抑制迁移的1-咪唑-β-咔啉-3-甲酰-RGDF及制备,抗癌转移作用和应用

抑制迁移的1-咪唑-β-咔啉-3-甲酰-rgdf及制备,抗癌转移作用和应用
技术领域
1.本发明涉及一种1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe,涉及它的制备方法, 涉及它抑制肿瘤细胞迁移的活性，涉及它抑制lewis小鼠肿瘤向肺转移的活性。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤转移药物中的应用。本发明属于生物医药领域


背景技术：

2.目前，癌症是全球第二大死亡原因。所述癌症死亡病例的大多数死于肿瘤转移。此外，目前临床仍然缺乏安全有效的抗肿瘤转移药物。可见，开发新型抗肿瘤转移药物具有重要的现实意义。
3.β-咔啉类化合物是一类具有吡啶并[3,4-b]吲哚结构的吲哚类生物碱，广泛存在于自然界的动植物中。β-咔啉类化合物可影响多个与肿瘤相关的靶点。例如,可作用于dna,调节细胞周期,诱导细胞凋亡,抑制dna拓扑异构酶和组蛋白去乙酰化酶等等。咪唑可以通过共价和非共价地与dna发生相互作用而产生抗肿瘤作用的潜力，作为抗癌活性的化合物的重要建筑块。
[0004]
巨噬细胞是穿透肿瘤的最丰富的免疫细胞。肿瘤相关的巨噬细胞(tam)可以促进肿瘤细胞迁移和侵袭,因而对癌转移有重要影响。肿瘤相关的巨噬细胞促进肿瘤细胞迁移和侵袭的部分机制涉及由癌细胞表达的白细胞介素-1α(il-1α)能够募集环氧化酶-2(cox2)表达的巨噬细胞。反过来,募集的巨噬细胞又促进肿瘤细胞迁移和侵袭,进一步推进肿瘤转移进程。
[0005]
上述知识说明，能够进入白细胞介素-1α和环氧化酶-2的活性口袋的化合物将有能力抑制巨噬细胞募集,因而有能力抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,以及有能力抑制癌转移。在分析了白细胞介素-1α和环氧化酶-2的活性口袋的形态之后,发明人设计了1-(1h-咪唑-2
‑ꢀ
基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe。利用分子对接技术，发明人将该化合物与白细胞介素-1α及环氧化酶-2对接。发现1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe可以很好地进入白细胞介素-1α和环氧化酶-2的活性口袋(此处省略分子对接图)。这些理论研究，使发明人认识到1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe可抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,因而可抑制癌转移。根据这种认识，发明人完成了后面的实验研究。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供了一种下式结构的全新的化合物1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg
‑ꢀ
gly-asp-phe，
[0007]
[0008]
本发明的第二个内容提供了采用下述方法制备上式结构的1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉
ꢀ‑
3-甲酰-arg-gly-asp-phe：
[0009]
1)在三氟醋酸的催化下l-trp-obzl与咪唑-2-甲醛进行pictet-spengler缩合,得到 3s-1-(1h-咪唑-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0010]
2)3s-1-(1h-咪唑-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃中用2,3-二氯-5,6
‑ꢀ
二氰对苯醌氧化,得到1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0011]
3)在四氢呋喃中1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯用pd/c催化氢解脱苄酯,得到 1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸；
[0012]
4)采用多肽合成的常规方法制备arg(no2)-gly-asp(obzl)-phe-obzl；
[0013]
5)1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸与arg(no2)-gly-asp(obzl)-phe-obzl偶联制备 1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg(no2)-gly-asp(obzl)-phe-obzl；
[0014]
6)脱除1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg(no2)-gly-asp(obzl)-phe-obzl的保护基制备1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe。
[0015]
本发明的第三个内容是采用mtt法证实上式结构的1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰
ꢀ‑
arg-gly-asp-phe不是细胞毒类化合物。
[0016]
本发明的第四个内容是采用transwell小室模型评价上式结构的1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用。
[0017]
本发明的第五个内容是评价上式结构的1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰
ꢀ‑
arg-gly-asp-phe抑制肿瘤的向肺转移作用。
附图说明
[0018]
图1.1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe的合成路线:i)三氟乙酸,二氯甲烷；ii)二氯二氰基苯醌,四氢呋喃；iii)氢气,钯碳,四氢呋喃；iv)2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐,n-甲基吗啉,n,n-二甲基甲酰胺；v)三氟乙酸,三氟甲磺酸,乙醚；vi)二环己基碳二亚胺,1-羟基苯并三唑,n-甲基吗啉,四氢呋喃；vii)ch3oh, naoh(2n)；viii)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)。
具体实施方式
[0019]
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0020]
实施例1制备(s)-1-(1h-咪唑-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)
[0021]
0℃及搅拌下将3g(10.0mmol)l-色氨酸苄酯溶于100ml二氯甲烷，然后加入2ml 三氟乙酸，反应30分钟。之后加入1.18g(12.0mmol)咪唑-2-甲醛，室温反应12小时。之后tlc(给出展开溶液)显示l-色氨酸苄酯消失。减压浓缩除去剩余的三氟乙酸，残留物用100ml二氯甲烷溶解,依次用饱和nahco3溶液(20ml
×
3)和饱和nacl溶液(20ml
×
3) 洗，二氯甲烷层用无水na2so4干燥12小时,过滤,滤液减压浓缩至干,得到3g无色固体。该固体用硅胶柱层析纯化(dcm:meoh,20:1)，得3.5g(94％)标题化合物,为无色粉末。1h nmr(800mhz,dmso-d6)δ10.43(s,1h),7.44(d,j＝7.6hz,2h),7.45
–
7.39(m,3h), 7.39
–
7.21(m,3h),7.01(t,j＝7.5hz,1h),6.99(s,2h),6.95(t,j＝7.4hz,1h),5.41(s,1h), 5.27
–
5.19(m,2h),3.96(dd,
j＝11.2,4.1hz,1h),3.09
–
3.04(m,1h),2.82(ddd,j＝13.9, 11.1,2.5hz,1h)。
[0022]
实施例2制备1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)
[0023]
0℃及搅拌下将4.5g(12.0mmol)(s)-1-(1h-咪唑-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯溶于150ml四氢呋喃中，加入5.7g(25.0mmol)二氯二氰基苯醌，室温反应48小时后tlc(二氯甲烷:甲醇,20:1)显示(s)-1-(1h-咪唑-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯 (1)消失。减压浓缩,残留物用150ml乙酸乙酯溶解,依次用饱和nahco3水溶液洗 (20ml
×
3)和饱和nacl水溶液洗(20ml
×
3)。合并乙酸乙酯层,用无水na2so4干燥,过滤, 滤液减压浓缩至干,得到4.2g无色固体。该固体用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯, 1.5:1)，得2.4g(53％)标题化合物,为无色粉末。esi/ms(m/e):391[m na]

；1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ12.89(s,1h),11.97(s,1h),8.94(s,1h),8.42(d,j＝7.9hz,1h),7.98(d, j＝8.3hz,1h),7.75
–
7.65(m,1h),7.60(dd,j＝13.4,7.2hz,3h),7.38(dp,j＝19.9,7.1hz, 6h),5.50(s,2h)。
[0024]
实施例3制备1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸(3)
[0025]
搅拌下将1.5g(4.0mmol)1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)溶于50ml四氢呋喃, 加入200mg钯碳并通入氢气进行反应。室温反应24h后tlc(二氯甲烷:甲醇,20:1)显示 1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)消失。滤除钯碳,减压浓缩除去溶剂后得1.0g(70％) 标题化合物,为黄色粉末。esi/ms(m/e):279[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ 13.28(s,1h),12.46(s,1h),11.98(s,1h),8.94(s,1h),8.43(d,j＝7.9hz,1h),7.98(d,j＝ 8.3hz,1h),7.60(d,j＝8.1hz,2h),7.34(dd,j＝12.8,5.0hz,2h)。
[0026]
实施例4制备boc-arg(no2)-gly-obzl
[0027]
0℃及搅拌下将3.19g(10.0mmol)boc-arg(no2)溶于100ml无水四氢呋喃,然后加 1.49g(11.0mmol)1-羟基苯并三唑和2.47g(1.0mmol)二环己基碳二亚胺,反应30分钟。之后,加2.22g(11.0mmol)gly-obzl。最后用n-甲基吗啉调反应液的ph至9,得到的反应液室温搅拌10h。过滤,滤液减压浓缩。残留物用50ml乙酸乙酯溶解,得到的溶液依次用饱和nahco3水溶液洗(30ml
×
3),饱和nacl水溶液洗(20ml
×
3),5％khso4水溶液洗 (20ml
×
3),饱和nacl水溶液洗(20ml
×
3),饱和nahco3水溶液洗(20ml
×
3)及饱和nacl 水溶液洗(20ml
×
3)。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12小时,过滤,滤液减压浓缩,残留物用30ml二氯甲烷溶解,静置6小时,使固体充分析出,过滤,得4.45g(96％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/e):467[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.49(s,1h), 8.29(t,j＝5.7hz,1h),7.83(s,2h),7.37(d,j＝3.7hz,4h),6.92(d,j＝8.0hz,1h),5.76(s, 1h),5.12(s,2h),3.89(tt,j＝17.4,8.2hz,3h),3.33(s,2h),1.64(s,1h),1.50(s,2h),1.38(s, 9h)。
[0028]
实施例5制备boc-arg(no2)-gly
[0029]
0℃及搅拌下将2.33g(5.00mmol)boc-arg(no2)-gly-obzl用45ml甲醇溶解,加氢氧化钠水溶液(2m)调反应液ph值到12,搅拌至tlc(二氯甲烷：甲醇＝20:1)显示 boc-arg(no2)-gly-obzl完全消失。反应液在0℃用饱和khso4水溶液调ph到7,减压浓缩,残余物加入15ml蒸馏水,再用饱和khso4水溶液调ph到2,水层用乙酸乙酯萃取(20ml
×
3),酯层用饱和氯化钠水溶液洗(20ml
×
3),乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12 小时,过滤,滤液减压浓缩，得1.7g(90％)标题化合物,为无色固体粉末。esi-ms(m/e): 377[m h]

。
[0030]
实施例6制备boc-asp(obzl)-phe-obzl
gly-asp(obzl)-phe-obzl(4)用1ml三氟乙酸和0.3ml三氟甲磺酸溶解,搅拌 0.5小时，反应混合物减压浓缩。残留物加入10ml无水乙醚,搅拌10分钟,有固体析出, 静置10分钟后弃上清液。该操作重复3次。收集得到的固体用50％水和50％甲醇溶解,用 10％氨水调ph到8,用c18柱纯化,洗脱剂为40％水和60％甲醇,洗脱液冻干得34mg (41％)标题化合物,为黄色固体。ft-esi-ms(m/e):754.31692[m h]

；1h nmr(300mhz, dmso-d6)δ14.27(s,1h),11.82(s,1h),10.22(s,1h),9.44(d,j＝9.0hz,1h),8.89(d,j＝ 8.2hz,1h),8.80(s,1h),8.65(s,1h),8.38(d,j＝7.9hz,1h),7.96(d,j＝8.3hz,1h),7.59 (ddd,j＝8.3,7.0,1.2hz,1h),7.46(s,1h),7.38
–
7.23(m,3h),7.16(q,j＝7.3hz,4h),7.08 (td,j＝6.4,5.7,2.4hz,1h),4.75(td,j＝9.2,4.3hz,1h),4.33(dt,j＝9.1,4.9hz,1h),4.09 (d,j＝6.4hz,1h),3.86(d,j＝15.9hz,1h),3.64(dd,j＝16.3,5.3hz,1h),3.22(s,1h),3.01 (dd,j＝13.5,6.5hz,2h),2.88(dd,j＝13.2,5.1hz,1h),2.60(dd,j＝16.0,4.6hz,1h),2.34 (s,2h),2.00(d,j＝8.2hz,1h),1.62(s,2h)。
[0042]
实施例12评价化合物5的细胞毒作用
[0043]
1-(1h-咪唑-2-基)-β-咔啉-3-甲酰-arg-gly-asp-phe(化合物5)用含0.5％dmso的1640培养基配制成所需浓度。分别将生长状态良好处于对数生长期的hct-116,a549,s180,llc, hl60,u2os,l02细胞按照4
×
104个/ml的密度接种于96孔板,每孔100μl。在37℃, 5％co2培养箱中培养4小时,按预设的浓度梯度100μm,50μm,25μm,10μm和1μm加入经灭菌处理的化合物5的溶液,对照组加入等体积溶解样品的含0.5％二甲基亚砜的 1640培养基。继续培养48小时后,每孔加25μl浓度为5mg/ml的mtt溶液,置于37℃孵育4小时,小心除去上清液后每孔加入100μl二甲基亚砜,振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定od(吸光度)值。按抑制率＝[(含0.5％二甲基亚砜的 1640培养基组的od平均值
–
化合物的od平均值)/含0.5％二甲基亚砜的1640培养基组的od值]
×
100％计算抑制率。实验平行重复6次,以抑制率对化合物浓度作图,计算本发明化合物的ic
50
(半数有效抑制浓度)值。
[0044]
结果列入表1。从结果可以看出本发明化合物中化合物5对六株肿瘤细胞和正常肝细胞 l02无抑制增殖作用。可见,本发明的化合物5不是细胞毒类化合物。
[0045]
表1化合物5抑制肿瘤细胞增殖的ic
50
[0046][0047]
n＝6
[0048]
实施例13评价化合物5抑制肿瘤细胞迁移活性
[0049]
llc和95d均属于贴壁依赖型细胞,采用单层培养的形式。从孵箱中取出细胞培养瓶, 显微镜观察细胞状态符合条件。对细胞进行洗涤,消化,分散和计数。之后,将细胞浓度稀释至5
×
105个/ml。95d细胞分散及稀释时使用无血清培养基(1640)进行吹打分散。llc 细胞分散及稀释时使用无血清培养基(dmem)进行吹打分散。在小室上室先加入100μl 细胞悬液后再加入25μl化合物5的水溶液至浓度为20μm。每板均设置阳性对照rgds 以及阴性对照无血清培养基,对照以及化合物3和5均设两个副孔。加完受试化合物以及对照液后,轻轻拍打24孔板四壁使小室上室的溶液混合均匀,下室中尽快加入600μl富含10％胎牛血清的
培养基并排除膜下气泡。置于37℃,5％co2的条件下培养各细胞株所需时间后进行后处理。后处理方法:用移液器小心吸除上室残液,每上室加入100μl pbs 缓冲液,用棉签小心擦除上室细胞,重复此操作两次使上室膜上一侧无细胞残留(防止破坏transwell小室膜)。吸除下室培养基,加入600μl 4％组织固定液,于4℃冰箱内固定上室膜下一侧细胞1小时,吸除下室残留液体,每下室加入600μl结晶紫染液,染色30 分钟。吸除回收染色液,用三蒸水漂洗聚碳酸酯膜上剩余结晶紫染液,于倒置显微镜下拍照。每个小室选取九个不同的视野,固定角度和放大倍数，视野内的细胞应该均匀分布，避免选取小室边缘的细胞视野，进行计数。用image j统计照片中的细胞数，以均值
±
sd 个表示，经t检验p＜0.05即有统计学差异。结果列入表2和3。结果表明,本发明化合物3在20μm的浓度下不影响95d和llc细胞迁移,本发明化合物5在20μm的浓度下有效地抑制95d和llc细胞迁移。
[0050]
表2化合物5对95d细胞迁移的影响
[0051][0052][0053]
a)与1640比p＜0.01；b)与1640比p》0.05；c)与1640比p＜0.01,与rgds比p＞0.05； n＝9.
[0054]
表3化合物5对llc细胞迁移的影响
[0055]
化合物浓度(μm)迁移细胞数，均值
±
sd个dmem-242
±
63rgds20125
±
44a化合物320245
±
66b化合物520102
±
36c[0056]
a)与dmem比p《0.01；b)与dmem比p》0.05；c)与dmem比p＜0.01,与rgds比p＞ 0.05；n＝9.
[0057]
实施例14评价化合物5抑制肿瘤细胞侵袭活性
[0058]
将基质胶从-20℃冰箱中取出,置于4℃冰箱中过夜,使其由固态完全转变为液态后, 使用无血清培养基将其稀释五倍并且均匀混合。吸取上述配置好的基质胶稀释液100μl 添加至transwell小室每孔上室中。将transwell小室置于37℃,5％co2的孵箱中孵育5小时。
[0059]
取出孵育好的transwell小室,吸出transwell小室中的液体部分,再向transwell小室每孔上室中加入50μl无血清培养基,放入37℃,5％co2的孵箱中孵育30分钟后吸出 transwell小室中的液体。
[0060]
llc属于贴壁依赖型细胞,采用单层培养的形式。从孵箱中取出细胞培养瓶,显微镜观察细胞状态符合条件。对细胞进行洗涤,消化,分散和计数。之后,将细胞浓度稀释至 5
×
105个/ml。分散及稀释时使用无血清培养基(dmem)进行吹打分散。在小室上室先加入100μl细胞悬液后再加入25μl化合物3或5的水溶液至浓度为20μm。每板均设置阳性以及阴性对
照组,对照以及化合物3或5均设两个副孔。加入化合物3或5以及对照液后，轻轻拍打24孔板四壁使小室上室的溶液混合均匀，下室中尽快加入600μl富含10％胎牛血清的培养基并排除膜下气泡。置于37℃,5％co2的条件下培养各细胞株所需时间后进行后处理。
[0061]
后处理方法为用移液器小心吸除上室残液,每上室加入100μl pbs缓冲液,用棉签小心擦除上室细胞,重复此操作两次使上室膜上一侧无细胞残留(防止破坏transwell小室膜)。吸除下室培养基,加入600μl 4％组织固定液,于4℃冰箱内固定上室膜下一侧细胞1 h，吸除下室残留液体,每下室加入600μl结晶紫染液,染色30分钟。吸除回收染色液,用三蒸水漂洗聚碳酸酯膜上剩余结晶紫染液,于倒置显微镜下拍照,每个小室选取九个不同的视野,固定角度和放大倍数,视野内的细胞应该均匀分布,避免选取小室边缘的细胞视野计数。用image j统计照片中的细胞数,以均值
±
sd个表示，经t检验p＜0.05即有统计学差异。结果列入表4。从结果可以看出,本发明化合物中化合物5对肿瘤细胞侵袭无抑制作用。
[0062]
表4化合物5对llc细胞侵袭的影响
[0063]
化合物浓度(μm)侵袭细胞数，均值
±
sd个dmem-410
±
89rgds20152
±
46a化合物320387
±
76b化合物520372
±
117b[0064]
a)与dmem比p《0.01；b)与dmem比p》0.05；n＝9.
[0065]
实施例15评价化合物5抑制肿瘤肺转移的活性
[0066]
1)阳性对照为rgds四肽,腹腔注射剂量为20μmol/kg/天，连续给药10天；空白对照组为生理盐水,口服剂量为0.1ml/10g/天；化合物3的口服剂量为20μmol/kg/天；化合物5 的口服剂量为1μmol/kg/天，连续给药10天。
[0067]
2)lewis肺癌细胞(llc)购自atcc。选用含10％胎牛血清的dmem完全培养基对llc 传代培养,得到处于对数生长期的细胞。对细胞进行洗涤,消化,分散,计数后,使用pbs 将细胞浓度稀释成浓度为2
×
107个/ml的细胞悬液。将制备好的细胞悬液接种于c57bl/6n 雄性小鼠腋下,每只接种0.2ml。待荷瘤小鼠的实体瘤生长至直径为1.5cm-2cm时作为瘤源备用。
[0068]
3)使用乙醚将作为瘤源的荷瘤小鼠麻醉,迅速颈椎脱臼处死。利用组织匀浆器将实体瘤进行研磨成细胞悬液,过200目细胞筛网得到单细胞悬液。对单细胞悬液进行合并,洗涤和计数后用pbs缓冲液稀释成2
×
107个/ml的细胞悬液。将制备好的细胞悬液接种于 c57bl/6n雄性小鼠腋下,每只接种0.2ml。自接当天接种起,每天对荷瘤小鼠的实体瘤进行观察测量,待实体瘤生长至黄豆粒大小时给药,给药前按照完全随机的原则重新分组。每日给药前对小鼠体重进行监测并使用游标卡尺对肿瘤体积进行测量,根据体重给予相应剂量的化合物3或5,连续给药10天。于第11天用乙醚将小鼠麻醉,脱颈处死,用手术器械钝性剥离种植的肿瘤,快速秤量并对各组小鼠的肿瘤重量进行统计分析。结果表明, 生理盐水,rgds,化合物3和化合物5治疗的小鼠的种植的肿瘤的重量没有显著性差异 (此处省略数据)。可见rgds,化合物3和化合物5对原位肿瘤的生长没有抑制作用。用手术器械钝性剥离肺,快速拍照并计数转移瘤结。结果列入表5。从结果可以看出本发明化合物中化合物5能有效地抑制肿瘤向肺转移。
[0069]
表5化合物5抑制肿瘤肺转移活性
[0070]
化合物剂量(μmol/kg/天)肺转移瘤结数,均值
±
sd个生理盐水-37.2
±
14.0rgds209.4
±
2.0a化合物32035.0
±
12.0化合物519.0
±
5.7b[0071]
a)与生理盐水及化合物3比p《0.01；b)与生理盐水及化合物3比p《0.01,与rgds比 p》0.05；n＝10。