荔枝核提取物的制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域。更具体地说，本发明涉及荔枝核提取物的制备方法和应用。


背景技术：

2.乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据国际癌症研究机构发布的最新《世界癌症报告》数据显示，以女性为主的乳腺癌发病人数超过全人群肺癌，成为全球最常见癌症。同样，在我国乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤的首位。近年来，我国乳腺癌的发病率仍呈现明显的上升趋势，且发病年龄年轻化，已成为严重威胁我国女性健康的重要公共卫生问题。三阴性乳腺癌由于缺乏雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2，导致其侵袭性更强，恶性程度更高，对常规治疗方案不敏感，患者预后更差、死亡率高。在过去的数十年间，随着各种新药物、新技术和新治疗策略的不断发展，乳腺癌的治疗效果得到一定改善。尽管如此，肿瘤耐药和复发、转移等问题仍无法得到根本性解决，其远期生存率并未获得明显提高。
3.目前认为，大多数实体癌，包括乳腺癌，都是干细胞疾病。乳腺癌的复发归因于肿瘤内部的异质性，以及存在一个可以抵抗治疗和重新启动肿瘤的亚群，这个细胞亚群通常被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells，cscs)，对于肿瘤的传播和转移至关重要，获得肿瘤干细胞样特征是导致乳腺癌耐药、转移和预后恶化的主要原因之一。研究表明具有肿瘤干细胞样特性的cd44

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细胞群在三阴性乳腺癌细胞中富集，并具有更强的侵袭能力。
4.乳腺癌属于中医“乳岩”“乳石痈”“乳栗”“石奶”等范畴。大多是因为肝郁痰凝、冲任失调、气滞血瘀等造成的，所以在治疗中多选用疏肝解郁、理气散结、调摄冲任、活血化瘀的中药。
5.荔枝核为无患子科植物荔枝(litchi chinensis sonn.)的干燥成熟种子，其味甘、微苦，温。归肝、肾经，有行气散结，祛寒止痛的疗效，用于寒疝腹痛，睾丸肿痛。现代药理研究表明，荔枝核乙醇提取物对非小细胞肺癌、前列腺癌、结肠癌等具有一定的抑制作用，但是关于单味药材荔枝核提取物对三阴性乳腺癌及肿瘤干细胞的作用尚未见报道，并且现有的荔枝核提取物的制备方法存在着纯度较低的问题。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供荔枝核提取物的制备方法，制备过程中采用中等极性的50％-70％乙醇进行提取，可以有效提取黄酮苷类、黄酮醇类及原花青素类化合物，减少其他物质的干扰。同时，提取温度采用75-80℃下进行回流提取，减少原花青素类化合物的有效破坏；此外，通过大孔树脂的洗脱，进一步的富集有效成分以及去除杂质。提取方法效率高，步骤少，适合工业化生产。
7.本发明的另一个目的是提供荔枝核提取物的应用，荔枝核提取物对三阴性乳腺癌
生长、转移及乳腺癌干细胞具有调控作用，能应用于开发靶向肿瘤干细胞的药物，对于三阴性乳腺癌耐药、复发和转移的防治具有重要意义。
8.为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了荔枝核提取物的制备方法，包括：
9.步骤一、将干燥荔枝核碾碎，过20-40目筛，之后按照料液比1∶8-1∶10加入相应体积分数为50-60％的乙醇溶液为溶剂，在75-80℃下回流提取2-3次，每次2-3h，提取液静置后抽滤得到上清液；
10.步骤二、将上清液在50-60℃浓缩至无醇味，所得产物用引流的方式加入hpd-bjqh大孔树脂柱中富集有效部位，hpd-bjqh大孔树脂重量份为荔枝核重量份的2-3倍，之后依次用去离子水、体积分数为20％的乙醇、体积分数为70％的乙醇洗脱大孔树脂柱，收集70％洗脱液，之后将洗脱液浓缩，然后真空冷冻干燥，碾磨成粉末，即得荔枝核提取物。
11.优选的是，所述的荔枝核提取物的制备方法中，所述步骤二中hpd-bjqh大孔树脂重量份为荔枝核重量份的3倍。
12.优选的是，所述的荔枝核提取物的制备方法中，所述步骤二中将上清液用旋转蒸发仪在0.1mpa，60℃，转速80rpm条件下浓缩至浓缩液的密度为1.5g/ml以上。
13.优选的是，所述的荔枝核提取物的制备方法中，所述步骤二中将洗脱液用旋转蒸发仪在0.1mpa，60℃，转速80rpm条件下浓缩至无醇味。
14.优选的是，所述的荔枝核提取物的制备方法中，所述步骤二中真空冷冻干燥是在-50℃冷阱温度下，真空冷冻干燥48h。
15.荔枝核提取物在制备抑制三阴性乳腺癌生长、转移和干性的药物中的应用。
16.荔枝核提取物在制备功能性食品中的应用。
17.本发明至少包括以下有益效果：
18.1)荔枝核含有大量的黄酮苷类及原花青素类化合物，本发明采用中等极性的50％-70％乙醇进行提取，可以有效提取黄酮苷类、黄酮醇类及原花青素类化合物，减少其他物质的干扰。同时，提取温度采用75-80℃下进行回流提取，减少原花青素类化合物的有效破坏；此外，通过大孔树脂的洗脱，进一步的富集有效成分以及去除杂质，使得提取物的纯度能达到50％左右。本发明提取方法效率高，步骤少，适合工业化生产。
19.2)本发明为大众提供了一种荔枝核提取物在制备治疗三阴性乳腺癌药物或功能性食品中的应用。我国是荔枝主产国，资源丰富，但是大量的荔枝核被废弃，研究开发荔枝核活性成分的功效应用，可以促进荔枝的合理利用与开发。本发明显示荔枝核提取物抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭，并发挥抑制乳腺癌干细胞的作用，因此值得进一步开发。
20.3)通过本发明制得的提取物可直接制成片剂、颗粒剂、散剂、茶剂、胶囊剂、糖浆剂等，作为功能食品添加剂添加到食品、饮料或者药品中，应用于三阴性乳腺癌的治疗或辅助治疗，扩大荔枝核的药用范围。
21.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
22.图1是荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响图；
23.图2是荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞迁移的影响图；其中，图2a是mda-mb-231细胞在5μg/ml和10μg/ml荔枝核提取物分别作用12h和24h后细胞迁移情况图；图2b是5μg/ml和10μg/ml荔枝核提取物作用mda-mb-231细胞后相对迁移率的统计图；
24.图3是荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞侵袭的影响图；其中，图3a是mda-mb-231细胞在25μg/ml和50μg/ml荔枝核提取物作用72h后细胞侵袭情况图；图3b是25μg/ml和50μg/ml荔枝核提取物作用mda-mb-231细胞后侵袭到小室底部细胞数的统计图；图3c是mda-mb-468细胞在20μg/ml和40μg/ml荔枝核提取物作用72h后细胞侵袭情况图；图3d是20μg/ml和40μg/ml荔枝核提取物作用mda-mb-468细胞后侵袭到小室底部的细胞数统计图；
25.图4是荔枝核提取物对体内三阴性乳腺癌生长的影响图；其中，图4a是荷瘤裸鼠经30mg/kg和60mg/kg荔枝核提取物、10mg/kg白蛋白紫杉醇治疗后的肿瘤体积变化曲线图；图4b是模型组、30mg/kg和60mg/kg荔枝核提取物治疗组、10mg/kg白蛋白紫杉醇治疗组裸鼠异种移植瘤的重量统计图；
26.图5是荔枝核提取物对三阴性乳腺癌裸鼠异种移植瘤中cd44

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比例的影响图；其中，图5a是模型组和60mg/kg荔枝核提取物治疗组的裸鼠异种移植瘤中cd44

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流式细胞术实验结果图；图5b是模型组和60mg/kg荔枝核提取物治疗组的裸鼠异种移植瘤中cd44

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比例统计图。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
28.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
29.1实验方法
30.1)细胞及动物：人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231、mda-mb-468、hcc1806由广西医科大学转化医学研究中心&长寿与老年相关疾病教育部重点实验室提供。balb/c裸鼠，雌性，6周龄，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
31.2)细胞培养：mda-mb-231、mda-mb-468细胞培养于含10％的fbs，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素的dmem高糖完全培养基中，hcc1806细胞培养于含10％的fbs，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素的rpmi-1640完全培养基中。
32.3)荔枝核提取物的制备
33.将干燥荔枝核碾碎，过20-40目筛，之后按照料液比1∶10加入相应体积分数为50％的乙醇溶液为溶剂，在80℃下回流提取3次，每次2h，将提取液合并、静置后抽滤得到上清液，然后用旋转蒸发仪在0.1mpa，60℃，转速80rpm条件下浓缩至浓缩液的密度为1.5g/ml以上；将所得产物用引流的方式加入hpd-bjqh大孔树脂柱中富集有效部位，hpd-bjqh大孔树脂重量份为荔枝核重量份的3倍，引流时要避免树脂颗粒被液体冲散；依次用去离子水洗涤，洗涤体积为3个柱体积，流速为5ml/min，体积分数为20％的乙醇洗涤，洗涤体积为3个柱体积，流速为5ml/min，最后用体积分数为70％的乙醇洗涤，洗涤体积为3个柱体积，流速为5ml/min洗脱大孔树脂柱。弃去去离子水和20％乙醇提取部位，收集70％洗脱液，用旋转蒸发仪在0.1mpa，60℃，转速80rpm条件下浓缩至无醇味，然后在-50℃冷阱温度下，真空冷冻
干燥48小时，碾磨成粉末，即得具有防治乳腺癌转移和干性的荔枝核提取物。
34.4)cck-8法检测荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响
35.取对数生长期的三阴性乳腺癌细胞接种于96孔板中，2000个/孔，24h待细胞贴壁后，每孔分别加入含有不同浓度药物的培养基，荔枝核提取物最终浓度为0、10、20、30、40、60、80、120、160μg/ml，每个浓度设置3个复孔，同时设置对照组，将96孔板置于37℃，5％co2培养箱继续培养72h后，弃去培养基。重新加入100μl/孔培养基后，避光加入10μl/孔cck-8试剂，置于37℃，5％co2培养箱孵育1h后，使用酶标仪在450nm处测定吸光光度值，根据公式计算细胞相对活性：细胞相对活性＝[(含药血清孔od值-含药调零od值)/(对照血清孔od值-对照调零od值)]
×
100％。实验重复三次。
[0036]
5)细胞划痕愈合实验检测荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞迁移的影响
[0037]
实验前，用记号笔在六孔板背面画3条平行直线横穿过6孔板。取对数生长期的mda-mb-231细胞，经胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为8
×
105个/孔，接种到6孔板中。待细胞完全贴壁且汇合度＞95％时，向6孔板中加入20μg/ml的丝裂霉素c，置于37℃恒温孵育箱，孵育2h。用无菌的10μl枪头尖部垂直于细胞表面与预先画好的黑线垂直划直线。用d-pbs轻洗细胞3次。分别加入含5μg/ml、10μg/ml荔枝核提取物的无血清培养基，同时设置对照组。在药物干预后的0h、12h、24h，分别置于倒置显微镜下对同一视野固定位置拍照，每个孔的固定观察点不少于10个。使用image-pro plus软件对图片进行处理分析，统计不同时间点的划痕面积，计算细胞迁移率。
[0038]
6)transwell法(含matrigel)检测荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞侵袭的影响
[0039]
取对数生长期的mda-mb-231、mda-mb-468细胞，胰酶消化后，接种于培养皿中。种板第二天待细胞贴壁进行给药干预72h。取matrigel(matrigel∶无血清培养基＝1∶8)放置在冰上稀释，稀释后取60μl垂直加入于transwell小室底部，孵育30min(37℃，5％co2)，使胶凝固。药物作用72h后，弃去培养基，用d-pbs清洗细胞2次，加入胰酶进行消化，离心，加入无血清培养基重悬细胞，调整mda-mb-231细胞浓度为5
×
104个/孔，mda-mb-468细胞浓度为4
×
104个/孔接种于上室中，下室加800μl的培养基(含20％fbs)，将24孔板置于孵箱中继续培养(37℃，5％co2)24h，吸去小室中的培养基，用d-pbs润洗小室底部，将小室于室温置于4％多聚甲醛中30min，用d-pbs清洗3次，置于结晶紫中，室温避光染色30min，然后用超纯水清洗3次。用洁净的棉签小心擦拭干净小室内的细胞，并置于通风橱中晾干。倒置显微镜下观察，拍照并记录穿过的其底部的细胞数量。
[0040]
7)荔枝核提取物对裸鼠异种移植瘤的影响
[0041]
28只6周龄balb/c雌性裸鼠适应性饲养一周后进行实验。收集对数生长期的hcc1806细胞，用d-pbs重悬细胞后调整细胞密度为2
×
107个/ml，使用胰岛素注射器取100μl细胞悬液接种于裸鼠右侧第三对乳腺脂肪垫中。肿瘤平均体积达30mm3时，随机将裸鼠分为4组，每组7只。给药方式和给药剂量如下：
①
模型组(0.9％生理盐水，0.2ml/只，灌胃)；
②
低剂量荔枝核提取物组(30mg/kg荔枝核提取物，0.2ml/只/天，灌胃)；
③
高剂量荔枝核提取物组(60mg/kg荔枝核提取物，0.2ml/只/天，灌胃)；
④
阳性药组(10mg/kg白蛋白紫杉醇，0.2ml/只，一周两次，腹腔注射)。每3天测量一次肿瘤体积，肿瘤体积＝0.5
×
长
×
宽2。连续给药3周后，实验周期结束，进行取材。
[0042]
8)流式细胞术检测荔枝核提取物对体内cd44

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乳腺癌干细胞比例的影响
[0043]
取各组裸鼠异种移植瘤，胶原酶i和0.25％胰酶消化后，加入适量的完全培养基反复吹打成单个细胞悬液，同时设置同型对照组、空白组和实验组。每组收集106个细胞，加入抗cd24-fitc和抗cd44-apc及其同型对照抗体进行标记，避光冰上孵育30min。孵育结束后，使用含1％bsa的d-pbs清洗1-2次，用1ml d-pbs(1％bsa)重悬后，上机检测细胞的cd44

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比例。
[0044]
2数据统计分析
[0045]
采用spss 23.0软件进行单因素方差分析(anova)，方差不齐时采用tamhane’s t2分析，数值由平均值
±
标准差表示。以p＜0.05为差异具有统计学意义。
[0046]
3实验结果
[0047]
3.1荔枝核提取物抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖
[0048]
采用cck-8法，检测荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231、mda-mb-468、hcc1806增殖能力的影响，结果如图1所示。结果显示：荔枝核提取物处理乳腺癌细胞72h后，mda-mb-231、mda-mb-468、hcc1806的ic
50
值分别为47.92μg/ml、39.45μg/ml、25.82μg/ml。上述结果表明荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞有明显的生长抑制作用。
[0049]
3.2荔枝核提取物抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移
[0050]
通过细胞划痕愈合实验，探究荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231体外迁移能力的影响，结果如图2a和2b所示，与对照组相比，***p＜0.001。结果显示：荔枝核提取物可以显著抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移能力。
[0051]
3.3荔枝核提取物抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭
[0052]
采用transwell实验(含matrigel)检测荔枝核提取物对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响，其中，对mda-mb-231细胞侵袭能力的影响如图3a和3b所示，对mda-mb-468细胞侵袭能力的影响如图3c和3d所示。与对照组相比，***p＜0.001。结果显示：荔枝核提取物(25μg/ml和50μg/ml)处理72h，mda-mb-231细胞侵袭到下室的细胞数量分别为对照组的41.4％、18.5％。另外，荔枝核提取物(20μg/ml和40μg/ml)处理72h，mda-mb-468细胞侵袭到下室的细胞数量分别为对照组的38.7％、8％。说明荔枝核提取物可以抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭。
[0053]
3.4荔枝核提取物在体内抑制三阴性乳腺癌的生长
[0054]
通过构建三阴性乳腺癌细胞hcc1806裸鼠异种移植瘤模型，探究荔枝核提取物对体内三阴性乳腺癌生长的影响，hcc1806荷瘤裸鼠中治疗组以不同浓度的荔枝核提取物(30mg/kg和60mg/kg)每天灌胃治疗，持续21天；模型组每天灌胃等量0.9％生理盐水，阳性药组腹腔注射白蛋白紫杉醇(10mg/kg，一周两次)。每三天测量一次裸鼠的肿瘤体积，结果如图4a所示。治疗结束后，称量得到每组异种移植瘤的重量，结果如图4b所示。与模型组比较，**p＜0.01，*p＜0.05。结果显示：30mg/ml和60mg/kg荔枝核提取物组裸鼠异种移植瘤的体积、重量均显著低于模型组，说明荔枝核提取物可以抑制体内三阴性乳腺癌的生长。
[0055]
3.5荔枝核提取物降低裸鼠异种移植瘤中cd44

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干细胞比例
[0056]
采用流式细胞术实验检测了荔枝核提取物对裸鼠异种移植瘤中的cd44

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干细胞比例的影响，结果如图5a和5b所示，与模型组相比，**p＜0.01。结果显示：经60mg/kg荔枝核提取物治疗后，裸鼠异种移植瘤中cd44

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干细胞比例明显下降，即荔枝核提取物在体内可抑制乳腺癌干细胞。
[0057]
4结论
[0058]
荔枝核提取物具有抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭，并发挥抑制乳腺癌干细胞的作用。
[0059]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。