匀，形成温度及离心稳定性良好的水包油型乳液。
16.其二，探究新筛选出的茶树油纳米乳液体外抑菌性能及抗氧化能力：在不同温度(25、65、105℃)处理茶树油纳米乳液后，测定茶树油原液及纳米乳液的抑菌性能及抗氧化能力。结果表明：茶树油纳米乳液各温度处理后，相同温度下其对嗜水气单胞菌nj-35、非o1霍乱弧菌两菌株抑菌圈、最小抑菌浓度及最小杀菌浓度均优于茶树油原液，且随着处理温度的提高，茶树油原液及纳米乳液的抑菌性能均不同程度下降。但105℃处理后茶树油纳米乳液性能仍高于25℃处理下的茶树油原液；抗氧化能力测试中，经65、105℃高温处理后，茶树油原液及纳米乳液的抗氧化能力均不同程度下降。但是茶树油纳米乳液在总抗氧化能力、抑制羟自由基能力以及dpph自由基清除能力方面均优于茶树油原液。
17.其三，探究新的茶树油纳米乳液在尚未报道的克氏原螯虾养殖方面的应用，并通过茶树油纳米乳液对克氏原螯虾生长性能、抗氧化能力及免疫相关基因表达的影响来进一步证实该种新的茶树油纳米乳液能够显著提高克氏原螯虾生长性能、抗氧化能力及免疫相关基因表达。
18.具体为：探究饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾(procambarus clarkii)生长性能、抗氧化能力及免疫相关基因表达的影响，设计了6组等氮等能饲料，分别为基础对照饲料(ct)、阳性对照50mg/kg虾青素组(as50)，50mg/kg虾青素与50mg/kg茶树油组(as50 ast50)50mg/kg虾青素与100mg/kg茶树油组(as50 ast100)，50mg/kg虾青素与200mg/kg茶树油组(as50 ast200)50mg/kg虾青素与400mg/kg茶树油(as50 ast400)，进行了8周的养殖试验。结果表明添加了虾青素后，as50组与ct组相比，饵料系数显著降低(p《0.05)，末均重、增重率、特定生长率虽有提高但差异不显著(p》0.05)，血淋巴及肠道总抗氧化能力(t-aoc)显著提高(p《0.05)，丙二醛(mda)含量显著降低(p《0.05)，crustin，astacidin，cuznsod以及hsp70基因表达显著升高(p《0.05)。添加了虾青素与茶树油后，as50 ast100组末均重，增重率，特定生长率，总抗氧化能力均显著高于as50和ct组(p《0.05)，肠道丙二醛含量显著低于as50组和ct组(p《0.05)。肠道组织crustin与astacidin基因表达量随茶树油含量提高呈升高趋势，as50 ast50组显著低于其余各组(p《0.05)，cuznsod表达量随茶树油浓度提高呈先升高后降低趋势，as50 ast50以及as50 ast100显著高于其余各组(p《0.05)。hsp70表达量随茶树油含量的提高显著高于对照组(p《0.05)。总体而言，添加50mg虾青素及100mg/kg茶树油显著提高了克氏原螯虾生长性能、抗氧化能力及免疫相关基因表达。
19.较为具体地，本发明第一方面提供了一种茶树油纳米乳液，所述纳米乳液配方按
照质量分数包括：
20.大豆卵磷脂2.5％；正丙醇2.5％；茶树油10％；纯水85％。
21.进一步的，茶树油纳米乳液粒径为102.931
±
1.606nm，pdi为0.135
±
0.005，zeta电位为-53.5
±
1.809mv；所述茶树油纳米乳液为水包油型。
22.较为具体地，本发明第二方面提供了一种茶树油纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
23.制粗乳液：将大豆卵磷脂、正丙醇依次加入纯水中，磁力搅拌器混合均匀后，边搅拌边缓慢加入茶树油；接着以650r/min搅拌1h，制得粗乳液；
24.制精乳液：将粗乳液置于烧杯中，通过超声细胞破碎仪破碎，破碎仪操作参数为：55％功率，处理15min，处理4s停止2s，整个过程于冰浴条件下进行。
25.较为具体地，本发明第三方面提供了一种茶树油纳米乳液在制备克氏原螯虾饲料方面的应用。
26.进一步的，所述茶树油纳米乳液在饲料中的占比为茶树油纳米乳液0.01％。
27.进一步的，所述饲料包括基础饲料、虾青素以及茶树油纳米乳液。所述虾青素在总饲料中的占比为50mg/kg，所述茶树油纳米乳液在总饲料中的占比为100mg/kg，其余为基础饲料。所述基础饲料包括蛋白源、脂肪源等；其中，所述蛋白源包括进口鱼粉、菜粕、豆粕、虾粉；所述脂肪源为豆油。
28.具体的，所述饲料包括：鱼粉3％，豆粕23％，菜粕14％，虾粉5％，肉粉5％，血粉2％，玉米酒糟5％，面粉27％，米糠6％，豆油2.5％,磷酸二氢钙2％，维生素和矿物质预混料2％，粘合剂0.5％，食盐0.2％，乌贼膏2％，赖氨酸0.18％，膨润土0.565％,蛋氨酸0.04％，虾青素0.005％，茶树油纳米乳液0.01％。
29.综上所述，本发明主要具有以下有益效果：
30.1.综合乳液粒径、pdi、zeta-电位及颗粒形态等指标，筛选出茶树油纳米乳液适宜配方为：油相茶树油10％，水相纯水85％，表面活性剂大豆卵磷脂2.5％，助表面活性剂正丙醇2.5％。此配方以超声破碎法制得茶树油纳米乳液粒径为102.931
±
1.606nm，pdi为0.135
±
0.005，zeta电位为-53.5
±
1.809mv，乳液颗粒均匀，乳液类型为水包油型，温度稳定性及离心稳定性良好。
31.2.茶树油纳米乳液比未乳化精油提高了抑菌性能与抗氧化能力。在25、65、105℃处理后茶树油纳米乳液对嗜水气单胞菌nj-35mic均为1.56mg/ml，mbc分别为1.56、3.13、3.13mg/ml；对非o1霍乱弧菌mic均为1.56mg/ml，mbc均为1.56mg/ml。高温处理降低了抗氧化能力，但是茶树油纳米乳液在总抗氧化能力、抑制羟自由基能力以及dpph自由基清除能力均优于茶树油原液。
32.3.饲料中添加50mg/kg虾青素可以提高克氏原螯虾生长性能，抗氧化能力及非特异性免疫力。同时添加50mg/kg虾青素与100mg/kg茶树油后，显著提高了克氏原螯虾增重率，特定生长率，总抗氧化能力，抗超氧阴离子自由基能力以及cuznsod基因表达，显著降低了饵料系数及丙二醛含量。综上所述，饲料中同时50mg/kg虾青素与100mg/kg茶树油可以提高克氏原螯虾抗氧化能力与免疫能力，促进生长。
附图说明
33.图1是不同表面活性剂配方对茶树油纳米乳液颗粒形态的影响；其中：(a)tween20，(b)tween80，(c)span20，(d)span80，(e)大豆卵磷脂，(f)酪蛋白酸钠。
34.图2为不同表面活性剂配方纳米乳液静置36天后状态；其中：span80(s80)，酪蛋白酸钠(l)，span20(s20)，tween80(t80)，tween20(t20)，大豆卵磷脂(d)。
35.图3为不同助表面活性剂配方对茶树油纳米乳液颗粒形态的影响；其中，(a)无水乙醇，(b)正丙醇，(c)1,2-丙二醇，(d)丙三醇，(e)正丁醇，(f)异丁醇。
36.图4为不同km值对茶树油纳米乳颗粒形态的影响；其中，(a)1:2，(b)1:1，(c)2:1，(d)3:1，(e)4:1，(f)5:1。
37.图5为不同油相及水相比例茶树油纳米乳液荧光显微镜视图；其中，(a)1:18，(b)2:17，(c)3:16，(d)4:15，(e)5:14，(f)4:13。
38.图6为不同温度处理对茶树油纳米乳液热稳定性的影响；其中(a)25、50℃；(b)75、100℃。
39.图7为不同温度处理后茶树油原液及纳米乳液对两种菌株抑菌圈直径的影响；其中，(a)，嗜水气单胞菌nj-35；(b)，非o1霍乱弧菌。柱形图上方不同大写字母表示乳化前后差异显著(p《0.05)，下图同。
40.图8为不同温度处理后茶树油原液及纳米乳液对两种菌株最小抑菌浓度的影响；其中，(a)，嗜水气单胞菌nj-35；(b)，非o1霍乱弧菌。
41.图9为不同温度处理后茶树油原液及纳米乳液对两种菌株最小杀菌浓度的影响；其中，(a)，嗜水气单胞菌nj-35；(b)，非o1霍乱弧菌。
42.图10为不同温度处理对茶树油原液、纳米乳液及乙氧基喹啉总抗氧化能力的影响；其中，柱形图上方不同小写字母表示温度处理前后差异显著(p《0.05)，下图同。
43.图11为不同温度处理对茶树油原液、纳米乳液及乙氧基喹啉抑制羟自由基能力的影响。
44.图12为不同温度处理对茶树油原液、纳米乳液及乙氧基喹啉dpph自由基清除能力的影响。
45.图13为饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾增重率(a)及饵料系数(b)的影响。
46.图14为饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾总抗氧化能力；(a，血淋巴；d，肠道组织)，抗超氧阴离子自由基活力(b，血淋巴；e，肠道组织)，丙二醛含量(c，血淋巴；f，肠道组织)的影响。
47.图15为饲料不同茶树油含量对克氏原螯虾免疫相关基因的影响；其中，注：(a)，crustin；(b)，astacidin；(c)，hsp70；(d)，cuznsod；(e)，toll3；(f)，cypa。
具体实施方式
48.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.第一方面，本发明提供了一种茶树油纳米乳液，所述纳米乳液配方按照质量分数
包括：大豆卵磷脂2.5％；正丙醇2.5％；茶树油10％；纯水85％。
50.特别的，在该茶树油纳米乳液中，茶树油纳米乳液粒径为102.931
±
1.606nm，pdi为0.135
±
0.005，zeta电位为-53.5
±
1.809mv；所述茶树油纳米乳液为水包油型。
51.对于上述新的一种茶树油纳米乳液配方配伍的最终构成，本发明中从2个方面进行探究和验证，其一是茶树油纳米乳液配方筛选；其二是茶树油纳米乳液体外抑菌性能及抗氧化能力的验证，具体分为以下两个实施例进行阐述说明
52.实施例1：茶树油纳米乳液配方筛选及其研究
53.本试验以茶树油为研究对象，先以磁力搅拌器将茶树油制备为粗乳液，后用超声波破碎为纳米乳液。以纳米乳液的粒径大小、多分散系数(pdi)、zeta电位等为指标，探索不同表面活性剂、助表面活性剂、表面活性剂与助表面活性剂质量比(km值)对茶树油的影响，筛选茶树油纳米乳液适宜的配方，以期改善茶树油性能及稳定性，提高其利用率，为茶树油的利用提供理论和数据依据。
54.1.材料与方法
55.1.1试验材料
56.主要试剂茶树油、tween20等见表1。
57.表1试验试剂
[0058][0059]
1.2仪器与设备
[0060]
主要试验设备磁力搅拌器、超声细胞破碎仪见表2。
[0061]
表2试验设备
[0062][0063]
1.3试验方法
[0064]
1.3.1茶树油纳米乳液的制备
[0065]
茶树油纳米乳液制作方法参照吴秋林等的描述。将表面活性剂与助表面活性剂依
次加入超纯水中，磁力搅拌器混合均匀后，边搅拌边缓慢加入茶树油。接着650r/min搅拌1h，制得粗乳液。将粗乳液置于烧杯中，通过超声细胞破碎仪破碎，整个过程于冰浴条件下进行。超声细胞破碎仪操作参数如下：55％功率，处理15min，处理4s停止2s。
[0066]
1.3.2表面活性剂筛选
[0067]
以表面活性剂4％，助表面活性剂无水乙醇1％，茶树精油5％，超纯水90％为配方，表面活性剂分别为tween20、tween80、span20、span80、大豆卵磷脂、酪蛋白酸钠，每组三个重复，制得相应乳液备测。
[0068]
1.3.3助表面活性剂筛选
[0069]
以表面活性剂大豆卵磷脂4％，助表面活性剂1％，茶树精油5％，超纯水90％为配方，助表面活性剂分别为无水乙醇、正丙醇、1,2-丙二醇、异丁醇、丙三醇、正丁醇，每组三个重复，制得相应乳液备测。
[0070]
1.3.4 km值筛选
[0071]
以大豆卵磷脂为表面活性剂，正丙醇为助表面活性剂，茶树精油5％，超纯水90％为配方，表面活性剂：助表面活性剂(km)值分别为1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，每组三个重复，制得相应乳液备测。
[0072]
1.3.5茶树油及水比例筛选
[0073]
以表面活性剂大豆卵磷脂2.5％，助表面活性剂正丙醇2.5％为配方，茶树精油及超纯水比例分别为1:18、2:17、3:16、4:15、5:14、6:13，每组三个重复，制得相应乳液备测。
[0074]
1.3.6乳液类型判定
[0075]
在乳液中加入苏丹ⅲ染液及亚甲基蓝染液，观察其扩散速率。苏丹ⅲ染液采用0.1g苏丹ⅲ溶于20ml 95％的酒精制成；亚甲基蓝染液采用0.01g亚甲基蓝溶于100ml纯水中制成。
[0076]
1.3.7纳米乳液形态、分布及粒径测定
[0077]
将茶树油纳米乳液稀释50倍以避免多重散射效应影响准确性，然后用马尔文激光粒度仪测定茶树油纳米乳液粒径、分布及zeta电位，每组指标测定三个次。
[0078]
将尼罗红溶于1,2-丙二醇与水按的混合溶液(50:1)中，混匀制得0.1％尼罗红染液，避光保存。取0.1％尼罗红染液40μl，滴入1ml茶树油纳米乳液进行染色，而后放入荧光显微镜观察。荧光显微镜选用10倍目镜，40倍物镜进行观察并拍摄照片。
[0079]
1.3.8稳定性检测
[0080]
1.3.8.1热稳定性
[0081]
热稳定性检测参照程晨等的方法。取三批次制备好的茶树油纳米乳液置于15ml离心管中，在25、50、75、100℃下处理15min，观察其颜色和外形变化。
[0082]
1.3.8.2离心稳定性
[0083]
离心稳定性参照冯桂仁稳定性参数测量方法。将三批次制备好的茶树油纳米乳液于高速离心机3000r/min，处理15min，测定离心前后550nm波长吸光度，分别记为t0、tt，计算稳定性参数，稳定性参数ke＝(t0-tt)/t0*100％。
[0084]
1.3.9统计与分析
[0085]
数据用spss 20.0软件进行分析，使用软件中单因素方差分析(one-way anova)以及duncan’s多重比较进行差异性分析，p《0.05视为差异显著。所有数据以平均值
±
标准误
差表示。
[0086]
2.结果
[0087]
2.1表面活性剂筛选
[0088]
不同表面活性剂对茶树油纳米乳液理化性质的影响见表3。各组间粒径差异显著(p《0.05)，从小到大依次为tween80、大豆卵磷脂、span20、tween20、酪蛋白酸钠、span80，粒径以tween80最优；各组pdi差异显著(p《0.05)，从小到大依次为tween20、span20、tween80、大豆卵磷脂、酪蛋白酸钠、span80，pdi以tween20最优；span20、span80、大豆卵磷脂组zeta电位显著高于tween20、tween80组(p《0.05)，与大豆卵磷脂、酪蛋白酸钠组差异不显著(p》0.05)，zeta电位以span80最优。
[0089]
不同表面活性剂配方对茶树油纳米乳液颗粒形态影响见图1。酪蛋白酸钠组聚集絮凝现象较明显，tween20，span80聚集较多，大豆卵磷脂组，span20以及tween80组颗粒较小，粒径大小及分布均匀，以大豆卵磷脂组最优。
[0090]
常温静置36天后各组乳液外观如图2所示。span80、酪蛋白酸钠、tween80、tween20均明显分层，span20略有分层，仅大豆卵磷脂组无显著变化。
[0091]
表3不同表面活性剂对茶树油纳米乳液理化性质的影响
[0092][0093]
注:同行不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，下表同。
[0094]
2.2助表面活性剂筛选
[0095]
不同助表面活性剂对茶树油纳米乳液理化性质的影响见表4。结果表明，正丙醇、异丁醇组粒径显著低于1,2-丙二醇、丙三醇组(p《0.05)，与无水乙醇、正丁醇组差异不显著(p》0.05)，以正丙醇组最优；正丙醇组pdi显著低于正丁醇组，与其余各组差异不显著(p《0.05)，以正丙醇组最优；zeta电位各组间差异不显著(p》0.05)，从小到大依次为1,2-丙二醇、无水乙醇、丙三醇、异丁醇、正丁醇、正丙醇，以正丙醇组最优。
[0096]
不同表面活性剂配方茶树油纳米乳颗粒形态的影响见图3。丙三醇组聚集絮凝现象较明显，1,2-丙二醇、正丁醇聚集较多，无水乙醇组，正丙醇以及异丁醇组颗粒较小，粒径大小分布均匀，以正丙醇组最优，散布均匀。
[0097]
表4不同助表面活性剂对茶树油纳米乳液理化性质的影响
[0098][0099]
2.3km值筛选
[0100]
km值对茶树油纳米乳液理化性质的影响见表5。4:1、5:1组粒径显著高于其余各组(p《0.05)，其余各组间差异显著，从小到大依次为1:2、1:1、2:1、3:1组，以1:2组最优；1:2、1:1、2:1组pdi显著低于3:1、4:1、5:1组(p《0.05)，5:1组显著高于3:1组(p《0.05)，与4:1组差异不显著(p》0.05)，以1:2组最优；3:1、4:1、5:1组zeta电位显著大于1:2、1:1、2:1组(p《0.05)，1:1组zeta电位显著高于1:2组(p《0.05)，与1:1组差异不显著(p》0.05)，以5:1组最优。
[0101]
km值对茶树油纳米乳颗粒形态的影响见图4。3:1、4:1、5:1组聚集絮凝现象较明显，2:1絮凝较多，1:2，1:1组颗粒较小，粒径大小分布均匀，以1:1组最优，散布均匀。
[0102]
表5不同km值对茶树油纳米乳液理化性质的影响
[0103][0104]
2.4油相水相比例筛选
[0105]
不同助表面活性剂对茶树油纳米乳液理化性质的影响见表6。结果表明，1:18、2:17、3:16组粒径显著低于其4:15、5:14、6:13组(p《0.05)，6:13组显著高于其余各组(p《0.05)，以2:17组最优；3:16、5:14组pdi显著低于1:18、4:15、6:13组(p《0.05)，1:18组显著高于其余各组(p《0.05)，2:17、4:15、6：13组间差异不显著(p》0.05)，从小到大依次为5:14、3:16、2:17、6:13、4:15、1:18组，以5:14组最优；1:18、2:17组zeta电位显著大于其余各组(p《0.05)，4:15组zeta电位显著低于6:13组(p《0.05)，与3:16、5:14组差异不显著(p》0.05)，以1:18组最优。
[0106]
不同油相水相比例对茶树油纳米乳颗粒形态的影响见图5。4:15、5:14、6:13组聚集絮凝现象较明显，3:16絮凝较多，1:18组，2:17组颗粒较小，粒径大小及分布均匀，以2:17组最优，且散布均匀。
[0107]
表6不同油相及水相比例对茶树油纳米乳液理化性质的影响
[0108][0109]
2.5纳米乳液稳定性检测
[0110]
2.5.1热稳定性
[0111]
经25、50、75、105℃处理15min后，纳米乳液外观见图6，各组外观无浑浊、分层等显著变化。
[0112]
2.5.2离心稳定性
[0113]
茶树油纳米乳液稳定性参数结果见表7。各组离心前后550nm除吸光度在2.306～2.54间，离心后550nm处吸光度在2.099～2.292间，稳定性参数在6.375～9.763％间，均值为8.372
±
1.024％。
[0114]
表7茶树油纳米乳液稳定性参数结果
[0115][0116]
3.实验结果分析
[0117]
本试验通过测定粒径等指标发现，大豆卵磷脂制成的茶树油纳米乳液通过尼罗红染色观察颗粒形态发现其颗粒均匀分布。
[0118]
本试验通过测定粒径等指标发现，大豆卵磷脂粒径约116nm，pdi值约0.272，zeta电位绝对值约45mv，并且其颗粒均匀分布。虽然大豆卵磷脂不是各项最优的，但综合性能较好。一般认为pdi值在0.3以下，zeta电位绝对值在25mv以上，稳定性较强。此外，在常温静置36天后，发现除大豆卵磷脂外均表现出油水分层。综上所述，大豆卵磷脂可作为优质表面活性剂用于茶树精油乳化。
[0119]
在筛选出表面活性剂后，本试验进行了助表面活性剂的筛选。助表面活性剂可以有效降低纳米乳液形成过程中油相及水相间的表面张力，减小体系粘度，抑制结晶相或乳胶结构的形成，从而促进纳米乳液的形成和稳定。结果表明正丙醇组粒径、pdi以及zeta电位均最优，并且通过染色观察其颗粒散布均匀。综上所述，正丙醇可作为优质助表面活性剂用于茶树油乳化。
[0120]
在筛选出表面活性剂及助表面活性剂后，本试验进一步进行了km值的筛选。研究表明，使用表面活性剂及助表面活性剂制作精油纳米乳液可以有效提高精油的溶解性，稳
定性。不仅表面活性剂，助表面活性剂种类对纳米乳液性能有影响，表面活性剂及助表面活性剂比例对茶树油纳米乳液性能也有影响。结果表明虽然1:2组粒径及pdi最优，但1:1组pdi与1:2组相差较小，并且1:1组zeta电位显著高于1:2组，通过尼罗红染色液发现其颗粒形态最优，散布均匀。综上所述，茶树油纳米乳液适宜表面活性剂及助表面活性剂比例为1:1。
[0121]
最后，本试验进行了纳米乳液油相及水相比例的筛选。在纳米乳液体系中，表面活性剂及助表面活性剂添加量固定时，其负载油相能力也是固定的。因此探寻油相及水相比例对寻找其中负载能力大，且兼顾稳定性纳米乳液有重要意义。本研究旨在制备茶树油水包油型纳米乳液，因此油水比例设计均超过50％。结果表明：粒径以2:17最优，pdi虽以5:14最优，但2:17组zeta电位高于5:14，并且染色发现其颗粒形态分布均匀。综上所述，茶树油纳米乳液适宜油相及水相比例为2:17。
[0122]
筛选出纳米乳液配方后对茶树油纳米乳液性能进行表征。先进行乳液类型的判定。同时向茶树油乳液中加入苏丹ⅲ染液和亚甲基蓝染液，观察其扩散速率。亚甲基蓝扩散速率明显高于苏丹ⅲ，因此制备的茶树油纳米乳液为水包油型。接着对乳液稳定性进行测试。表面活性剂性能可能随着温度而变化，因此进行热稳定性的研究很有必要。本文将制备好的茶树油纳米乳液放入25、50、75、100℃恒温处理15min，处理后外观无分层或浑浊等现象，表明温度稳定性较好。最后进行离心稳定性测试，结果显示茶树油纳米乳液稳定性参数在10％以下，而在胡柚精油上的研究表明稳定性参数25％即视为离心稳定性较好。
[0123]
4.总结
[0124]
茶树油纳米乳液最佳配方为以大豆卵磷脂为表面活性剂，正丙醇为助表面活性剂，表面活性剂及助表面活性剂比例为1:1，油相及水相比例为2:17。此配方下通过超声破碎法制得茶树油纳米乳液粒径约102.931
±
1.606nm，pdi约0.135
±
0.005，zeta电位约-53.5
±
1.809mv，乳液颗粒均匀，乳液类型为水包油型，温度稳定性及离心稳定性良好。
[0125]
实施例2茶树油纳米乳液抑菌作用及抗氧化能力的研究
[0126]
1.材料与方法
[0127]
1.1试验材料
[0128]
试验药品见表8。试验用菌种为试验室保存嗜水气单胞菌nj-35和非o1霍乱弧菌。试验用培养基为营养肉汤培养基，培养基配方见表9。
[0129]
表8试验试剂
[0130][0131]
表9 nb培养基成分
[0132][0133]
1.2试验方法
[0134]
1.2.1样品处理
[0135]
茶树油原液用1％二甲基亚砜溶解至10％(tto)。茶树油纳米乳液制作见第二章1.3.1(ntto)。采用水产常用抗氧化剂乙氧基喹啉做阳性对照，使用10％二甲基亚砜稀释至10％(eth)。将大豆卵磷脂及正丙醇混合溶液(1:1)以5％浓度于磁力搅拌机充分混匀作为对照组。各试验组于25、65、105℃处理15min。
[0136]
1.2.2抑菌圈测定
[0137]
先在28℃条件下，将嗜水气单胞菌nj-35培养至对数阶段，然后以无菌磷酸缓冲液稀释至1
×
107cfu/ml。移液枪吸取100μl菌液于nb培养基，均匀涂布后用打孔器打孔，将处理后的茶树油原液、茶树油纳米乳液、大豆卵磷脂和正丙醇混合物取100μl加入孔中，接着放入恒温培养箱28℃，24h后取出测量抑菌圈直径，每个试验重复三次，取其均值。
[0138]
1.2.3 mic及mbc测定
[0139]
mic及mbc测定方法参照ozogul等[61]。在96孔板一个孔中加入150μl药液以及150μl肉汤，依次使用肉汤进行二倍稀释，接着在每个孔中加入2μl 1
×
107cfu/ml的菌液，使得每个孔中浓度依次为50mg/ml、25mg/ml直至0.39mg/ml、0.19mg/ml。最后将96孔板置于恒温培养箱中28℃培养，24h后观察。肉眼观察无菌生长的即为mic，随后取mic前三个孔，吸取100μl涂布至nb培养基中，于28℃恒温箱中培养24h后观察，无细菌生长即为mbc。
[0140]
1.2.4抗氧化能力测定
[0141]
抗氧化能力采用南京建成试剂盒测定：总抗氧化能力使用frap法(货号a015-3-1)，抑制羟自由基能力使用比色法(货号a018-1-1)，dpph自由基清除能力(货号a153-1-1)。抗氧化能力所测数据中，精油原液组及乙氧基喹啉组数据因使用dmso稀释应减去dmso抗氧化值；纳米乳液组需减去大豆卵磷脂及正丙醇混合溶液抗氧化值。
[0142]
1.2.5数据处理
[0143]
数据采用spss20.0进行双因素方差分析，研究温度与乳化工艺交互作用。不同温度间差异分析采用duncan’s多重比较。乳化前后数据差异分析采用独立样本t检验。分析所得数据使用graphpad 8.0.2绘图。
[0144]
2.结果
[0145]
2.1抑菌圈
[0146]
不同温度处理后茶树油原液及纳米乳液对两种菌株抑菌直径如图7所示。温度与乳化交互作用影响不显著(p》0.05)。乳化前后，相同处理温度下ntto组对两种菌株抑菌圈均大于tto组。温度处理后，随着处理温度的升高，tto组及ntto组抑菌圈均缩小。
[0147]
2.2最小抑菌浓度及最小杀菌浓度
[0148]
不同温度处理后茶树油原液及纳米乳液对两种菌株mic如图8所示。由图可知，tto组各温度下对嗜水气单胞菌及非o1霍乱弧菌mic值均为3.13mg/ml，ntto组均为1.56mg/ml，
低于tto组。
[0149]
不同温度处理后茶树油原液及纳米乳液对两种菌株mbc如图9所示。由图可知，tto组各温度下对嗜水气单胞菌nj-35mbc为6.25mg/ml，ntto组25℃处理下为1.56mg/ml，在65及105℃下为3.13mg/ml；tto组对非o1霍乱弧菌mbc在25℃下为3.13mg/ml，在65及105℃下为6.25mg/ml，ntto组mbc各温度下均为1.56mg/ml。
[0150]
2.3总抗氧化能力
[0151]
不同温度处理后茶树油原液、纳米乳液及乙氧基喹啉t-aoc如图10所示。温度与乳化工艺对各样本总抗氧化能力交互作用影响不显著(p》0.05)。乳化前后，eth组t-aoc显著高于其余各组(p《0.05)，ntto组显著高于tto组(p《0.05)。温度处理后，tto组各温度处理间差异显著，105℃处理t-aoc最低。ntto组25℃显著高于65、105℃(p《0.05)，65、105℃间差异不显著(p》0.05)。
[0152]
2.4抑制羟自由基能力
[0153]
不同温度处理后茶树油原液、纳米乳液及乙氧基喹啉抑制羟自由基能力如图11所示。温度与乳化工艺对各样本抑制羟自由基能力交互作用影响不显著(p》0.05)。乳化前后，eth组显著高于ntto组(p《0.05)，ntto组显著高于tto组(p《0.05)。温度处理后，tto组25℃处理显著高于65、105℃处理(p《0.05)，65、105℃处理间差异不显著。ntto组各温度处理间差异显著(p《0.05)，105℃处理抑制羟自由基能力最低。
[0154]
2.5 dpph自由基清除能力
[0155]
不同温度处理后茶树油原液、纳米乳液及乙氧基喹啉dpph自由基能力如图12所示。温度与乳化工艺对各样本dpph自由基清除能力交互作用影响不显著(p》0.05)。组间分析可得，ntto组显著高于tto组(p《0.05)，tto组显著高于eth组(p《0.05)。组内分析可得，tto组各温度处理间差异显著(p《0.05)，105℃处理dpph自由基清除能力最低。ntto组25℃处理显著高于65、105℃处理(p《0.05)，65、105℃间差异不显著(p》0.05)。
[0156]
3.实验结果分析
[0157]
3.1抑菌性能：本试验进一步测定了茶树油及其纳米乳液在不同温度处理后对两菌株最小抑菌浓度及最小杀菌浓度。试验结果显示ntto组对两种受试菌株，各温度处理后mic为1.56mg/ml，tto组均为3.13mg/ml。这表明了相同精油浓度下纳米乳液体系抑菌性能优于精油原液。茶树油原液及纳米乳液对两种菌株mbc结果显示，ntto组mbc低于tto组，这表明了纳米乳液体系可以提高精油抑菌效果。但是在各温度处理后，茶树油原液及纳米乳液其抑菌性能略有改变。ntto组中65、105℃处理后较25℃处理后对于嗜水气单胞菌nj-35mbc提高，tto组65、105℃处理后较25℃处理后对于非o1霍乱弧菌mbc提高。这些都表明了无论是精油原液还是纳米乳液，在经过高温处理后，其抑菌性能均可能下降。但是将精油纳米乳化后，其下降后的抑菌性能仍高于精油原液。综上所述，纳米乳化技术可以有效提高精油抑菌性能，其原因可能是纳米乳液颗粒较小，在水中均匀分布，与细菌接触面积较大，并且易于破坏细菌细胞膜。
[0158]
3.2抗氧化能力：本文以水产常用抗氧化剂乙氧基喹啉作为阳性对照组，茶树油原液、纳米乳液作为处理组，测定不同温度条件下各组抗氧化能力。首先进行了总抗氧化能力的测定。横向对比发现eth组总抗氧化能力最强，其次为ntto组，tto组最小。总抗氧化能力指的是该体系抗氧化能力总和，这说明茶树油纳米乳化后其抗氧化能力强于精油原液。程
晨等[97]发现将山苍子精油微乳化后，其抗氧化能力显著提高，这与本文结果类似。此外，将tto组组内分析可得，25、65、105℃处理后，其抗氧化能力差异显著，这表明温度对茶树油原液总抗氧化能力影响显著。而ntto组与eth组，25℃处理后t-aoc显著高于65、105℃，65℃及105℃间抗氧化能力差异不显著。这说明纳米乳化后的茶树油与乙氧基喹啉总抗氧化能力对温度影响抵抗能力较强。综上所述，茶树油乳化后其总抗氧化能力提升，并且温度稳定性提高。接着进行了羟自由基的测定。本试验结果表明eth组抑制羟自由基能力最强，ntto组次之，tto组最弱。这说明茶树油纳米乳液抑制羟自由基能力强于精油原液。将各组进行组内对照，发现tto组25℃处理后显著高于65、105℃，65及105℃间差别较小。而ntto及eth组三个温度均有较大差别。这说明对于抑制羟自由基能力这一指标，纳米乳液及乙氧基喹啉均受温度影响较大。但是茶树油纳米乳液组仍显著高于茶树油原液组。综上所述，茶树油纳米乳化后，其抑制羟自由基能力提高。
[0159]
最后，本试验进行了dpph自由基清除能力的测定。生物体的各项生命活动都会产生自由基，而过多的自由基会对机体造成永久性损伤
[112]
。dpph自由基是一种以氮为中心的自由基。本文测定了茶树油原液、纳米乳液以及乙氧基喹啉在不同温度下的dpph自由基清除能力。ntto组dpph自由基清除能力最强，tto组次之，eth组最弱。这说明在dpph自由基清除能力上，茶树油原液性能优于乙氧基喹啉这种常用抗氧化剂，并且乳化后其性能进一步提升。将各组进行组内对比，发现ntto组及eht组25℃处理后高于65、105℃处理，65、105℃处理间差距较小，而tto组各温度间差异较大。这表明了茶树油乳化后其dpph自由基清除能力温度稳定性较强。刘欣等
[112]
发现玫瑰精油在正常储存、光照等条件下，乳化后其抗氧化能力下降速率低于精油原液，这也说明了乳化可以有效提高精油抗氧化能力稳定性，与本文结果一致。综上所述，茶树油乳化后，不仅dpph自由基清除能力增强，而且对于温度稳定性也有所增强。
[0160]
4.总结
[0161]
将筛选出的纳米乳液、精油原液经不同温度处理后进行抑菌性能及抗氧化能力测定，结果表明：
[0162]
(1)茶树油纳米乳液对于嗜水气单胞菌nj-35和非o1霍乱弧菌抑菌圈、最小抑菌浓度以及最小杀菌浓度均优于茶树油原液。
[0163]
(2)高温会降低纳米乳液、精油原液的抗氧化能力，茶树油纳米乳液总抗氧化能力、抑制羟自由基能力以及dpph自由基清除能力均优于茶树油原液。
[0164]
实施例3：茶树油纳米乳液对克氏原螯虾生长性能、抗氧化及免疫相关基因表达的影响
[0165]
1.材料与方法
[0166]
1.1试验动物
[0167]
试验用克氏原螯虾购自江苏省淡水研究所禄口基地，暂养一周后，选取规格相近，健康活跃，平均体重为9.19
±
0.14g的克氏原螯虾虾苗作试验虾。
[0168]
1.2试验饲料
[0169]
以进口鱼粉、菜粕、豆粕、虾粉等为蛋白源，豆油为脂肪源制作基础饲料，试验分空白对照基础饲料组(ct)，基础饲料添加50mg/kg虾青素作为阳性对照组(as50)，在as组基础上添加不同含量茶树油纳米乳液作处理组，分别为50mg/kg茶树油组(as50 ast50)，100mg/
kg茶树油组(as50 ast100)，200mg/kg茶树油组(as50 ast200)，400mg/kg茶树油组(as50 ast400)。茶树油纳米乳中茶树油含量为10％；试验用虾青素由广州立达尔生物科技股份有限公司提供，虾青素含量为10％。饲料配方与营养成分见下表。
[0170]
表10试验饲料配方及营养组成(风干基础)
[0171]
原料ingredientsctas50as50 ast50as50 ast100as50 ast200as50 ast400国产鱼粉fish meal3.003.003.003.003.003.00豆粕soybean meal23.0023.0023.0023.0023.0023.00菜粕rapeseed meal14.0014.0014.0014.0014.0014.00虾粉shrimp powder5.005.005.005.005.005.00肉粉meat meal5.005.005.005.005.005.00血粉blood meal2.002.002.002.002.002.00玉米酒糟ddgs5.005.005.005.005.005.00面粉wheat flour27.0027.0027.0027.0027.0027.00米糠rice bran6.006.006.006.006.006.00豆油soya-bean oil2.502.502.502.502.502.50磷酸二氢钙ca(h2po4)22.002.002.002.002.002.00预混料premix2.002.002.002.002.002.00粘合剂cement0.500.500.500.500.500.50食盐nacl0.200.200.200.200.200.20乌贼膏squid paste2.002.002.002.002.002.00赖氨酸lys0.180.180.180.180.180.18膨润土bentonite0.580.530.480.430.330.13蛋氨酸met0.040.040.040.040.040.04虾青素astaxanthin0.000.0050.0050.0050.0050.005茶树油tea treeoil0.000.000.0050.0100.0200.040总和total100100100100100100营养成分nutrient levels
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
粗蛋白crude protein32.6932.6932.6932.6932.6932.69粗脂肪ee6.796.796.796.796.796.79粗灰分ash8.988.988.988.988.988.98赖氨酸1.771.771.771.771.771.77蛋氨酸0.680.680.680.680.680.68
[0172]
1.3试验设计与管理
[0173]
为期8周的养殖试验于江苏省淡水水产研究所禄口基地进行。将720尾克氏原螯虾幼虾，分为6个组，每组3个平行，每个平行40尾虾，随机投放于18个水泥池。每个水泥池长3m，宽2m，水深1m，具有24h增氧以及独立的进排水系统。每日于7点，19点投喂两次，投喂量为克氏原螯虾体重的3％-5％，早7点投喂3h后进行吸污。试验期间平均水温在24
±
5℃，每天记录投喂量，残饵料、死虾数目及重量，测量水温、检测水质。每日早晚将循环系统打开一小时，试验水体中溶氧＞6.0mg/l，ph保持在7.8-8.0，氨氮＜0.2mg/l，亚硝酸盐＜0.005mg/l。
[0174]
1.4样品采集
[0175]
养殖试验结束后，克氏原螯虾禁食24h取样，以水泥池为单位称重、记数，计算生长指标；每组取9尾克氏原螯虾(每个水泥池3尾)，用酒精消毒纱布擦干体表水分，围心腔采
血，静置后在4℃、3000r/min离心10min，取上清液，-20℃保存待测；采血淋巴后，取肠道及肝胰腺。另取6尾全虾放入-20℃冰箱待测。
[0176]
1.5测定指标及计算公式
[0177]
1.5.1生长性能
[0178]
增重率(weight gain rate，wgr，％)＝100
×
(wt-w0)/w0
[0179]
特定生长率(specific growth rate，sgr，％)＝100
×
(ln wt-ln w0)/t
[0180]
饵料系数(feed conversion ratio，fcr)＝fi/(wt-w0)
[0181]
其中w0为克氏原螯虾初始均重，wt为克氏原螯虾末均重，t为养殖天数，fi表示每只克氏原螯虾平均摄食饲料总量。
[0182]
1.5.2抗氧化指标
[0183]
用冰生理盐水清洗肠道，滤纸吸干水分，然后称重，捣碎后移入匀浆器中冰水浴匀浆。用离心机在4℃、2500r/min离心10min，取上清液待测。选用南京建成试剂盒测定抗氧化指标，并按说明书进行测定。总抗氧化能力使用比色法(a015-1-2)；抗超氧阴离子自由基能力使用比色法(a052-1-1)；丙二醛含量使用tba法(a003-1)。
[0184]
1.5.3基因表达
[0185]
克氏原螯虾astacidin蛋白(astacidin)，甲壳肽(crustin)，热休克蛋白70(hsp70)，亲环素蛋白a(cypa)，细胞外铜锌超氧化物歧化酶(cuznsod)，toll样受体3(toll3)，以及内参基因18s rna的引物由上海捷瑞公司合成，引物序列见表4-2。首先参照song等步骤，使用trizol(rnaiso plus，takara)法提取克氏原螯虾肠道rna，用rnase-free dnase(takara)纯化以避免基因组dna扩增，然后用nanodrop2000测定总rna浓度，并用rnase free水调节浓度至500ng/μl。根据说明书使用primescripttmrt试剂盒(takara)反转为cdna。接着使用takara两步法试剂盒，仪器使用cfx96 real-time pcr detection system，qrt-pcr体系为20μl，荧光定量测定基因表达量。反应程序为95℃60s，95℃15s、56℃15s、72℃4s，共40循个环。选用18s rrna作为内参基因，使用2-δδct
法测定crustin、astacidin、hsp70基因相对表达量。
[0186]
表11克氏原螯虾免疫相关基因rt-pcr引物序列
[0187][0188]
2.结果与分析
[0189]
2.1饲料中茶树油对克氏原螯虾生长性能的影响
[0190]
饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾生长性能的影响如表15所示。添加了茶树油与虾青素后，as50组与对照ct组相比，饵料系数显著降低(p《0.05)，末均重、增重率、特定生长率虽有提高但差异不显著(p》0.05)。添加了茶树油后，末增重，增重率，特定生长率呈先升高后降低趋势，于as50 ast100组达到最高值。与as50组、对照ct组相比，as50 ast100组末均重，增重率，特定生长率显著提高(p《0.05)。饵料系数呈升高趋势，as50 ast50，as50 ast100组饵料系数与as50组差异不显著(p》0.05)，但显著低于ct组(p《0.05)。
[0191]
饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾增重率及饵料系数的影响如图13所示。图13表明，在克氏原螯虾饲料中存在50mg/kg虾青素条件下，分别添加50mg/kg茶树油组(as50 ast50)，100mg/kg茶树油组(as50 ast100)，200mg/kg茶树油组(as50 ast200)，400mg/kg茶树油组(as50 ast400)等试验组，以增重率为指标，通过折线模型获得茶树油适宜添加量为71.40mg/kg，以饵料系数为指标，茶树油适宜添加量为71.25mg/kg。
[0192]
表12饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾生长性能的影响
[0193]
指标indexctas50as50 ast50as50 ast100as50 ast200as50 ast400初均重/g ibw9.20
±
0.019.20
±
0.019.20
±
0.009.21
±
0.019.20
±
0.019.19
±
0.01末均重/g fbw24.46
±
0.34a25.78
±
0.69
ab
27.01
±
0.85
ab
28.70
±
0.79c25.39
±
1.15
ab
26.28
±
0.29
ab
增重率/％wgr165.76
±
3.76a180.16
±
7.40
ab
193.66
±
9.27
bc
211.71
±
8.42c175.97
±
12.29
ab
186.09
±
3.39
abc
特定生长率/％sgr1.55
±
0.02a1.63
±
0.04
ab
1.71
±
0.05
bc
1.80
±
0.04c1.61
±
0.07
ab
1.67
±
0.02
abc
饵料系数/％fcr2.38
±
0.20c1.83
±
0.04a1.69
±
0.14a1.71
±
0.04a2.22
±
0.08
bc
1.82
±
0.12
ab
[0194]
2.2饲料中茶树油纳米乳液对克氏原螯虾抗氧化能力的影响
[0195]
饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾抗氧化能力的影响如图14所示。添加虾青素后，与ct组相比，as50组血淋巴及肠道中总抗氧化能力显著提高(p＜0.05)，丙二醛含量略有降低但无显著差异(p＞0.05)，抗超氧阴离子自由基活力略有提高但无显著差异(p＞0.05)。在虾青素as50组基础上添加茶树油纳米乳液后，随着茶树油纳米乳液添加量的提高，血淋巴及肠道组织中总抗氧化能力及抗超氧阴离子自由基活力呈先升高后降低趋势，
于as50 st100组达到最高，并与ct组、as50组差异显著(p＜0.05)；血淋巴丙二醛含量呈升高趋势，肠道丙二醛含量呈先降低后升高趋势，其中与ct组、as50组相比，as50 ast50组、as50 ast100组显著降低了血淋巴、肠道丙二醛含量(p＜0.05)。
[0196]
2.3饲料中茶树油纳米乳液对克氏原螯虾免疫相关基因表达的影响
[0197]
饲料中不同茶树油含量对克氏原螯虾免疫相关基因表达的影响见图15。饲料中添加虾青素后，as50组相比于对照ct组crustin，astacidin，cuznsod以及hsp70基因表达显著升高(p＜0.05)。此as50基础上添加了茶树油后，随着茶树油纳米乳液含量的提高，crustin，astacidin基因呈上升趋势，as50 ast50最低，显著低于其余各组(p＜0.05)，as50 ast200及as50 ast400组与as50组差异不显著(p＞0.05)，显著高于其余各组。cuznsod基因表达量随茶树油添加呈先升高后降低趋势，as50 ast50及as50 ast100组显著高于其余各组(p＞0.05)。添加茶树油纳米乳液后，各茶树油添加组hsp70表达量与as50组无显著差异(p＞0.05)，与ct组差异显著(p＜0.05)。此外，cypa与toll3表达量各组间无显著差异(p＞0.05)。
[0198]
3.实验结果分析
[0199]
以茶树油纳米乳液添加量为自变量，分别以增重率及饵料系数为指标，进行回归折线模型分析。结果显示，饲料中50mg/kg虾青素存在条件下，茶树油纳米乳液适宜添加量分别为71.40mg/kg及71.25mg/kg。这与liu等的结果类似，在罗氏沼虾饲料中添加100mg/kg茶树油纳米乳液，间隔两周投喂可以显著调高养殖动物的生长性能及非特异性免疫能力。
[0200]
本试验中添加了虾青素后，as50组相比于ct组，总抗氧化能力及抗超氧阴离子自由基能力显著提高。在as50组添加了茶树油纳米乳液后，茶树油纳米乳液添加组克氏原螯虾抗氧化能力随着茶树油纳米乳液含量的提高呈先升高后降低趋势。as50 ast100显著高于as50组，这表明饲料中添加茶树油纳米乳液与虾青素可能对克氏原螯虾抗氧化能力具有促进作用。
[0201]
3.3饲料中茶树油纳米乳液对克氏原螯虾免疫相关基因表达的影响
[0202]
本试验中，添加了虾青素后，astacidin和crustin基因表达量均高于ct组。在此基础上添加了茶树油后，随着茶树油纳米乳液添加量的提高，astacidin及crustin基因表达呈升高趋势，as50 ast50组基因表达显著低于as50组(p《0.05)，as50 ast200及as50 ast400组与as50组相近。这表明低剂量茶树油纳米乳液降低了astacidin及crustin基因表达，是因为低剂量茶树油纳米乳液仅具有抑菌效果，降低了外界病原菌的入侵，从而使得抗菌肽astacidin以及crustin基因的表达量下调。
[0203]
本研究中，添加了虾青素后，cuznsod基因表达量显著提高，而添加茶树油后，随着茶树油纳米乳液含量的提高，其表达量呈先升高后降低趋势，as50 ast50及as50 ast100组显著高于as50组(p《0.05)。
[0204]
4.总结
[0205]
本实施例试验结果表明，饲料中添加50mg/kg虾青素可以提高克氏原螯虾生长性能，抗氧化能力及非特异性免疫力。以增重率及饵料系数进行回归分析得到茶树油适宜添加量分别为71.40mg/kg及71.25mg/kg。同时添加50mg/kg虾青素与100mg/kg茶树油纳米乳液，显著提高了克氏原螯虾增重率，特定生长率，总抗氧化能力，抗超氧阴离子自由基能力以及cuznsod基因表达，显著降低了饵料系数及丙二醛含量。综上所述，饲料中50mg/kg虾青
素存在条件下，添加100mg/kg茶树油纳米乳液可以提高克氏原螯虾抗氧化能力与免疫能力，促进生长。
[0206]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。