脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物及其制备方法

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物及其制备方法。


背景技术：

2.中性粒细胞是血液中主要的白细胞，被认为是抵御细菌的第一道天然防线。由于它们在血液中循环8-12小时，在移入组织中仅需2-5天，它们需要在生物体中不断被替换，对其增殖主要受粒细胞集落刺激因子(g-csf)控制。而化疗会引起的中性粒细胞减少症(cin)，增加感染的风险，感染会表现为发烧，即发热性中性粒细胞减少症(fn)，因此增加了可能出现严重后果的可能性。而fn和严重或长期的cin会导致化疗延迟或中断，会影响患者的最佳治疗。
3.目前研究发现g-csf可以通过与粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)结合，促进粒系细胞的增殖、分化与迁移，增强成熟粒细胞的功能。重组人粒细胞集落刺激因子(rhg-csf)是由175个氨基酸组成的非糖基化蛋白,具有一个游离的半胱氨酸残基cys 18，分子量为18.8kda。与天然g-csf的氨基酸序列相比，n末端多出一个甲硫氨酸。rhg-csf在治疗与癌症化疗相关的骨髓抑制方面取得了成功，已批准用于下列临床适应症：接受骨髓抑制化疗的癌症患者；接受诱导或固化化疗的急性髓系白血病患者；接受骨髓移植(bmt)的癌症患者；接受外周血祖细胞收集和治疗的患者；严重慢性中性粒细胞减少患者。一些研究者还发现rhg-csf在缺血性脑梗死、调节免疫、鼻咽癌放射治疗引发的急性口腔粘膜炎等方面有一些良好的作用。rhg-csf还被应用于所有受到大量辐射照射导致造血急性辐射综合症(ars)的患者。
4.目前主要有三种短效的rhg-csf供临床使用，即非糖基化甲硫氨酰基重组人g-csf(r-met hu g-csf)如非格司亭(filgrastim)、糖基化g-csf如来格司亭(lenograstim)、g-csf的突变基因产物如那托司亭(nartograstim)。在临床上用于癌症患者的中性粒细胞减少症都有着不错的效果，但作为一种蛋白药物，rhg-csf在体内迅速降解或被肾脏清除，导致血浆半衰期短需要反复频繁给药，这不仅增加了患者的痛苦，而且重复注射也极易引发一些不良反应。因此，非常有必要利用长效化技术对rhg-csf进行二次开发来改善其体内用药效果。
5.脂肪链修饰技术是近年来发展的一种新型的蛋白药物长效化技术。与目前常见的长效化技术，特别是peg相比，脂肪链修饰具有以下的优势：(1)脂肪链修饰可遮蔽蛋白质多肽分子易受酶进攻的区域，从而延缓或抑制蛋白水解酶的破坏作用，延长体内作用时间；另外，脂肪链修饰主要通过与人血清白蛋白(hsa)结合改善药物的半衰期。由于脂肪酸是血浆hsa与天然的配体，可与hsa可逆结合，由于hsa的分子量大以及它可以与fc受体(fcrn)结合，当脂肪链修饰药物与hsa结合时，限制蛋白酶进入药物，大大减少肾清除，并利用fcrn介导的循环，从而延长药物半衰期。有研究表明增加脂肪链修饰药物的脂肪链长度通常会导致更紧密的hsa结合和增加治疗半衰期。某些情况下，脂肪链修饰还能诱导药物自组装形成
多聚体，进一步延长其在体内的半衰期；(2)脂肪酸是构成人体脂肪、类脂和细胞膜磷脂的重要成分，一方面不容易产生免疫原性，另一方面有助于提高亲水性药物的脂溶性，增大肠道黏膜透过性，因此脂肪链修饰更有助于提高药物的脂溶性、肠道黏膜透过性及吸收效率，有可能实现口服、外用和肺部给药。如脂肪链修饰的glp-1药物——索马鲁肽，其口服制剂已经由fda获批上市；(3)有研究证明脂肪链修饰可以干扰t细胞的活化，因为它能减少与mhc ii分子结合，降低了免疫原性。目前已有地特胰岛素、德谷胰岛素、利拉鲁肽和索玛鲁肽等几种脂肪酸修饰药物上市，2020年全球销售总额达到100亿美元，市场前景广阔。目前还未见脂肪链修饰hg-csf的报道。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供一种新型的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物，延长人粒细胞集落刺激因子在体内的持续作用时间、减少给药次数，提高药物生物利用度和改善病人的依从性。
7.本发明的另一个目的是提供一种上述脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物制备方法，获得高收率、高纯度和高均一性的产物，易于实现工业化生产。
8.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
9.一种如式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子(hg-csf)衍生物，
[0010][0011]
其中，r1为脂肪链，分子通式为c
nh2(n-m) 1
(n＝1-32的整数，m＝0-6的整数,n＞m)；r2为人粒细胞集落刺激因子除半胱氨酸残基的游离巯基的部分，所述的人粒细胞集落刺激因子是天然来源的人粒细胞集落刺激因子、基因重组的人粒细胞集落刺激因子或者人粒细胞集落刺激因子突变体。
[0012]
优选地，r1为c
15
直链烷基。
[0013]
本发明还提供上述式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物的制备方法，所述方法为：
[0014]
在二甲基亚砜-磷酸钠盐缓冲液中，式(ii)所示的脂肪链-马来酰亚胺与式(iii)所示的人粒细胞集落刺激因子在4-40℃下反应1-120min(优选20℃反应5-30min，特别优选30min)，所得反应液经分离纯化，得到所述式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物；所述二甲基亚砜-磷酸钠盐缓冲液以10-100：90-0(优选90:10)的体积比配制而成(0就是缓冲液为纯二甲基亚砜，没有磷酸钠盐缓冲液)，磷酸钠盐缓冲液ph为6.5-8.0(优选为7.0)；所述式(ii)所示的脂肪链-马来酰亚胺与式(iii)所示的人粒细胞集落刺激因子的摩尔比为10-0.1:1(优选为5:1)；
[0015][0016]
其中，r1为脂肪链，分子通式为c
nh2(n-m) 1
(n＝1-32的整数，m＝0-6的整数,n＞m)；r2为人粒细胞集落刺激因子除半胱氨酸残基的游离巯基的部分，所述的人粒细胞集落刺激因子是天然来源的人粒细胞集落刺激因子、基因重组的人粒细胞集落刺激因子或者人粒细胞集落刺激因子突变体。
[0017]
优选地，r1为c
15
直链烷基。
[0018]
进一步，所述二甲基亚砜-磷酸钠盐缓冲液的体积以所述式(iii)所示的人粒细胞集落刺激因子的质量计为0.1-10mg/ml(优选1mg/ml)。
[0019]
进一步，所述分离纯化后处理为：所述反应液经反相液相色谱法纯化，色谱柱为bio-c8(21.2
×
250mm,10μm)，流动相a和b分别为100％纯水(用tfa调节ph为4.2)和100％乙腈(用tfa调节ph为4.2)，40％-55％流动相b线性梯度洗脱5min，55％-75％流动相b线性梯度洗脱20min，流速为10ml/min，检测波长为280nm，收集含目标化合物的洗脱液，旋蒸去除乙腈，以10mmol/l ph 4.2的醋酸缓冲液为透析液进行透析，所得截留液超滤浓缩，即得所述式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物(存在于醋酸缓冲液中)。
[0020]
优选地，所述式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物以以下方式保存：将上述超滤浓缩过的截留液配置成含有5％山梨醇和0.0033％吐温20的溶液保存于4℃冰箱。
[0021]
进一步，所述式(ii)所示的脂肪链-马来酰亚胺按以下方法制备：脂肪链-马来酰亚胺由脂肪胺跟马来酸酐反应得到，采用目前文献报道的公认方法制备。使用反相高效液相制备柱对脂肪链-马来酰亚胺进行分离纯化。纯化后的脂肪链-马来酰亚胺用反相高效液相色谱分析纯度。通过质谱分析确定其分子量。使用nmr检测确定其化学结构的正确性。
[0022]
优选地，所述脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木质素酸、蜡酸、褐煤酸、蜜蜡酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
[0023]
本发明提供一种上述式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物的药学上可接受的盐。
[0024]
本发明提供一种式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物或其药学上可接受的盐的制剂(如负载到人体可接受的载体上，也可制成制剂)。
[0025]
本发明还提供一种式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物、式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物的药学上可接受的盐或式(i)所示的脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物的制剂在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症的药物中的应用。
[0026]
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0027]
与未修饰的人粒细胞集落刺激因子相比，本发明提供的新型脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物具有高的体外活性保留率，在试验动物体内持续作用时间延长，减少了给药频率，提高了药物生物利用度和疗效。采用本发明提供的制备方法，获得了收率、高纯度和高度均一的单脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物，有利于工业化生产。
附图说明
[0028]
图1 c15-mal纯度的rp-hplc分析
[0029]
图2 c15-mal的飞行时间质谱结构分析
[0030]
图3经反相制备高效液相色谱纯化后的c15-rhg-csf的纯度分析
[0031]
图4 c15-rhg-csf的maldi-tof ms分析
[0032]
图5 rhg-csf的maldi-tof ms分析
[0033]
图6 rhg-csf和c15-rhg-csf的圆二色谱分析
[0034]
图7 rhg-csf、peg-rhg-csf和c15-rhg-csf的体外活性
[0035]
图8小鼠皮下注射c15-rhg-csf或rhg-csf的血浆药物浓度-时间曲线
[0036]
图9不同剂量rhg-csf和c15-rhg-csf对ctx处理后的小鼠外周血白细胞计数的柱状图(c15-rhg-csf为单次注射，rhg-csf是分5天，每天注射0.1mg/kg或0.2mg/kg，合计0.5mg/kg或1.0mg/kg。“*”表示与正常对照组相比，(*)p《0.05，(**)p《0.01，和(***)p《0.001。)
[0037]
图10不同剂量rhg-csf和c15-rhg-csf对ctx处理后的小鼠外周血红细胞的柱状图(c15-rhg-csf为单次注射，rhg-csf是分5天，每天注射0.1mg/kg或0.2mg/kg，合计0.5mg/kg或1.0mg/kg。“*”表示与正常对照组相比，(*)p《0.05，(**)p《0.01，和(***)p《0.001。)
具体实施方式
[0038]
以下结合技术方案，将通过实施例详细叙述本发明的具体实施方式，不应理解为对本发明的限制。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学试剂公司购买，所用化学试剂均为分析纯。
[0039]
实施例1脂肪链-马来酰亚胺的合成
[0040]
将含34.17mmol棕榈酸的60ml thf溶液加到圆底烧瓶中，再加入34.17mmol tea和34.17mmol dppa在室温氮气环境下反应48h。反应完后使用温度为40
±
1℃旋蒸将溶剂去除，加入60ml的t-buoh混合通氮气在90℃回流5h。反应完再在60
±
1℃旋蒸去除溶剂，得到n-boc-十五胺,加入4mol/l hcl室温搅拌过夜，再加入等体积乙酸乙酯萃取，最后旋蒸得到正十五胺。取23.45mmol马来酸酐溶于5ml无水二氯甲烷，加入到50ml三颈烧瓶中。将23.45mmol的正十五胺溶于10ml无水二氯甲烷，并逐渐加入到三颈烧瓶中，40
±
1℃回流30分钟(部分固化)。冷却后抽滤并用冷的无水二氯甲烷洗两遍，烘干，得白色固体(n-十五烷基马来酸)。取12.8mmol n-十五烷基马来酸和8.8mmol醋酸钠溶于15ml乙酸酐中，加入到100ml圆底烧瓶中，100
±
1℃加热两个小时，冷却后加入50ml水，进分液漏斗静置，用乙醚洗两遍(2
×
30ml)，用2.0％koh溶液洗两遍(2
×
30ml)，再用30ml水洗一遍，取出有机相，旋干后溶于20ml二氯甲烷中，用mgso4干燥，过滤，旋干后得到十五烷基-马来酰亚胺(c
15-mal)粗产物。其反应方程式如下：
[0041][0042]
使用ymc制备柱(ymc-pack ods-a,20mm
×
250mm,10μm)在岛津液相lc-6ad系统中对c
15-mal进行分离纯化实验。液相色谱条件为：进样量为2ml，流速15ml/min，检测波长为210nm，使用流动相为纯水(a)和纯乙腈(b)，洗脱条件为90％(v/v)b等度洗脱60min。
[0043]
使用高效液相色谱分析纯化后c
15-mal纯度。液相色谱条件为：色谱柱为phenomenex c18(250mm
×
4.6mm,5μm)，流速1ml/min，检测波长210nm。流动相a、b分别为100％纯水和100％乙腈。在90％(v/v)b的平衡条件下进样20μl，洗脱条件为90％(v/v)乙腈等度洗脱60min。
[0044]
使用美国thermofisher公司的thermo scientific itq 1100tm对c
15-mal进行质谱分析确定其分子量。
[0045]
使用1h nmr检测c
15-mal各氢原子的化学位移，确定其化学结构，待测样品溶于氘代甲醇中，实验数据由500mhz核磁共振仪记录。
[0046]
合成得到的c
15-mal的收率为41.3％，液相纯度为98.0％(图1)。合成的c
15-mal使用质谱和1h nmr确定其结构是否正确。从图2可以看出，合成的c
15-mal的分子量为307da，与理论值相符。从表1可以看出，1h-nmr谱图的主要化学位移有0.91，1.30，1.57，3.49，6.81，其所属化学基团符合目标产物c
15-mal，表明结构正确。
[0047]
表1 c
15-mal的1h-nmr数据
[0048][0049][0050]
实施例2脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物的合成
[0051]
使用合成的c
15-mal对rhg-csf(重组人粒细胞刺激因子，杭州九源基因工程有限公司，液相色谱纯度大于98％)的半胱氨酸巯基进行定点修饰。将rhg-csf(2mg)和相应摩尔量的c
15-mal(peg与rhg-csf的摩尔比1:1,3:1,5:1或8:1)在2ml dmso与磷酸盐缓冲液的混合溶液中(dmso体积比为10％-100％反应，温度为4,20,30或40℃的条件下，反应时间分别取30min，60min，90min和120min。将ph 7.0，温度20℃、c
15-mal与rhg-csf的摩尔比5:1和反应时间30min的反应条件用作各因素分析的对照标准来确定优化的条件。反应结束后取样(每个0.5ml)，并向每个样品中加入50μl的1mol/ldtt以终止反应，用液相分析反应混合物。液相色谱分析条件为：色谱柱为tskgel protein c4-300(4.6mm
×
150mm,3μm)，流动相a和b分别为100％纯水(含0.1％tfa)和100％乙腈(含0.1％tfa)。进样量为20μl。40％-55％流动相b线性梯度洗脱5min，55％-75％流动相b线性梯度洗脱20min，流速为1ml/min，检测波长为280nm。
[0052]
优化确定了c
15-mal修饰rhg-csf的反应条件为：dmso-磷酸盐缓冲液混合溶液中dmso的体积比为90％，ph 7.0，温度20℃，c
15-mal/rhg-csf摩尔比为5:1，反应时间30min，单修饰产物转化率可达89.1％。
[0053]
实施例3脂肪链修饰的hg-csf衍生物的分离纯化
[0054]
使用反相制备柱对c15-rhg-csf进行分离纯化。制备液相色谱条件为：色谱柱为bio-c8(21.2
×
250mm,10μm)，流动相a和b分别为100％纯水(用tfa调节ph为4.2)和100％乙腈(用tfa调节ph为4.2)。进样量为500μl。40％-55％流动相b线性梯度洗脱5min，55％-75％流动相b线性梯度洗脱20min，流速为10ml/min，检测波长为280nm。
[0055]
纯化后的c15-rhg-csf需30
±
1℃旋蒸去除乙腈，随后使用截留分子量3500da的透析袋过夜透析将溶液置换成10mmol/l ph 4.2醋酸缓冲液，再使用截留分子量3000da超滤管进行浓缩，然后用反相高效液相色谱进行纯度分析，操作条件同实施例2。最终将c15-rhg-csf溶液配置成含有5％山梨醇和0.0033％吐温20的溶液保存于4℃冰箱。
[0056]
纯化得到的c15-rhg-csf收率为84.6％，液相纯度为99.0％(图3)。
[0057]
实施例4脂肪链修饰的hg-csf衍生物的表征
[0058]
实施例4-1：分子量分析
[0059]
使用maldi-tof对c15-rhg-csf和修饰前rhg-csf的分子量进行测定。操作步骤为：(1)点样：取1μl蛋白样品点至样品靶上，自然干燥后，再取0.6μl chca基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。(2)校准：在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试。(3)相关参数如下：标准物质校准范围为：线性高分子量校准物质校准范围为：66430
±
100；(4)测试样品：在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量。(5)质谱数据及图谱处理：5800maldi-tof/tof产生的原始数据及图谱由4000series explorer v3.5软件导出。
[0060]
测得的c15-rhg-csf的相对分子质量19056.762da，rhg-csf的相对分子量18819.998da，结果与其理论值相符(图4和5)。
[0061]
实施例4-2：二级结构分析
[0062]
使用日本分光jasco的j-815圆二色谱仪(circular dichroism，cd)对c15-rhg-csf和rhg-csf的二级结构进行分析。以ph 4.2醋酸缓冲液作为溶剂，将c15-rhg-csf和rhg-csf配置成浓度为0.2mg/ml，体积为1ml的溶液，通过不同波长向的cd光谱对应点吸收的正负值判断蛋白质的二级结构，具体参数设置选择比色皿0.1mm，扫描步长0.2nm，扫描速度为100nm/min，通过三次扫描得到的cd谱图取平均值。
[0063]
从图6可以看出，c15-rhg-csf相比rhg-csf的二级结构无明显变化。这表明去除反应体系中的dmso后，c15-rhg-csf能恢复rhg-csf的天然构象，且脂肪链修饰对rhg-csf的二级结构基本没有影响。
[0064]
实施例4-3：体外活性分析
[0065]
对rhg-csf和c15-rhg-csf通过mtt法在nfs-60细胞进行体外活性分析。
[0066]
(1)细胞悬液制备：取一瓶生长良好的nfs-60细胞，用已灭菌滴管转移到无菌离心管，离心收集细胞，弃上清。再用基础培养液洗三次，每次均需用滴管吹打均匀，每次1000rpm离心5分钟，弃上清，细胞重悬于基础培养液中，混匀。细胞计数采用在显微镜10
×
10倍下血球计数板计数，最后依据计数结果用基础培养液调整细胞浓度为1.0
×
105～2.0
×
105个/ml，待用。每块板所需细胞悬液》5ml。
[0067]
(2)标准品、供试品溶液制备：标准品和供试品按其标示量或蛋白含量用基础培养液预稀释至约2000iu/ml或0.03μg/ml的浓度。稀释过程中若基础培养液颜色变深，应更换
新鲜的培养液，每步稀释不得超过10倍，建议采用50μl
→
450μl稀释。其中重组人粒细胞刺激因子原液中间体稀释前需用0.22μm滤膜过滤。
[0068]
(3)检测：将供试品溶液和标准品溶液分别加在96孔细胞培养板中，排枪从高浓度向低浓度做2倍系列稀释，50μl
→
50μl，共10个稀释度，每个稀释度至少做2个复孔，每孔中分别留50μl供试品溶液和标准品溶液，弃去孔中多余溶液，每孔中加入稀释好的细胞悬液各50μl。分别加一列基础培养液100μl作为空白对照、50μl的基础培养液加50μl细胞悬液作为阴性对照。以上操作均需在无菌条件下进行；加样完毕的96孔细胞培养板置于37℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养40-48h。在显微镜下含高浓度g-csf的细胞生长良好，低浓度几乎死亡；每孔加mtt溶液20μl，置37℃，5％co2饱和湿度下再培养4-5h；每孔加入裂解液100μl，置37℃，5％co2，在饱和湿度的培养箱过夜；显微镜下观察，待结晶完全溶解后，以630nm为参比波长，于570nm处测定od值。
[0069]
(4)结果处理和判定：调用设定好的模板，相关参数设置完毕后，读取数据；若以后续稀释倍数为横坐标、od值为坐标，a代表相应曲线的最大od值，d代表最小od值，b代表斜率值，c代表每条曲线的ec
50
(半效量稀释倍数)，r2代表相关系数的平方。标准品、供试品曲线的r2应≧0.98；数据按四参数回归计算法进行处理，并按下列计算公式计算结果：
[0070]
供试品生物学活性ps1(iu/ml)＝pr1×
ds
×
es/(dr
×
er)(1)
[0071]
标准品生物学比活性pr2(iu/mg)＝pr1/cr；(2)
[0072]
供试品生物学比活性ps2(iu/mg)＝ps1/cs；(3)
[0073]
供试品生物学相对活性(％)＝ps2/pr2*100％(4)
[0074]
式中pr1为标准品生物学活性，iu/ml；
[0075]
ds为供试品预稀释倍数；
[0076]
dr为标准品预稀释倍数；
[0077]
es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
[0078]
er为标准品半效量的稀释倍数；
[0079]
cr为标准品蛋白质含量，mg/ml；
[0080]
cs为供试品蛋白质含量，mg/ml；
[0081]
对rhg-csf和c15-rhg-csf的体外活性进行表征，结果如图7所示。c15-rhg-csf的体外活性为6.29
×
107iu/mg，而相比修饰前rhg-csf的体外活性(7.21
×
107iu/mg)，c15-rhg-csf的活性保留率为87.2％。c15-rhg-csf的体外活性保留率高比已报道的peg-rhg-csf修饰高，这是因为脂肪链分子量小，对rhg-csf与受体结合的空间位阻小。
[0082]
实施例4-4：动物体内药代动力学分析
[0083]
从山东省实验动物中心(中国济南)购买雄性昆明小鼠(16-20g)，许可号为scxk 2014-0007。畜牧体系保持在标准实验室条件下。所有动物操作均按照《山东工业大学实验动物的护理和使用指南》进行，并得到山东工业大学动物伦理委员会的批准。随机选取正常小鼠进行分组和取样，具体见表2。小鼠皮下给药后，按表2每个时间点取6只动物的的眼眶血样，然后断颈处死小鼠。血样采集后，离心30min后分离血清，-20℃冰箱保存待测。血样中rhg-csf或c15-rhg-csf的浓度采用用96孔酶标可拆式板条(美国coming公司)和human g-csf duoset试剂盒(购自美国r&d公司)在model 450型酶标仪(美国bio-rad公司)上进行，具体操作参见human g-csf duoset试剂盒的操作手册。
[0084]
表2 rhg-csf和c15-rhg-csf分组和给药
[0085][0086]
从图8可以看出，c15-rhg-csf在小鼠体内血药浓度在0.5小时就达到峰值，比rhg-csf(2h)更短，说明脂肪链修饰也有利于rhg-csf跨膜吸收，能更快地发挥药效。另外，达到峰值后，c15-rhg-csf的血药浓度在小鼠体内下降趋势比rhg-csf更缓慢，说明其半衰期更长，能在更长时间内发挥药效。
[0087]
实施例4-5：动物体内药效分析
[0088]
从山东省实验动物中心(中国济南)购买雄性昆明小鼠(16-20g)，许可号为scxk 2014-0007。畜牧体系保持在标准实验室条件下。所有动物操作均按照《山东工业大学实验动物的护理和使用指南》进行，并得到山东工业大学动物伦理委员会的批准。除正常对照组注射等量的生理盐水外，其他小鼠连续注射3天环磷酰胺(ctx)1mg/kg体重，随机取正常小鼠和造模小鼠5只，测白细胞(wbc)和红细胞(rbc)计数是否造模成功。将造模成功的小鼠分成5组，每组12只。具体分组如下：正常对照组、模型对照组、rhg-csf高剂量组(0.2mg/kg)、rhg-csf低剂量组(0.1mg/kg)、c15-rhg-csf高剂量组(1.0mg/kg)和c15-rhg-csf低剂量组(0.5mg/kg)。具体给药见表3，正常对照组和模型对照组在d1、d2、d3、d4和d5皮下注射生理盐水。在给药后d6，断颈处死小鼠，取血，每只小鼠取3次血进行检测，采用血球计数板记录wbc和rbc数目。
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统计分析方法：所有数据表示为平均值
±
标准误差(mean
±
sd)表示。使用graphpad prism 6软件中students’t-test进行两组间差异的显著性分析。p《0.05为具有显著性水平。“*”表示与正常对照组相比，(*)p《0.05，(**)p《0.01，和(***)p《0.001。
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表1 rhg-csf和c15-rhg-csf分组和给药
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从图9和10可以看出，经ctx处理后的小鼠wbc和rbc计数有明显的降低(p《0.001，与对照组相比)，这说明对小鼠的造模成功。经ctx处理的小鼠连续5天皮下注射rhg-csf后，小鼠的外周血wbc计数也得到了提高。但在连续5天0.1mg/kg rhg-csf给药时，小鼠外周血wbc计数没有恢复到正常水平，与正常对照组有明显差异(p《0.05，与对照组相比)。而在连续5天0.2mg/kg rhg-csf给药时，小鼠外周血wbc计数恢复到正常水平。单次皮下注射c15-rhg-csf使ctx处理的小鼠的wbc和rbc计数有明显的升高。在0.5mg/kg c15-rhg-csf给药时，外周血wbc计数恢复到空白对照组水平。而在1.0mg/kg c15-rhg-csf给药时，外周血wbc计数恢复到正常水平，甚至已经超过正常水平。综上所述，c15-rhg-csf单次皮下注射比rhg-csf多次皮下注射对小鼠外周血细胞疗效更好。