利用Nectin1基因变异检测结果评估HSV-1溶瘤病毒疗效的方法

利用nectin1基因变异检测结果评估hsv-1溶瘤病毒疗效的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用nectin1基因变异检测结果评估hsv-1溶瘤病毒疗效的方法。


背景技术：

2.溶瘤病毒疗法(oncolytic virus therapy,ovt)作为一种创新型免疫肿瘤治疗方法近年来备受关注，在世界范围内受到极大重视，并且在2015年已经被fda批准上市(amgen公司，talimogene laherparepvec,t-vec)。溶瘤病毒能在对肿瘤细胞造成损伤的同时激发机体的自身免疫，从而产生强烈的异位抑瘤效应。
3.肿瘤的精准治疗时代，肿瘤患者的个性化治疗变得至关重要。近年来国内外溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多，而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。溶瘤病毒作为近年来才广受关注的领域，大部分研究集中在溶瘤病毒改造以提高疗效上，却忽略了溶瘤病毒宿主依赖因子治疗抵抗的问题。目前hsv-1溶瘤病毒临床试验发现只有部分病人有效，说明存在溶瘤病毒治疗抵抗的问题，我们认为可能与病毒的特性及宿主自身的特点有关，因此，需要对病毒与宿主的关系有更深刻的理解。事实上，hsv-1病毒是一种非细胞生命形态，必须在活细胞内寄生并依赖宿主的一些蛋白进行复制繁殖，这些蛋白被称为病毒的宿主依赖因子hdfs(host dependency factors,hdfs)。hdfs的缺失将导致hsv-1病毒感染失败。
4.ovt治疗肿瘤的原理就在于溶瘤病毒感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内不断增殖，最终达到裂解肿瘤的目的。nectin1蛋白是已知的hsv-1宿主依赖因子hdf，介导hsv-1病毒和宿主细胞的结合。因此，我们认为肿瘤中nectin1蛋白的缺失将导致hsv-1溶瘤病毒感染失败，进而导致以hsv-1为骨架的溶瘤病毒治疗肿瘤无效。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种利用nectin1基因变异检测结果评估hsv-1溶瘤病毒疗效的方法。该方法利用nectin1基因突变与否作为hsv-1溶瘤病毒治疗的伴随检测指标，解决了hsv-1溶瘤病毒治疗过程中的精准性问题。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.利用nectin1基因突变检测结果评估hsv-1溶瘤病毒治疗疗效的方法：分析肿瘤患者癌细胞中nectin1基因的变异情况，若nectin1基因未发生变异，则指示患者可以采用hsv-1溶瘤病毒疗法；若nectin1基因变异，则指示患者采用hsv-1溶瘤病毒疗法的有效性降低或无效。
8.进一步地，本发明所述nectin1基因变异，其直接结果将导致nectin1基因产物即nectin1的mrna及蛋白的表达量变化。
9.进一步地，所述nectin1基因变异是指引起nectin1的mrna及蛋白功能失常的基因
变异，包括nectin1基因的缺失、插入、点突变、置换等。
10.本发明的有益效果在于：本发明充分证实了宿主细胞中nectin1变异会导致hsv-1无法感染患者的肿瘤细胞，进而导致患者无法接受hsv-1溶瘤病毒疗法治疗或导致溶瘤病毒的疗效降低，因此本发明提出了将nectin1基因变异或者表达水平应用于评估溶瘤病毒治疗疗效的方法，该方法根据nectin1基因的变异与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗，即根据患者癌细胞中nectin1基因是否变异来判断患者是否适合采用hsv-1溶瘤病毒疗法，可以为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据，以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。
11.过去几十年间，大量溶瘤病毒类药物进入了临床试验，但其中绝大部分的溶瘤病毒都由于缺乏显著疗效而止步于临床i/ii期。通过tcga癌症数据库分析，发现hsv-1受体nectin1在肿瘤患者中平均突变频率超过2％，并且nectin1基因大多数的突变都是缺失突变；此外，nectin1的突变位点分布较为广泛。因此，本发明提出通过分析nectin1基因的变异情况，预测其是否影响hsv-1溶瘤病毒治疗，将提高hsv-1溶瘤病毒治疗的有效率。
附图说明
12.图1为hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒构建示意图，其中，a为hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒感染293t细胞。分别利用moi＝0.01、moi＝0.1和moi＝1的重组溶瘤病毒hsv-1-δicp34.5-egfp感染293t细胞，24小时后利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况。结果表明hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒制备成功；b为提取hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒的基因组，针对病毒基因组中的gfp基因进行pcr扩增，之后，进行测序分析扩增产物序列。结果显示gfp基因成功整合进入hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒，表明了hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒构建成功。
13.图2为不同细胞对hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒的敏感性。利用moi＝1的溶瘤病毒hsv-1-δicp34.5-egfp分别感染panc02细胞、mc38细胞、bgc-823细胞和l929细胞，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h检测细胞的存活情况。结果表明，panc02细胞、mc38细胞、bgc-823细胞和l929细胞都对hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒敏感。
14.图3为hsv-1-δicp34.5-egfp病毒治疗小鼠结肠癌的效果。
15.图4为nectin1基因变异细胞的鉴定。a为提取野生型和nectin1基因变异的mc38细胞基因组，针对nectin1基因敲除的位置进行pcr扩增，之后进行测序分析扩增产物序列。结果显示nectin1基因组有2个碱基的缺失，导致了nectin1蛋白移码突变。b为收集野生型和nectin1基因变异的mc38细胞，提取细胞总蛋白，western blotting鉴定nectin1蛋白的表达水平。结果表明了nectin1基因变异后，nectin1蛋白表达缺失。
16.图5，a为hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒病毒与宿主细胞膜结合能力检测原理图。b为nectin1的缺失有效阻止hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒和细胞质膜的结合。将hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒与mc38细胞充分结合后，收集mc38细胞，加入细胞裂解液裂解并提取基因组，针对病毒gd基因进行qpcr，进行hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒结合量的鉴定。
17.图6，a为nectin1的缺失有效阻止hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒感染细胞。将hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒(moi＝1)加入培养的mc38细胞和mc38
nectin1-/-细胞中，24
小时后利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况。结果表明nectin1缺失的细胞表现出对hsv-1感染的抵抗，而野生型l929细胞在病毒感染后呈簇状变圆死亡，且细胞表达的荧光更强；b为hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒不同时间点对细胞的感染情况。将hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒(moi＝1)加入培养的mc38细胞和mc38
nectin1-/-细胞中，分别在0h、24h、48h和72h检测细胞的存活情况。结果表明，随时间推移，nectin1缺失的细胞依然有很强的抗病毒能力。
18.图7为hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒对nectin1缺失小鼠结肠癌的治疗效果。
具体实施方式
19.以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
20.1、hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒的制备
21.为了检测hsv-1溶瘤病毒对癌细胞的感染能力，我们使用了基因组整合绿色荧光蛋白基因的溶瘤病毒hsv-1-δicp34.5-egfp。为了制备安全高效的溶瘤病毒，我们利用crispr/cas9技术制备icp34.5基因缺失的hsv-1溶瘤病毒(图1)。具体为：首先，我们将针对hsv-1基因组上icp34.5基因位点的crispr/cas9系统导入细胞，造成icp34.5基因的断裂，接着，利用同源重组技术形成icp34.5基因位点的插入缺失，不仅剔除了具有神经毒性的hsv-1-icp34.5基因，并在该基因位置插入了绿色荧光蛋白egfp基因，以便于观察转染效率以及基因编辑病毒的形成。
22.2、hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒有效感染多种癌细胞
23.为了探究不同类型肿瘤细胞对溶瘤病毒的敏感性，我们收集了panc02(小鼠胰腺癌细胞)、mc38(小鼠结肠癌细胞)、bgc-823(人胃腺癌细胞)和l929(小鼠成纤维细胞)等4种人源和鼠源细胞。我们利用moi＝1的hsv-1-δicp34.5-egfp病毒感染细胞，分析细胞对icp34.5突变hsv-1病毒的敏感性。结果显示，hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒对这些细胞都有很强的感染裂解能力(图2)。
24.3、hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒有效抑制肿瘤生长
25.为了进一步评估hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒在小鼠体内的抗肿瘤潜力，我们以小鼠mc38结肠癌模型为例，研究了hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒的肿瘤治疗能力。其中hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒每隔4天治疗一次，共6次，mock组用pbs替代溶瘤病毒，4天一次。每隔4天测量肿瘤体积，通过肿瘤大小变化来评判溶瘤病毒的治疗效果。结果表明，hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒治疗后小鼠肿瘤体积明显缩小(图3)。
26.4、nectin1基因变异导致nectin1蛋白功能的缺失
27.4.1、nectin1基因变异影响nectin1蛋白表达
28.nectin1蛋白是hsv-1、hsv-2的糖蛋白d(gd)受体，介导hsv-1病毒进入宿主细胞。因此，其突变有可能影响到hsv-1溶瘤病毒的治疗效果。为了验证我们的猜想，我们利用crispr技术构建了带有nectin1基因突变的结肠癌mc38细胞株(mc38
nectin1-/-)。如图4所示，细胞中nectin1基因突变导致nectin1蛋白不能表达。
29.4.2、nectin1蛋白缺失降低hsv-1病毒和细胞膜的结合
30.结合受体nectin1蛋白是hsv-1病毒感染宿主细胞的第一步。hsv-1病毒感染时，nectin1蛋白的主要功能是介导细胞膜和hsv-1病毒的gd蛋白结合。因此，如图5a所示，我们
通过病毒和宿主细胞的膜结合实验来确定nectin1基因突变是否影响nectin1蛋白的功能。具体如下：(1)细胞计数，以5
×
105/孔的细胞密度铺6孔板。(2)细胞贴壁后换成4℃预冷的培养基，分别向六个孔里加入moi＝1，10，20，50的病毒，4℃摇床培养箱培养1h，细胞表面有病毒的受体，病毒就能结合到细胞膜或者进入细胞内，而受体缺失的细胞，则不能结合病毒。(3)弃细胞培养上清，pbs清洗3遍。(4)收集细胞，加入细胞裂解液裂解并提取基因组，针对病毒gd基因进行qpcr，进行hsv-1病毒结合量的鉴定。
31.如图5b所示，和野生型细胞相比，nectin1蛋白缺失后，细胞上的病毒结合量降低了将近50倍，表明nectin1蛋白的缺失能有效阻止hsv-1病毒和宿主细胞膜的结合。
32.4.3、nectin1蛋白缺失抑制hsv-1在结肠癌mc38细胞中的增殖
33.用hsv-1感染野生和nectin1敲除的mc38细胞。结果显示，hsv-1的感染导致wt细胞死亡，而mc38
nectin1-/-细胞状态几乎没有变化(图6a)。此外，通过细胞活率的统计，我们发现相较于野生型细胞，nectin1敲除细胞对hsv-1溶瘤病毒有显著抵抗能力(图6b)。
34.5、nectin1基因变异导致溶瘤病毒治疗失败
35.为了进一步评估hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒对nectin1基因缺失的肿瘤的治疗效果，我们以小鼠mc38结肠癌模型为例，研究了hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒的肿瘤治疗能力。其中hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒每隔4天治疗一次，共6次，mock组用pbs替代溶瘤病毒，4天一次。每隔4天测量肿瘤体积，通过肿瘤大小变化来评判溶瘤病毒的治疗效果。我们发现hsv-1-δicp34.5-egfp溶瘤病毒对小鼠mc38结肠癌有明显的治疗效果，而对小鼠mc38-δnectin1结肠癌肿瘤没有明显效果(图7)。
36.综上，本发明充分证实了宿主细胞中nectin1变异会导致hsv-1无法感染患者的肿瘤细胞，进而导致患者无法接受hsv-1溶瘤病毒疗法治疗或导致溶瘤病毒的疗效降低。因此，本发明提出了将nectin1基因变异应用于评估溶瘤病毒治疗疗效的方法，该方法根据nectin1基因的变异与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗，可以为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据，以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。