一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法

1.本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法。
技术背景
2.火麻籽因其具有50％左右的丰富油脂，且富含不饱和脂肪酸，常通过压榨方式制作成火麻油。而制作火麻油产生的火麻籽粕常常作为加工废弃物被直接丢弃，或者以极低的价格卖作动物饲料。这对有限的火麻资源来说是以一种极大的浪费。火麻籽粕中含有约60％粗蛋白、20％膳食纤维、7％～8％脂类、10％碳水化合物，以及多种维生素和矿物质等，是优秀的碳源，此前对于火麻籽粕的利用较少，目前还没有将其作为固体发酵基质来进行微生物的培养。将火麻籽粕作为唯一发酵基质来生产纳豆激酶，实现了废弃物的高效利用，降低了纳豆激酶的生产成本，实现了变废为宝。
3.纳豆激酶(nattokinase，nk)是一种丝氨酸蛋白酶，将纳豆激酶添加在食品中，通过食用降低人体中血液和血浆的粘度，达到预防和治疗血栓性疾病的目的。与现有的纤溶酶相比，纳豆激酶因具有高溶纤活性、无副作用、更易被人体吸收等优点而备受关注。但纳豆激酶需求量大，产量低、成本高的特点阻碍其广泛应用。提高纳豆激酶产量和活性一直是推进纳豆激酶发展的重点。
4.在专利201110034654.2《一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法》中记载，在用含有乳糖和葡萄糖的营养液浸泡鹰嘴豆后，用其进行固态发酵，纳豆激酶粗酶液活性为3270iu/g。在专利200910040896.5《一种纳豆激酶固体发酵方法》中记载，以大豆作为固体发酵基质，所产纳豆激酶酶活为700iu/g。在专利 200810231137.2《一种纳豆激酶固体发酵方法》中记载，以豆渣作为固体发酵基质，单位发酵酶活高达5311.72iu/g。
5.专利202210267411.1《一种火麻籽粕高f值寡肽及其制备方法和在提高纳豆激酶产量中的应用》中以火麻籽粕作为原料，先分离制备得到高f值火麻籽粕寡肽，加入到枯草芽孢杆菌的发酵液中，可显著提高其纳豆激酶的产量，但是需要对火麻籽粕先进行处理，工序复杂。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法，该方法过程简单，且生产的纳豆激酶的活性高，且可有效利用榨油废弃物火麻籽粕，降低了生产成本且实现了火麻籽粕的高效利用。此外，火麻籽粕固态发酵时间短，在20h左右纳豆激酶活性就达到最高，减少了发酵时间。与其他固态发酵基质相比，火麻籽粕气味清香，能够中和发酵过程中产生的氨味，使纳豆激酶更易被接受。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方法如下：
8.一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法，包括如下步骤：
9.1)将火麻籽粕进行粉碎，加入一定量的蒸馏水进行浸泡；
10.2)将浸泡后的火麻籽粕进行灭菌；
11.3)将纳豆激酶生产菌接种在冷却的火麻籽粕上，控制发酵温度、湿度，进行固态发酵；
12.4)将发酵后的产物加入一定量的蒸馏水进行浸提离心，得到纳豆激酶。
13.步骤1)中将火麻籽粕进行粉碎，加入1∶(1-5)(w/v，g/ml)的蒸馏水浸泡2-5h。
14.步骤2)中将粉碎过后的火麻籽粕进行高压蒸汽进行灭菌，控制温度在 100-120℃，灭菌时间为20-30min，冷却至30-40℃进行接种。
15.所述的纳豆激酶生产菌包括枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmccno.13932、纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)bncc194961、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)bncc132622中的至少一种。
16.步骤3)中按5-15％的种子液接种量，将产纳豆激酶生产菌种子液接入发酵培养基中，并搅拌，培养温度30-40℃，培养箱湿度60-80％，发酵16-24h。
17.步骤4)加入1∶(5-10)(w/v,g/ml)的蒸馏水浸提2-5h，10000-12000r/min 离心10-20min。离心上清液中得到纳豆激酶。
18.优选的，步骤2)中，将粉碎过后的火麻籽粕进行高压蒸汽进行灭菌，控制温度在100-120℃，灭菌时间为20-30min，冷却后，加入蛋白酶，调节ph和温度进行酶解；
19.所述蛋白酶可以是中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一种，酶解温度40～55℃，蛋白酶加入量为5～10％(质量百分比)。
20.优选地，所述纳豆激酶生产菌接种顺序为枯草芽孢杆菌cgmcc no.13932 先接种到培养基中，培养温度30-40℃，培养箱湿度60-80％，发酵16-24h后再接入纳豆芽孢杆菌bncc194961和/或地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis) bncc132622继续发酵16-24h。
21.或者枯草芽孢杆菌cgmcc no.13932和地衣芽孢杆菌bncc132622同时加入，培养温度30-40℃，培养箱湿度60-80％，发酵16-24h后再接入纳豆芽孢杆菌bncc194961继续发酵16-24h。
22.菌种的添加顺序对纳豆激酶的活性影响较大。枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) cgmcc no.13932和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)bncc132622先加入时，可以分泌多种蛋白酶以及纤维素酶，将火麻籽蛋白变成更利于利用的多肽，有利于后续菌种的生长及纳豆激酶的生产。纳豆芽孢杆菌(bacillus natto) bncc194961耐酸能力强，在发酵后期加入仍可以保持较高活力。混菌利用火麻籽粕固态发酵产纳豆激酶的效果优于单菌发酵。
23.本发明首次利用火麻籽粕作为唯一发酵基质对纳豆激酶进行固态发酵，提高了纳豆激酶的产量，且实现了榨油副产物火麻籽粕的高价值利用。降低了纳豆激酶的生产成本，简化了生产过程，该技术具有广阔应用前景。
24.有益效果：
25.(1)经火麻籽粕固体发酵后，所产纳豆激酶产量高。
26.(2)以火麻籽粕作为唯一发酵基质，无需添加其他营养物，简化了发酵过程。
27.(3)以火麻籽粕为唯一发酵基质，降低了纳豆激酶的生产成本。
28.(4)实现了榨油废弃物火麻籽粕的高价值利用。
29.(5)火麻籽的清香味有效中和发酵过程中产生的氨味，产品色泽味道更好。
具体实施方式
30.为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。所述实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。
31.以下实施例中采用的纳豆激酶生产菌包括枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) cgmcc no.13932(来自于来自中国普通微生物菌种保藏中心)、纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)bncc194961(购买自北纳生物)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)bncc132622(购买自北纳生物)。
32.实施例1不同菌种利用火麻籽粕固态发酵产纳豆激酶
33.平板培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂20g/l，加蒸馏水至1000ml，ph自然，121℃灭菌20min。
34.种子培养基：葡萄糖12g/l，蛋白胨15g/l，k2hpo
4 1.2g/l，kh2po
4 1g/l， mgso
4 0.40g/l，cacl
2 0.25g/l，mnso
4 0.001g/l，加蒸馏水至1000ml，ph为 7.4，121℃灭菌20min。
35.将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932、纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)bncc194961、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)bncc132622分别在平板培养基上进行活化，37℃培养24h后取两环生长良好的菌体于种子液培养，37℃、200r/min培养12h。
36.将10kg的火麻籽粕进行粉碎，加入20l的蒸馏水浸泡3h，浸泡结束后，在110℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至40℃。
37.按10％的种子液接种量，将上述三种种子液接入固体培养基中，并搅拌，培养温度37℃，培养箱湿度75％，发酵20h。
38.加入1∶5(w/v，g/ml)的蒸馏水浸提3h，10000r/min离心10min。离心上清液进行纳豆激酶活性检测。
39.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932发酵产纳豆激酶为6732.1 iu/g、纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)bncc194961发酵产纳豆激酶为4548.4iu/g、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)bncc132622发酵产纳豆激酶为2960.2 iu/g。
40.实施例2枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932利用不同基质固态发酵产纳豆激酶及进行感官评价
41.平板培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂20g/l，加蒸馏水至1000ml，ph自然，121℃灭菌20min。
42.种子培养基：葡萄糖12g/l，蛋白胨15g/l，k2hpo
4 1.2g/l，kh2po
4 1g/l， mgso
4 0.40g/l，cacl
2 0.25g/l，mnso
4 0.001g/l，加蒸馏水至1000ml，ph为 7.4，121℃灭菌20min。
43.将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932在平板培养基上进行活化，37℃培养24h后取两环生长良好的菌体于种子液培养，37℃、200r/min 培养12h。
44.将10kg的火麻籽粕和豆粕分别进行粉碎，加入20l的蒸馏水浸泡3h，浸泡结束后，在110℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至40℃。将10kg大豆洗净，浸泡至吸饱水分，沥干后，在110℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至40℃。
45.按10％的种子液接种量，将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmccno.13932分别接入火麻籽粕、豆粕、大豆固体培养基中，并搅拌，培养温度37℃，培养箱湿度80％，发酵20h。
46.将上述三种固体培养基分别加入1∶5(w/v,g/ml)的蒸馏水浸提3h，10000r/min离心10min。离心上清液进行纳豆激酶活性检测。
47.枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmccno.13932发酵火麻籽粕产纳豆激酶为6905.4iu/g、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmccno.13932发酵豆粕产纳豆激酶为2279.3iu/g。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmccno.13932发酵大豆产纳豆激酶为583.2iu/g。结果表明较其他固体基质而言，火麻籽粕含有的营养成分更完全，更有利于纳豆激酶的固态发酵。
48.对不同的发酵基质进行感官评价，具体评价见表1，评价结果见表2。
49.表1纳豆激酶固体发酵基质评价标准
[0050][0051]
表2纳豆激酶固体发酵基质评价结果
[0052][0053][0054]
如表2所示，火麻籽粕的感官评价分数最高，高于豆粕和大豆。
[0055]
实施例3不同蛋白酶酶解火麻籽粕对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmccno.13932固态发酵产纳豆激酶的影响
[0056]
平板培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，琼脂20g/l，加蒸馏水至1000ml，ph自然，121℃灭菌20min。
[0057]
种子培养基：葡萄糖12g/l，蛋白胨15g/l，k2hpo41.2g/l，kh2po41g/l，mgso40.40g/l，cacl20.25g/l，mnso40.001g/l，加蒸馏水至1000ml，ph为7.4，121℃灭菌20min。
[0058]
将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmccno.13932在平板培养基上进行活化，37℃培养24h后取两环生长良好的菌体于种子液培养，37℃、200r/min培养12h。
[0059]
将10kg的火麻籽粕进行粉碎，加入20l蒸馏水，浸泡3h，浸泡结束后，在110℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后按表3根据蛋白酶的不同调节ph和温度。
[0060]
表3不同蛋白酶的最适ph
[0061][0062]
在接种前，加入5％(w/w，g/g)的不同蛋白酶，在各自最适的温度下酶解 3h。
[0063]
按10％的种子液接种量，将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmccno.13932分别接入不同酶处理过的固体培养基中，并搅拌，培养温度37℃，培养箱湿度80％，发酵20h。
[0064]
将上述三种固体培养基分别加入1∶5(w/v,g/ml)的蒸馏水浸提3h，10000 r/min离心10min。离心上清液进行纳豆激酶活性检测。
[0065]
中性蛋白酶处理后，纳豆激酶产量为7217.3iu/g，碱性蛋白酶处理后，纳豆激酶产量为7782.2iu/g，木瓜蛋白酶处理后，纳豆激酶产量为7092.8iu/g，胃蛋白酶处理后，纳豆激酶产量为5738.4iu/g。结果表明，通过中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶处理的火麻籽粕能够提高纳豆激酶产量，但胃蛋白酶在酸性条件下作用，不利于菌种产纳豆激酶。
[0066]
实施例4产纳豆激酶菌种添加顺序对利用火麻籽粕固态发酵产纳豆激酶的影响
[0067]
平板培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂20g/l，加蒸馏水至1000ml，ph自然，121℃灭菌20min。
[0068]
种子培养基：葡萄糖12g/l，蛋白胨15g/l，k2hpo
4 1.2g/l，kh2po
4 1g/l， mgso
4 0.40g/l，cacl
2 0.25g/l，mnso
4 0.001g/l，加蒸馏水至1000ml，ph为 7.4，121℃灭菌20min。
[0069]
将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932、纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)bncc194961、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)bncc132622分别在平板培养基上进行活化，37℃培养24h后取两环生长良好的菌体于种子液培养，37℃、200r/min培养12h。
[0070]
将10kg的火麻籽粕和豆粕分别进行粉碎，加入20l的蒸馏水浸泡3h，浸泡结束后，在110℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至40℃。将10kg大豆洗净，浸泡至吸饱水分，沥干后，在110℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至40℃。
[0071]
按表4的不同添加顺序进行添加
[0072]
表4菌种添加顺序
[0073][0074][0075]
注：表4中a指枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932，b指纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)bncc194961，c指地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)bncc132622。同时添加是指几种菌株都按5％的种子液接种量同时接入固体培养基中，并搅拌，培养温度37℃，培养箱湿度80％，发酵20h。其余编号按顺序添加，接种量都为5％，发酵条件相同，第一个菌株发酵结束后，依次接入剩下的菌株，均发酵20h。
[0076]
将上述不同固体培养基分别加入1∶5(w/v,g/ml)的蒸馏水浸提3h，10000 r/min离心10min。离心上清液进行纳豆激酶活性检测。结果如表5所示
[0077]
表5产纳豆激酶菌种添加顺序对利用火麻籽粕固态发酵产纳豆激酶的影响
[0078]
编号纳豆激酶活性(iu/g)18382.128621.939214.348031.257829.568148.477918.389056.699592.8
[0079]
根据表5结果所示，菌种的添加顺序对纳豆激酶的活性影响较大。枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis) bncc132622先加入时，可以分泌多种蛋白酶以及纤维素酶，将火麻籽蛋白变成更利于利用
subtilis)cgmcc no.13932发酵火麻籽粕产纳豆激酶为8421.8iu/g；当发酵时间为24h时，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932发酵火麻籽粕产纳豆激酶为8219.5iu/g。
[0096]
酶活检测相关步骤：
[0097]
试剂及溶液配制：磷酸盐缓冲液(ph＝7.8)磷酸氢二钠0.895g加水溶解并稀释至250ml作为溶液a；称取磷酸二氢钠0.789g加水溶解至125ml作为溶液 b，将a和b两者相互混合，使其ph＝7.8；0.9％氯化钠溶液的配制：称取氯化钠3.6g加水溶解至400ml；工作液的配制:将a b混合液与0.9％氯化钠溶液按照1:17进行混合；1.5％琼脂糖溶液：称取琼脂糖1.5g溶解于100ml工作液高温灭菌放于60℃烘箱中；纤维蛋白原溶液的配制：取纤维蛋白原103mg加工作液 68.67ml进行溶解制成1.5mg/ml可凝蛋白溶液；凝血酶溶液的配制：将160bp 凝血酶溶于20ml0.9％氯化钠溶液制成浓度为8bp/ml凝血酶溶液，分装20支，保藏于-20℃冰箱，每次使用时取出一支稀释8ml，浓度为1bp/ml凝血酶溶液，取出5.28ml，待用。
[0098]
琼脂糖-纤维蛋白原平板的制备：将配置好纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液放入水浴锅预热,迅速取琼脂糖溶液，加入预热好的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，迅速混合，放置室温1h待凝固后进行打孔。
[0099]
样品的检测：用移液枪准确量取标品及样品各15μl，分别点在同一平皿中，加盖，放入37℃恒温培养14～16h。