单个活细胞表面抗原的超分辨电化学成像方法及装置

1.本技术涉及电化学成像领域，具体涉及单个活细胞表面抗原的超分辨电化学成像方法及装置。


背景技术：

2.表面抗原参与细胞多种生理活动，决定着细胞间以及细胞与外界之间的相互作用。也与疾病密切相关，如肿瘤相关抗原与肿瘤的发生、恶性转变、癌细胞的扩散和转移等密切相关，被广泛用作肿瘤相关标志物。目前，临床上对抗原的检测多集中在传统方法，如化学发光法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析等，属于细胞群体的分析。仅能从量上提供与疾病的关系，所得信息不全面。此外，越来越清楚的是，表面抗原在纳米尺度上的分布和聚集对于增强它们的相互作用至关重要。因此，为了更加全面、真实地揭示抗原与疾病的关系、理解抗原在复杂细胞活动中的作用，我们需要对细胞表面的抗原进行直接观察，在单细胞水平上研究抗原分布规律。
3.超分辨成像是探索微观世界的神器，在生命科学领域具有重要意义。对于单细胞上抗原的研究，目前方法主要集中在单细胞超分辨成像上。为了实现纳米尺度的单细胞成像，科学家们创造性地开发了超分辨荧光显微镜，如受激发射耗尽显微镜(sted)、光激活定位显微镜(palm)和随机光学重建显微镜(storm)，突破了光学成像的衍射极限，极大地推动了单细胞分析的发展。但是荧光的高背景发射及探针分子易于漂白的特征会影响测量过程的信噪比及定量能力。因此，为了更好地评价单细胞抗原的实际分布，有必要开发一种不需要光激发的单细胞超分辨成像策略。
4.扫描离子导电显微镜(sicm)是一种新兴的电化学成像技术，它具有纳米级的空间分辨率，其信号来自两电极之间的离子电流。借助于压电陶瓷对纳米毛细管电极位置的精细控制，可以得到样品的表面形貌信息。此外，由于离子电流与离子浓度有关，而离子浓度又能够反映出样品表面的扩散层状态。因此，对离子电流的精细分析可以得到很多形貌以外的信息。根据电中性理论，在电极的两侧，溶液一侧扩散层中由离子贡献的净电荷量应与电极一侧中由电子贡献的电荷量相等，故对扩散层的描绘就可以反映出被扫描样品表面的电荷密度。综上所述，sicm可成为用于表面电荷密度表征的有效手段，可以在得到样品表面纳米级形貌的同时获得对应位点的电荷密度。sicm在生物学领域也有很多的应用，但是这种方法在识别细胞上的特殊分子方面仍然存在局限性。因此，对单个活细胞中特定分子的分布进行成像是sicm的目标。
5.癌胚抗原(cea)，也称为cea相关细胞粘附分子5(ceacam5)或cd66e，是一种锚定在特定细胞膜微区的糖磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，在包括结肠癌、乳腺癌和肺癌在内的多种人类癌症中过度表达。cea不仅与呼吸道或消化道癌症有关，还与淋病等一些传染病或间质性肺病(ild)等慢性炎症性疾病有关。最近文献报道，cea可能是评估covid-19严重程度和预后的潜在生物标志物。因此，对它的深入研究有助于研究者们进一步理解疾病病变的机理以及发展过程，对开发新的疾病诊断与治疗方案具有重要意义。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中存在的问题，本技术提供一种单个活细胞表面抗原的超分辨电化学成像装置，包括纳米毛细管电极、扫描离子电导显微镜(sicm)成像系统、ag/agcl电极、电流放大器、控制软件、光学显微镜和数据处理系统；其中，
7.所述ag/agcl电极包含两根，作为准参比电极；所述sicm成像系统包括：定位模块，扫描模块和控制模块；其中，所述定位模块与扫描模块连接在一起，所述定位模块包括至少一个电机，用于样品的初步定位；所述扫描模块包括至少一个压电陶瓷；所述控制模块由采集板与控制板组成，所述采集板用于收集电流信号，所述控制板用于控制施加于纳米毛细管与样品的电压、电机以及压电陶瓷的运动；
8.其中所述两根ag/agcl电极，一根置于所述纳米毛细管电极中，一根置于放置待测细胞样品的培养皿上的溶液池中用于扫描。
9.在一实施例中，所述纳米毛细管电极尖端开口内径为30nm至180nm。
10.在一实施例中，所述数据处理系统包括matlab 2018a和origin95，通过电流为y轴，探针-样品距离为x轴绘制得到的逼近曲线进行数据处理。
11.本技术还提供了一种根据所述单个活细胞表面抗原的超分辨电化学成像装置的检测方法，包括以下步骤：
12.步骤一、制备抗原标记物，将荧光物质和目标抗原对应的抗体利用链霉亲和素-生物素技术得到目标抗原标记物；
13.步骤二、制备细胞样品，将待测细胞置于培养皿上的培养基中37℃培养，将培养皿从培养箱中取出后洗涤，将细胞在黑暗中固定，得到修饰前细胞样品，向培养皿中加入含有步骤一所述的目标抗原标记物的pbs溶液，孵育30分钟以修饰细胞，pbs溶液洗涤3次后，得到位于培养皿上的修饰后的细胞样品；
14.步骤三、sicm表征，将步骤二得到的培养皿安装于基底上，基底连接到水平方向的压电陶瓷上；纳米毛细管被安装在垂直方向的压电陶瓷上；纳米毛细管在光学显微镜的帮助下定位到样品表面特定的位置；利用两根ag/agcl电极作为准参比电极，一根置于所述纳米毛细管电极中，一根置于培养皿上的溶液池中，对所述两根电极之间施加偏电压，获得稳定离子电流，所述sicm扫描采用hopping模式，完成整个设定区域的扫描，得到细胞样品表面的抗原信息，其中，由扫描离子电导显微镜(sicm)成像系统得到细胞表面抗原成像信息，根据数据处理系统得到细胞表面抗原含量信息。
15.在一实施例中，所述荧光物质为双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶钌-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)，所述抗体为cea抗体。
16.在一实施例中，所述制备抗原标记物为，将1mg/ml双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶钌-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)和0.1mg/ml链霉亲和素在4
°
с下搅拌2小时；混合溶液用超滤膜超滤纯化；将浓缩后的链霉亲和素修饰的ru(bpy)
32
配合物用ph 7.4的pbs稀释至20μg/ml，4
°
с保存；将链霉亲和素修饰的ru(bpy)
32
配合物与生物素化cea抗体在37
°
с孵育30min，得到抗原标记物ru(bpy)
32 -cea抗体偶联物。
17.在一实施例中，所述将细胞在黑暗中固定，为将培养皿浸入4％多聚甲醛中，置于黑暗中处理定30min。
18.在一实施例中，所述sicm扫描为在每一个扫描点的扫描之前，垂直方向z轴压电陶
瓷控制纳米毛细管运动到安全高度之后向下运动；检测限设定为电流值的1％，探针下行速度为20μm/s；当离子电流与探针处于安全高度时的离子电流差值达到设定的检测限时，认为此时探针到达样品位置；之后，毛细管会再次抬升到安全高度，水平方向xy轴的压电陶瓷会控制样品到达下一个扫描点处，如此循环，直到完成整个设定区域的扫描。
19.在一实施例中，在扫描检测中，以电流为y轴，探针-样品距离为x轴绘制得到的曲线即为逼近曲线，逼近曲线的表达式见公式1-1：
[0020][0021]
其中，u为外加电压，λm为溶液的摩尔电导率，d为探针直径，为双电层内距离电极表面一定距离处的电势，c-，c

分别为电势为处的负离子、正离子浓度，k为玻尔兹曼常数，t为热力学温度；为电势能，表示从无限远处将电荷移动到电势为处所做的功，根据修饰前后细胞表面的电荷密度差异可以计算得到修饰到样品表面的抗体数，而由于抗体与抗原一一对应，据此可以得到细胞表面的抗原含量。
[0022]
在一实施例中，简化后的逼近曲线表达式见公式1-2；
[0023][0024]
有益效果
[0025]
与各种荧光成像相比，该电化学成像过程依赖于免疫复合物上的电荷，可以提供膜抗原的稳定信号，弥补荧光成像中定量测量的不足。此外，sicm能够很容易地实现分子的三维成像，不需要任何复杂的三维光学成像设备。因此，sicm为分析纳米级分子的空间组织提供了一种新工具，是一种可用于单细胞成像的可替代超分辨显微镜技术，有助于促进生物学和电化学领域的发展。
[0026]
本文工作将sicm引入到了单细胞研究过程中，构建了一种全新的单细胞表面抗原电化学分析系统。该系统具有高稳定性以及空间分辨率，xy方向空间分辨率达到了30nm，z方向空间分辨率低于5nm。利用这一系统，实现了sicm在生物成像方面的应用，开发了基于电化学信号对单细胞表面抗原进行高空间分辨成像表征的方法，并且为多抗原的同步表征奠定了基础。目前的研究结果提供了cea抗原的详细空间信息以及细胞膜上相关的潜在组织机制，这将有助于更好地理解分子聚集及其功能之间的关系，以及细胞膜的整体结构。这对单细胞生物学具有重要意义。
[0027]
此外，本技术除了提高稳定性以及空间分辨率之外，通过构建逼近曲线，实现对细胞表面抗原的定量检测，对于后续的涉及细胞及抗原以及肿瘤相关发病机理的研究提供重要的信息，具有重大意义。
附图说明
[0028]
图1sicm用于单细胞表面cea抗原超分辨表征原理示意图。其中(a)修饰ru(bpy)
32 -cea抗体前；(b)修饰ru(bpy)
32 -cea抗体后。
[0029]
图2用于单细胞表面cea抗原超分辨表征的sicm系统示意图。
[0030]
图3用公式1-1和公式1-2拟合的逼近曲线结果。
[0031]
图4逼近曲线拟合结果。其中(a)纳米毛细管sem图像；(b)不同取值时根据公式绘制的理论逼近曲线；(c)分别对基底和细胞修饰之前的实测及拟合逼近曲线；(d)分别对基底和细胞修饰之后的实测及拟合逼近曲线。
[0032]
图5mcf-7细胞的荧光图像和sicm表征结果。其中(a)细胞明场图像；(b)修饰前细胞荧光图像；(c)修饰后细胞荧光图像；(d)细胞形貌；(e)修饰前表面电势；(f)修饰后表面电势。
[0033]
图6中(a)实时电流及探针运行轨迹；(b)图5中虚线沿线的基底表面电势的统计分析结果；(c)图5中绿色虚线沿线的细胞表面电势的统计分析结果；(d)沿图5d中白色虚线的形貌分布与图5e和f中绿色虚线处的电势分布。
[0034]
图7a549细胞荧光图像。其中(a)细胞明场图像；(b)修饰前细胞荧光图像；(c)修饰后细胞荧光图像。
[0035]
图8a549细胞的sicm表征结果。(a)细胞形貌；(b)修饰前表面电势；(c)修饰后表面电势；(d)图b与图c表面电势的叠加图。(e)沿图a中白色虚线的形貌分布与图b和c中绿色虚线处的电势分布；(f)图b与图c中绿色虚线沿线的表面电势的统计分析结果。
[0036]
图9sicm对细胞膜表面抗原的精细表征结果其中(a)细胞膜形态；(b)修饰后细胞表面电势；(c)图a与图b叠加图；(d)沿图a中白色虚线的形貌分布与图b中绿色虚线处的电势分布。
[0037]
图10本技术一实施例中用comsol 5.4进行模拟的具体模拟方程及参数。
具体实施方式
[0038]
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例，仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
[0039]
试剂和药品
[0040]
乳腺癌细胞(mcf-7)购自中国科学院上海生物研究所生物化学和细胞生物学学院。人肺癌细胞(a549)购自中国典型培养物保藏中心。dulbecco’s modified eagle media(dmem)/high glucose培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。f-12k培养基购自中国典型培养物保藏中心。胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)，双抗(antibiotic，青霉素 链霉素)，胰蛋白酶(trypsin)均购自gibco公司。多聚甲醛购自sigma-aldrich公司。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs)购自北京索莱宝科技有限公司。纳米金胶体购自南京先丰纳米材料科技有限公司。双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶钌-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)，链霉亲和素，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)均购自sigma
–
aldrich。biotinylated cea antibody购自北京拜斯生物技术有限公司。玻璃毛细管(bf100-58-10)由sutter instrument co.(novato,ca)提供。所用超纯水电
阻率为18.2mω/cm。所有的化学药品和试剂都是在没有进一步净化的情况下使用的。
[0041]
仪器
[0042]
sicm成像系统是自主搭建而成，基本可以分为三个模块：定位模块，扫描模块和控制模块。其中，定位模块与扫描模块连接在一起。定位模块由三个电机组成，主要用于样品的初步定位；而扫描模块由三块压电陶瓷构成。控制模块由自主研发的一块采集板与控制板组成，采集板用于收集电流信号，而控制板用于控制施加于纳米毛细管与样品的电压、电机以及压电陶瓷的运动。采用两根ag/agcl电极作为准参比电极。一台光学显微镜用于辅助样品定位，型号为nikon-ti。扫描数据采用matlab 2018a和origin95进行处理。
[0043]
p-2000拉针仪(sutter仪器)制备纳米毛细管电极，制备的电极尖端开口内径约为180nm(参数为line 1：heat 350fil 3vel 30del 220pul；line 2：heat 350fil 3vel 40del 180pul 150)以及30nm(参数为heat 950fil 3vel 16del 125pul160)。s-4800场发射扫描显微镜(hitachi公司，日本)用于纳米毛细管电极的表征。明场及荧光显微镜图像使用光学显微镜得到(nikon-ti)。使用comsol5.4进行模拟，用到的物理场为稀物质传递，具体模拟方程及参数参见图10。
[0044]
细胞培养
[0045]
乳腺癌细胞(mcf-7)用含有10％(v/v)胎牛血清与1％(v/v)的双抗(青霉素 链霉素)的dmem高糖培养基，培养条件为37℃和5％co2的潮湿环境。
[0046]
人肺癌细胞(a549)用含有10％(v/v)胎牛血清与1％(v/v)的双抗(青霉素 链霉素)的f-12k培养基，培养条件为37℃和5％co2的潮湿环境。ru(bpy)
32 -cea抗体的合成
[0047]
将1mg/ml双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶钌-琥珀酰亚胺酯-双(六氟磷酸盐)和0.1mg/ml链霉亲和素在4
°
с下搅拌2小时。混合溶液用10k截留分子量的超滤膜(millipore)超滤纯化。将浓缩后的链霉亲和素修饰的ru(bpy)
32
配合物用pbs(ph 7.4)稀释至20μg/ml，4
°
с保存。为了将ru(bpy)
32
复合物连接到细胞表面的抗原上，链霉亲和素修饰的ru(bpy)
32
配合物与生物素化cea抗体在37
°
с孵育30min，得到ru(bpy)
32 -cea抗体偶联物。
[0048]
细胞样品的制备
[0049]
在培养皿上37
°
с培养mcf-7细胞和a549细胞。贴壁48小时后，将培养皿从培养箱中取出，用pbs洗涤3次，得到修饰前活细胞样品。用pbs洗涤3次后，向培养皿内加入含5mm ru(bpy)
32 -cea抗体偶联物，孵育30min。用pbs溶液洗涤3次后，得到修饰后细胞样品。
[0050]
金颗粒样品的制备
[0051]
胶体金表面带有羧基，使用1％edc对其进行活化30min，之后离心，除去上层清液，加入去离子水清洗混匀后离心，除去上层清液。加入5mm ru(bpy)
32 -cea抗体偶联物30min，离心后除去上层清液，加入去离子水清洗混匀后除去上层清液，之后加入去离子水混匀。取标记前后的胶体金滴涂到dish基底，风干后得到金颗粒样品。
[0052]
sicm表征
[0053]
在sicm扫描过程中，培养皿安装于基底上，基底连接到xy方向的压电陶瓷上(p-621,pi公司，德国)。纳米毛细管被安装在z方向的压电陶瓷上(p-753,pi公司，德国)。纳米毛细管在光学显微镜的帮助下定位到样品表面特定的位置。sicm扫描采用hopping模式，即在每一个点的扫描之前，z轴压电陶瓷都会控制纳米毛细管运动到一个设定的安全高度，之
后向下运动。随着毛细管与被扫描样品之间距离的减小，离子电流也会逐渐减小。检测限设定为电流值的1％，探针下行速度为20μm/s。当即时离子电流与探针处于安全高度时的离子电流差值达到设定的检测限时，会认为此时探针到达样品位置。之后，毛细管会再次抬升到安全高度，xy方向的压电陶瓷会控制样品到达下一个扫描点处，如此循环往复，直到完成整个设定区域的扫描。
[0054]
如图1所示，修饰后，细胞表面cea抗原所在特定区域的电荷密度发生变化，这将使得ru
3
周围吸附大量阴离子。高浓度的阴离子与毛细管孔处的电阻相互抵消，导致高离子电流，并由此产生更小的探针-样品距离。通过对离子电流的精细分析获取样品表面电荷密度信息，最终实现单细胞表面抗原分布的可视化。
[0055]
对全细胞抗原进行表征
[0056]
mcf-7细胞在修饰前后的荧光图像如图5中b和c所示，可以看到修饰后细胞整体表现出荧光，表明cea抗原在细胞表面各处都有分布，但在伪足部分仅发出微弱的荧光，说明细胞表面抗原分布是不均匀的。用sicm对单个mcf-7细胞的形貌成像结果如图5中d所示，细胞呈多边形，表明细胞能够在培养皿表面充分生长铺展。通过拟合，计算得到修饰前后细胞的表面电势并绘制成图像。修饰前，细胞表面电势在-20mv附近分布均匀，如图5中e所示。修饰后，ru(bpy)
32 -cea抗体通过免疫反应与细胞表面的cea抗原结合，细胞表面大部分区域电势明显增加到约-3mv，但在细胞伪足及靠近伪足区域修饰前后表面电势变化较小，说明这些区域内的cea抗原分布少，如图5中f所示。此与荧光成像结果相同，验证了该方法的准确性。对图5中白色虚线和绿色虚线进行沿线分析，图6中a呈现的是该部分的实时电流及探针运行轨迹，图6中b与图6中c分别是对沿线基底和细胞上的表面电势做统计分析后的结果，从中可以看出，修饰前后基底所在区域的表面电势并没有发生明显的变化，取基底上单点进行逼近曲线的拟合，如图4中c和d中红色曲线所示，修饰前后逼近曲线几乎无差异。但是对细胞上修饰前后的表面电势进行统计分析后，出现两个明显的条带，提示抗原的存在。细胞与基底均带负电，但细胞表面电势更低。图6中d呈现的是该部分的形貌分布与表面电势分布，细胞表面电势明显低于基底表面电势，与实际情况相符合。对于修饰前后的电势差异，可以很清楚看到基底上修饰前后表面电势几乎无差异，但在细胞上则修饰后的电势明显高于修饰前的，与之前理论分析的结果相一致，提示抗原的分布，同样验证了该抗原分析方法的准确性。
[0057]
对照试验
[0058]
在a549细胞上进行对照实验。有研究表明，在a549细胞上cea抗原的浓度很小。荧光显微镜结果也表明，修饰后的a549细胞荧光强度较弱，如图7所示，排除了非特异性吸附的影响。sicm结果表明，修饰前后的表面电势差很小，提示细胞上cea抗原较少，与实际情况相符合，正面验证了该方法的准确性，如图8所示。图8中d是将修饰前与修饰后表面电势进行叠加而成，图中基底部分、白色圈和细胞伪足部分，是电势相对高的区域，由于修饰前后均表现出电势高的特征，故呈现出黄色图像，修饰前与修饰后电势均较低的区域呈现黑色图像。可以看出，除了抗原分布的区域，其他区域修饰前后电势均呈现相同的变化特征。图8中e中也能清楚看出，此为图8虚线处的形貌分布和电势分布，无论在细胞上还是基底上，修饰前后的电势不仅差异很小，而且变化特征一致。这些可以充分证明该抗原分析方法的稳定性和可靠性。
[0059]
据文献，cea抗原的直径为约14.72nm，为了实现单个抗原的分析，用开口直径为30nm的探针对局部细胞抗原进行表征(图5黑色方框区域)，扫描步进为50nm，扫描范围为5μm
×
5μm，这样的扫描条件使得相邻的扫描点中没有重复扫描的区域。采用这样的扫描方式获得的扫描结果更加连续，细胞表面的抗原分布表征结果也能够更加连续和稳定。如图9中a所示，在这一区域内细胞表面起伏达到700nm，细胞膜表面粗糙，由圆形、三角形、长条状、不规则形等大小相差十分悬殊的突起组成，突起分布密集，且结构光滑、饱满，排列疏密适中，各突起结构相互靠近彼此间形成缝隙状凹陷。图9中b是修饰后的表面电势分布图，依据全细胞表征的结果，修饰前表面电势在-20mv附近分布，修饰后表面电势增加到-3mv左右。图中蓝色区域表面电势同样约为-20mv，表明这些区域修饰后表面电势未改变，cea抗原密度基本为0。图中白色区域表面电势升高到-15mv左右，cea抗原密度较低。图中红色区域表面电势分布在-6～-3mv,cea抗原密度较高。结果表明，cea抗原倾向于在mcf-7细胞表面聚集分布，在细胞表面存在高抗原密度区域和低抗原密度区域。
[0060]
在细胞参与各种生理活动的过程中，细胞膜上的生物分子往往需要特定的分布位置或聚集形态来实现与不同分子的相互作用，从而更好地完成其生理功能。如图9c所示，将形貌结果与表面电势结果进行叠加，图9中c中共有四种颜色，红色代表形貌较高而电势较低的区域，绿色代表形貌较低而电势较高的区域，黄色代表形貌与电势都较高的区域，黑色代表形貌与电势都较低的区域。沿图9中a中白色虚线的形貌分布与图9中b中绿色虚线处的电势分布如图9中d所示。从图9中c与图9中d中可以看到cea抗原在细胞膜表面呈现出按团簇堆积的特征而不是零散分布。据文献，cea是免疫球蛋白超家族成员之一，通过糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定于细胞膜表面的“脂质筏”结构区。与抗体或生理相关配体结合后，cea分子的聚集使得相关信号分子重新定位并被激活，从而导致细胞和组织状态的变化，如分化、内吞和失巢凋亡等。因此，可以利用该分析技术对这些生物活动所涉及的分子机制进行深入研究，寻找新的癌症靶标。
[0061]
进一步对结果分析，可以发现cea簇大部分分布于细胞膜表面突起处，且主要分布于这些突起的基部与顶部，其中，在基部分布范围更广。据文献报道，膜突起上富集“脂质筏”，不仅为许多膜蛋白结构域的形成提供重要的驱动力，还有助于多种细胞过程，包括内吞作用和细胞信号传导。肌动蛋白则主要位于膜突起的基部和顶部，肌动蛋白细胞骨架能促进形成独立和紧凑的蛋白质结构域。另外，“脂质筏”和肌动蛋白细胞骨架对蛋白质簇在基部的稳定性作用比在顶部要大。不仅如此，细胞表面还分布着大量的碳水化合物分子，它们不仅作为糖蛋白的重要组成部分保持分子稳定性，而且通过与内源性凝集素相互作用参与膜生物分子的分布。我们推测cea簇在膜上的差异分布可能是“脂质筏”、肌动蛋白细胞骨架和膜上的碳水化合物链的综合影响的结果。综上所述，通过所开发的分析方法，对细胞膜表面cea密度与空间分布进行了精确表征，这将对于探索新的癌细胞靶标以及设计合理的靶向纳米疗法具有重要参考价值。
[0062]
逼近曲线
[0063]
用于单细胞表征的sicm系统结构如图2所示。采用两根ag/agcl电极作为准参比电极，一根位于纳米毛细管内部，另一根处于本体溶液池中。当对这两个电极之间施加偏压时，就能够获得一个稳定的离子电流。在每一个点的扫描过程中，纳米毛细管都会从一个安全高度逐渐逼近样品。当毛细管与样品之间的距离足够小时，由于空间位阻的影响，离子电
流会减小，以电流为y轴，探针-样品距离为x轴绘制得到的曲线即为逼近曲线，这里的电流经归一化处理，是处于本体溶液时的稳态电流值与逼近过程达到阈值的即时电流的比值。当样品表面电荷密度发生变化时，双电层内被吸附的反离子浓度也会发生变化，进而导致逼近曲线发生改变。因此，可以通过拟合的方法从逼近曲线中获得样品表面的电荷密度分布。本技术直接建立了逼近曲线与样品表面电荷之间的数学关系，逼近曲线的表达式见公式1-1，奠定了利用sicm对样品表面电荷密度进行表征的基础。鉴于公式的复杂性和拟合的可行性，对公式1-1进行归一化处理，简化后的逼近曲线最终表达式见公式1-2。
[0064][0065][0066]
逼近曲线的数学表达式的具体理论推导过程及简化过程：
[0067]
电势降以及正负离子浓度的不均匀分布是双电层内的一个重要特征。根据boltzmann分布可以得到在对电极表面施加电压时，双电层内的正负离子浓度分布：
[0068][0069][0070]
其中，为双电层内距离电极表面一定距离处的电势，c-，c

分别为电势为处的负离子、正离子浓度，k为玻尔兹曼常数，t为热力学温度。为电势能，表示从无限远处将电荷移动到电势为处所做的功。
[0071]
由公式1-1中可以发现，只需得到的表达式，就可以得到双电层中的正负离子浓度。而的表达式可以由电磁学中的poisson方程推导得到：
[0072][0073]
其中，是样品的表面电势，也是本文工作中用于量化电荷密度的基础，mcf-7细胞的为负，经cea-ru
3
修饰后，会升高。另外，由于ru
3
的电量比较大，导致修饰后的差异比较明显，这保证了表征结果的信噪比。x为双电层中某处与电极表面的距离，κ为一常
数，其单位为m-1
，物理意义为双电层厚度的倒数，可以由以下关系得到：
[0074][0075]
其中，na为阿伏伽德罗常数，ε为溶液介电常数。室温条件下，在确定溶液浓度后，κ值可以确定。根据鲍林的电中性原理，电极表面的电荷密度等于双层膜间离子所携带的净电荷密度。可以表示为:
[0076][0077]
其中，σ为电荷密度，n为对应离子的价态。对于sicm而言，由于探针口径足够小，电阻大部分都集中于探针针尖处。根据欧姆定律：
[0078][0079]
其中，i为sicm所记录的电流值；u是施加在毛细管间电极和参比电极之间的电压。r
p
为探针所固有的电阻，在探针尺寸确定的条件下，r
p
为一个定值。r
t
是由探针-样品之间距离减小而引入的一个附加电阻，其值会在探针-样品距离减小到几百纳米时变得不可忽略，同时也会随着探针-样品距离的进一步减小而增大。综合以上推导过程可以得到逼近曲线的表达式：
[0080][0081]
其中，λm为溶液的摩尔电导率。在公式1-6中，只有这一个未知数，这也是需要通过用这一表达式对逼近曲线进行拟合来获得的一个参数。在得到之后就可以得到这一个点处的正负离子浓度分布，再根据公式1-4积分即可以得到这一个点处的电荷密度。电化学理论的推导结果奠定了利用sicm对样品表面电荷密度进行表征的基础。
[0082]
鉴于公式的复杂性和拟合的可行性，对公式进行简化。首先，对公式1-6归一化处理后得到：
[0083][0084]
其中，参数c用于描述r
p
与r
t
之间的相对大小。
[0085][0086]
把公式1-8带入公式1-7得到下列关系式:
[0087][0088]
将公式1-8带入公式1-2得到下列关系式：
[0089][0090]
将数值代入公式1-10可得：
[0091][0092]
将公式1-11代入公式1-9可以得到简化的逼近曲线的最终表达式：
[0093][0094]
在修饰前后，细胞的表面电荷密度会发生变化，根据电荷密度的变化量可以在电势与细胞表面的抗原数之间建立定量关系，具体过程如下所示：
[0095][0096]
积分后可以得到：
[0097][0098]
其中a与相关，在通过拟合得到后，可以进一步得到电荷密度值。
[0099]
首先，分别用公式1-1和公式1-2对多组数据进行逼近曲线的拟合，结果如图3所示，简化前后拟合效果基本无差异，充分验证了简化后公式的可行性与准确性。在公式中，表面电势是唯一需要确定的参数，由样品表面条件所决定。在修饰前后，细胞的表面电荷密度会发生变化，根据电荷密度的变化量可以在电势与细胞表面的抗原数之间建立定量关系。据研究，细胞通常带负电，表面双电层内吸附大量阳离子，经ru(bpy)
32 -cea抗体修饰后，细胞表面cea抗原所在特定区域会吸附大量阴离子。因此，可以通过电荷密度差识别cea抗原。根据公式，拟合了表面电势为-10mv到10mv的逼近曲线，相邻两曲线之间的电势差值为1mv，拟合结果如图4所示。可以看出，在相同的针尖-样品距离下，随着的增大，电流变大，这是本文进行抗原识别的基础。
[0100]
如图4所示，修饰前电势为-21.79mv，电荷密度-1.58mc/m2，修饰后电势为-3.15mv，电荷密度-0.23mc/m2，修饰前后电荷密度差1.35mc/m2，根据修饰前后细胞表面的电荷密度差异可以得到修饰到样品表面的抗体数，而由于抗体与抗原一一对应，据此可以得到细胞表面的抗原含量。cea抗原直径约为14.8nm，当采用直径为200nm的探针进行扫描时，一个扫描点内最多约能够包含183个cea抗原。而根据sicm扫描结果，每个抗体携带八个正电荷，因此可以计算得到实际测量得到的抗原数约为33个。
[0101]
对于更小区域的扫描，如图9所示，可以观察到修饰后电势基本从-28mv上升到-6mv左右，此时电荷密度差约为1.73mc/m2，此时使用的探针直径约为30nm，根据扫描结果计算得到的cea抗原数约为2。
[0102]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来书，在不脱离本发明的原理的前提下，还可以作数若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为本发明的保护范围。