N基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法与流程

技术特征：
1.一种层析试纸，包括pvc底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫；沿着层析溶液的流动方向，样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上；样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构搭接连接；其特征在于，结合垫中包含：fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物，所述fam抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与fam抗体混合反应形成；所述dnp-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与dnp混合反应形成；所述检测垫包括硝酸纤维素膜，在检测垫上设置检测区：其经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成；在检测垫上设置对照区：其经由对dnp抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；dnp抗体由dnp多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。2.根据权利要求1所述的一种层析试纸，其特征在于，所述的显色颗粒均为红色乳胶微球。3.根据权利要求2所述的一种层析试纸，其特征在于，所述乳胶微球粒径为400nm。4.如权利要求1所述的一种层析试纸的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：s100，制作结合垫：制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与fam抗体混合反应形成fam抗体-显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与dnp混合反应形成dnp-显色颗粒复合物，将fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物加载到结合垫上；s200，制作检测垫：抗地高辛抗体和dnp抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区；s300，制备试纸大板：样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上形成试纸大板；其中，结合垫与检测垫两者部分重合，吸水垫与检测垫两者部分重合；s400，制备层析试纸，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。5.如权利要求4所述的一种层析试纸的制备方法，其特征在于，若有sars-cov-2病毒，其n基因在经过扩增体系后会产生扩增产物；扩增产物首先与样本垫结合，然后经过结合垫，其在经过结合垫时，扩增产物的fitc标签与fam抗体-显色颗粒复合物结合；再经过检测垫：经过检测区时，扩增产物的另一端digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区显色；经过对照区，溶液在经过结合垫时，必然会混入dnp-显色颗粒复合物，溶液在层析试纸流动的时候，经过对照区时，dnp-显色颗粒复合物会与dnp抗体结合，对照区显色。6.一种2019-cov-2病毒n基因检测引物及探针组，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列为：上游引物序列：ccaaactgtcactaagaaatctgctgctgag下游引物序列：[5
’‑
digoxin]-atcagttccttgtctgattagttcctggtcc探针序列：[5’fam]-ctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccac[thf]aaagcatacaatgta acac-[3’c3spacer]。
7.如权利要求6所述的一种2019-cov-2病毒n基因检测引物及探针组，其特征在于，所述引物、探针有四个修饰位点：在下游引物5’端标记digoxin；探针5’端标记fam；探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位点；探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团。8.如权利要求7所述的一种2019-cov-2病毒n基因检测引物及探针组，其特征在于，所述阻断基团采用c3-spacer修饰。9.一种检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求6所述的引物及探针组、权利要求1所述的层析试纸。10.一种非诊断目的2019-cov-2病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1,配置反应体系：s1,配置反应体系：其中，所述的引物及探针组为权利要求6所述的引物及探针组；s2，在s1中配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球，酶冻干微球包括：t4 uvsx重组酶、t4 uvsy蛋白、bsu dna聚合酶、逆转录酶、gp32蛋白、冻干骨架；其中，冻干骨架为蔗糖；
其中，t4 uvsx重组酶的含量浓度为100ng/μl；其中，t4 uvsy蛋白的含量浓度为50ng/μl；其中，bsu dna聚合酶的含量浓度为50ng/μl；其中，逆转录酶的含量浓度为50ng/μl；其中，gp32蛋白的含量浓度为300ng/μl。s3,扩增体系粘稠，配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中，扩增10min；s4，待扩增结束后，使用蒸馏水对扩增产物进行稀释，稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等；s5,产物稀释后，取80μl稀释产物滴加到如权利要求1所述的层析试纸条上，5-10min读取结果。

技术总结
本申请公开了一种N基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法；属于生物检测技术领域；所述检测SARS-CoV-2病毒N基因的引物探针组合特异性扩增并检测SARS-CoV-2病毒的N基因。本申请研发的引物探针可以保证快速、高效、特异性地对目的片段进行扩增，扩增时间仅需10min，最低检测拷贝数可达200 copies/ml；扩增产物检测形式为试纸条，肉眼鉴定，无需仪器辅助；且扩增过程无需变温和类似于PCR仪等复杂装置，只需要将反应温度控制在39-42℃即可。42℃即可。42℃即可。


技术研发人员：陈新利 魏爱琪 李美琼 傅明华 徐晓伟 聂晶
受保护的技术使用者：江苏迅睿生物技术有限公司
技术研发日：2022.09.27
技术公布日：2022/12/30