N基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法与流程

n基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法
技术领域
1.本技术涉及一种生物检测技术领域，更具体地说，尤其涉及n基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎(sars-cov-2)引起，新冠的全球传播对各个国家构成了多方面威胁。
3.n基因是新冠病毒核酸检测(sars-cov-2)的靶标基因之一，它是新型冠状病毒基因组中核壳蛋白基因。
4.申请人经过文献调研，发现了以下文献均是基于n基因提出了检测试剂盒：
5.文献1：cn111778356a。
6.文献2：cn114317822a。
7.文献3：cn114277048a。
8.文献4：cn111690772a。
9.文献5：us20220259680a1。
10.文献6：us20220195541a1。
11.文献7：us20220056542a1。
12.文献8：ep3986614a2。
13.文献9：ep3911769a1。
14.申请人在先申请“2022110650049”提出了一种核酸检测装置，其采用层析试纸条来实现核酸检测。所述核酸检测设备将扩增与检测试剂盒两种技术有机结合在一起。但是，上述技术结合在一起，对层析试纸条(即引物、探针)等提出了新的技术挑战：
15.第一，检测装置体型小、加热降温功率慢。因此，pcr扩增在恒温状态下，且温度在40
°
左右是适宜的。而现有技术的检测试剂盒中的扩增程序一般都是在高温状态下进行。
16.第二，现有技术如cn112458210a、cn111500776a等技术均提出了基于rpa技术的引物、探针。上述荧光rpa扩增的程序为：40℃、20min，间隔30s采集一次荧光，计40个循环。但是，上述引物、探针并不适用于“2022110650049”的方案，因为“2022110650049”采用的核酸检测装置没有荧光。
17.第三，现有技术如cn112981008a，在其实施例3公开了一种基于rpa技术的引物、探针，其也能配合层析试纸进行检测。
18.针对n基因的引物、探针、层析试纸也要与申请人研发的“一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒”均能够搭配在“2022110650049”研发的核酸检测装置。因此，两者的研发目标要相互协调。
19.即针对n基因的引物、探针、层析试纸，也需要满足下述研发目标：
20.1)检测时间要快：恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟。
21.2)初阳人员能够检测出来：灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/ml能够检测出来。
22.而通过上述检索分析，目前的现有技术还无法满足上述研发目标。


技术实现要素：

23.本技术的第一目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种n基因检测引物及探针组。
24.本技术的第二目的在于提供一种层析试纸条。
25.本技术的第三目的在于提供一种层析试纸条的制备方法。
26.本技术的第四目的在于提供一种检测试剂盒。
27.本技术的第五目的在于提供一种非诊断目的2019-cov-2病毒检测方法。
28.本技术的技术方案是：
29.一种层析试纸，包括pvc底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫；沿着层析溶液的流动方向，样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上；样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构搭接连接；
30.结合垫中包含：fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物，所述fam抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与fam抗体混合反应形成；所述dnp-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与dnp混合反应形成；
31.所述检测垫包括硝酸纤维素膜，在检测垫上设置检测区：其经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成；
32.在检测垫上设置对照区：其经由对dnp抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；dnp抗体由dnp多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
33.进一步，所述的显色颗粒均为红色乳胶微球。
34.进一步，所述乳胶微球粒径为400nm。
35.一种层析试纸的制备方法，其包括如下步骤：
36.s100，制作结合垫：
37.制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与fam抗体混合反应形成fam抗体-显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与dnp混合反应形成dnp-显色颗粒复合物，将fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物加载到结合垫上。
38.s200，制作检测垫：
39.抗地高辛抗体和dnp抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区。
40.s300，制备试纸大板：
41.样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上形成试纸大板；其中，结合垫与检测垫两者部分重合，吸水垫与检测垫两者部分重合。
42.s400，制备层析试纸，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。
43.进一步，若有sars-cov-2病毒，其n基因在经过扩增体系后会产生扩增产物；扩增产物首先与样本垫结合，然后经过结合垫，其在经过结合垫时，扩增产物的fitc标签与fam抗体-显色颗粒复合物结合；
44.再经过检测垫：经过检测区时，扩增产物的另一端digoxin标签会和检测区上的抗
地高辛抗体结合使检测区显色；
45.经过对照区，溶液在经过结合垫时，必然会混入dnp-显色颗粒复合物，溶液在层析试纸流动的时候，经过对照区时，dnp-显色颗粒复合物会与dnp抗体结合，对照区显色。
46.2019-cov-2病毒n基因检测引物及探针组，所述的引物的核苷酸序列为：
47.上游引物序列：ccaaa ctgtc actaag aaatc tgctg ctgag
48.下游引物序列：
49.[5
’‑
digoxin]-atcagttccttgtctgattagttcctggtcc
[0050]
探针序列：[5’fam]-ctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccac[thf]aaagcatacaatgtaacac-[3’c3spacer]。
[0051]
进一步，所述引物、探针有四个修饰位点：
[0052]
在下游引物5’端标记digoxin；
[0053]
探针5’端标记fam；
[0054]
探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位点；
[0055]
探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团。
[0056]
进一步，所述阻断基团采用c3-spacer修饰。
[0057]
一种检测试剂盒，其包括前述的引物及探针组、前述的层析试纸。
[0058]
一种非诊断目的2019-cov-2病毒检测方法，包括以下步骤：
[0059]
s1,配置反应体系：
[0060][0061]
所述的引物及探针组为前述的引物及探针组；
[0062]
s2，将s1中配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球，酶冻干微球主要成分如下：
[0063][0064]
s3,扩增体系粘稠，配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中，扩增10min；
[0065]
s4，待扩增结束后，使用蒸馏水对扩增产物进行稀释，稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等。
[0066]
s5,产物稀释后，取80μl稀释产物滴加到前述的层析试纸条上，5-10min读取结果。
[0067]
本技术的有益效果在于：
[0068]
第一，本技术的基础构思是设计一种引物、探针，扩增时间仅10min，提高了检测效率；扩增温度低，减少气溶胶产生和核酸污染，同时反应过程无需变温，扩增装置简易；检测产物匹配自制试纸条，无需复杂设备，且检测结果肉眼可鉴。
[0069]
第二，本技术经过灵敏性试验研究，表明：本技术的引物探针组合，最低检测限可低于200copies/ml。对于初阳、无症状人员而言，也能检测出来。
附图说明
[0070]
下面结合附图中的实施例对本技术作进一步的详细说明，但并不构成对本技术的任何限制。
[0071]
图1是本技术的层析试纸的设计图。
[0072]
图2是本技术的验证性试验的测试结果。
[0073]
图3是本技术的层析试纸灵敏度验证的测试结果。
[0074]
图4是本技术的特异性扩增试验的测试结果。
[0075]
附图标记：
[0076]
样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104、检测区201、对照区202。
具体实施方式
[0077]
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0078]
《研发要求》
[0079]
研发目标(1)：检测时间要快：恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟。
[0080]
研发目标(2)初阳人员能够检测出来：灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/ml能够检测出来。
[0081]
基于现有知识的分析，本技术的研发重点与难点在于：
[0082]
1)现有的引物、探针、层析试纸还无法满足前述的研发目标(1)。
[0083]
现有技术的恒温扩增，最好的效果就是：温度在40℃扩增20min。恒温扩增技术应用在n基因上，扩增时间缩短到10min，还没有成功经验。
[0084]
2)现有的引物、探针、层析试纸还无法满足前述的研发目标(2)。
[0085]
灵敏度是更具挑战的指标之一。研发团队经过测试：cn112981008a的灵敏度在1000copies/ml；上述设计仍然无法达到本技术的设计目标。
[0086]
而如：cn 112646929 a采用了rna恒温扩增 胶体金层析试纸方案，在其技术效果中认为：在同一管内能够同时扩增新型冠状病毒orf1ab基因、n基因和内参actb基因三种指标，且灵敏度还能达到rna拷贝的最低检测限为100拷贝/ml。
[0087]
本项目在初始设计时，对cn 112646929a的方案进行了大量重复试验，灵敏度事实上无法达到上述效果。事实上，其灵敏度在1000拷贝/ml以上。而从这一现有技术的测试结
果出发，研发团队一度对“恒温扩增 层析试纸”方案能够完成研发目标产生过动摇。
[0088]
《实施例一、研发方案》
[0089]
(1)根据n基因保守序列设计的引物、探针，其核苷酸序列如下：
[0090]
上游引物序列：ccaaa ctgtc actaag aaatc tgctg ctgag。
[0091]
下游引物序列：
[0092]
[5
’‑
digoxin]-atcagttccttgtctgattagttcctggtcc。
[0093]
探针序列：[5’fam]-ctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccac[thf]aaagcatacaatgtaacac-[3’c3spacer]。
[0094]
(2)适配的层析试纸
[0095]
硬件设计：如图1所示，一种层析试纸，包括pvc底板、样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104；沿着层析溶液的流动方向，样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104依次布置在pvc底板上；样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104相邻的两种结构的重合长度在1mm。
[0096]
核心设计：
[0097]
(2.1)结合垫102中包含：fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物，所述fam抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与fam抗体混合反应形成；所述dnp-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与dnp混合反应形成；所述的显色颗粒均为红色乳胶微球，所述乳胶微球粒径为400nm。
[0098]
(2.2)所述检测垫103包括硝酸纤维素膜。
[0099]
在检测垫上设置检测区201(即t线)；检测区201，其经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成(所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成)。
[0100]
在检测垫上设置对照区202(即c线)。对照区202，其经由对dnp抗体加载在硝酸纤维素膜上形成(dnp抗体由dnp多克隆抗体与磷酸缓冲液组成)。
[0101]
作为一种全新的层析试纸，其制备方法是：
[0102]
s100，制作结合垫：
[0103]
制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与fam抗体混合反应形成fam抗体-显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与dnp混合反应形成dnp-显色颗粒复合物，将fam抗体-显色颗粒复合物、dnp-显色颗粒复合物加载到结合垫上。
[0104]
s200，制作检测垫：
[0105]
抗地高辛抗体和dnp抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区(或称为质控区)。
[0106]
s300，制备试纸大板：
[0107]
样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在pvc底板上形成试纸大板；其中，结合垫与检测垫两者部分重合，吸水垫与检测垫两者部分重合。
[0108]
s400，制备层析试纸，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。
[0109]
层析试纸的作用机理为：
[0110]
若有sars-cov-2病毒，其n基因在经过扩增体系后会产生扩增产物；扩增产物首先与样本垫结合，然后经过结合垫，其在经过结合垫时，扩增产物的fitc标签(即fam)与fam抗体-显色颗粒复合物结合。
[0111]
再经过检测垫：经过检测区时，扩增产物的另一端digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使t线显色(t线显色的要求是：扩增产物的一端与要和fam抗体-显色颗粒复合物连接，另外一端与抗地高辛抗体结合)。
[0112]
经过对照区，溶液在经过结合垫时，必然会混入dnp-显色颗粒复合物，溶液在层析试纸流动的时候，经过对照区时，dnp-显色颗粒复合物会与dnp抗体结合，c线显色。其优点在于c线的显色不受模板浓度的影响，为独立的质控体系，若没采样独立质控体系，当模板浓度较高时，c线会不显色，判定试纸无效。
[0113]
因此，层析试纸会产生如下四种情况：
[0114]
t线显色、c线不显色，表示：无效。
[0115]
t线不显色、c线不显色，表示：无效。
[0116]
t线不显色、c线显色，表示:阴性。
[0117]
t线显色、c线显色，表示：阳性。
[0118]
《验证性试验》
[0119]
制备样本
[0120]
使用申请人自制的核酸提取试剂盒(磁珠法)对新冠n基因假病毒(拷贝数约2
×
108copies/ml)进行核酸提取，提取后n基因核酸分别稀释102、103、104、105、106、107倍后作为阳性模板p1、p2、p3、p4、p5、p6，用以验证引物探针扩增效果。
[0121]
检测体系
[0122]
对新冠n基因核酸进行恒温扩增体系配制，如下表(每组实验均设置1组复孔)：
[0123][0124]
检测程序
[0125]
1)将上述配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球。
[0126]
2)扩增体系粘稠，配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中，扩增10min。
[0127]
3)待扩增结束后，使用蒸馏水对扩增产物进行稀释，稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等。
[0128]
4)产物稀释后，取80μl稀释产物滴加到研发团队自研的微球法试纸条上，5-10min读取结果。
[0129]
如图2所示，为验证性实验一的测试结果。结果显示：该组引物、探针对n基因核酸
模板的扩增，最低检测限可低于200copies/ml，且未出现非特异性扩增。
[0130]
《层析试纸灵敏度验证》
[0131]
制备样本
[0132]
使用申请人自制的核酸提取试剂盒(磁珠法)对新冠n基因假病毒(拷贝数约2
×
108copies/ml)进行核酸提取，作为阳性模板。
[0133]
检测体系
[0134]
对新冠n基因核酸进行恒温扩增体系配制，如下表(阴性配制4组重复，阳性配制10组重复)。
[0135][0136][0137]
检测程序
[0138]
1)扩增体系粘稠，配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中，扩增10min。
[0139]
2)待扩增结束后，使用蒸馏水对扩增产物进行稀释20倍。
[0140]
3)产物稀释后，取80μl稀释产物滴加到本技术自制的微球法试纸条样品垫上，5-10min读取结果。
[0141]
如图3所示，为验证性实验二的测试结果。结果显示：该组引物、探针对n基因核酸模板的扩增，将200copies/ml的模板重复多次扩增进行检测，均可检出。
[0142]
《特异性扩增试验》
[0143]
模板：
[0144]
1)阴性模板n：dpec-h2o；
[0145]
2)阴性参考品盘模板：
[0146]
编号模板编号模板1阴性拭子样本8冠状病毒oc432乙型流感yamagata9冠状病毒229e3乙型流感victoria10冠状病毒hku14季节性h1n1流感病毒11冠状病毒nl635eb病毒12腺病毒3型
6肺炎支原体13副流感2型7肺炎衣原体14呼吸道合胞病毒
[0147]
3)阳性模板 ：n基因假病毒。
[0148]
检测体系
[0149]
检测体系除了模板类型外，其他同“验证性试验”的检测体系。
[0150][0151][0152]
检测程序
[0153]
检测程序同“验证性试验”的检测程序。
[0154]
以上模板使用本技术的引物探针组合物进行恒温扩增；从图4可知显示无非特异性扩增反应。
[0155]
以上所举实施例为本技术的较佳实施方式，仅用来方便说明本技术，并非对本技术作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本技术所提技术特征的范围内，利用本技术所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本技术的技术特征内容，均仍属于本技术技术特征的范围内。