TREM-2在制备多发性硬化症的治疗药物和/或诊断试剂中的应用的制作方法

trem-2在制备多发性硬化症的治疗药物和/或诊断试剂中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及trem-2在制备多发性硬化症的治疗药物或诊断试剂中的应用。


背景技术：

2.多发性硬化(multiple sclerosis，ms)是常见的神经系统自身免疫性疾病，全球约200万患者，是除创伤外青年人永久致残的最常见病因，又被称为轮椅上的癌症，为家庭和社会造成严重的经济和精神负担。
3.多发性硬化的发病机制主要是由自身免疫系统攻击髓鞘蛋白，从而导致神经传导受到阻滞。由于累及的神经不同可以展现出不同的临床症状。以往的研究者们认为疾病的分子机制包括外周的apc呈递抗原激活th细胞，而这些抗原与cns的部分分子具有相似性。此过程中th细胞分化为th1/17并分泌vla-4来获取穿透bbb的能力。进入cns后这种自身反应性t细胞被二次激活，产生特征性细胞因子，其激活邻近的免疫或神经细胞并将吸引b细胞等进入cns。浆细胞产生抗体攻击髓鞘蛋白。与此同时，抗炎细胞因子(例如il-10)和其他免疫调节机制如调节性t细胞(treg)或nk细胞起作用，机体发生炎症的消退。所以部分患者会经历疾病的复发缓解。根据发病机制，我们率先提出th亚型(th1、th17、th9、th2和treg等)的失衡是导致疾病发展和短暂缓解的基础。这一说法也得到了科学界的广范认可。虽然th亚型平衡的调控是治疗ms的有效靶点，但是临床上针对th细胞的治疗却远不如预期。
4.由于自反应性炎症性th细胞亚群在ms发病机制中发挥着至关重要的作用，因此大多数fda已批准的自身免疫性疾病治疗药物均靶向t细胞。一线药物包括倍泰龙ifn-β、格拉默(glatiramer acetate，ga)、富马酸二甲酯(dimethyl fumarate，dmf)和芬戈莫德(fingolimod)等。其中ifn-β和ga对进展性ms的延缓残疾进程中效果不大，效果与血清中il-22的水平相关。但是由于其长期疗效和安全性，它们是复发进展性多发性硬化(relapsing-remitting ms，rrms)最常见的一线治疗方法。dmf可以导致外周t细胞减少，导致炎症状态。芬戈莫德可促进t细胞在淋巴结内滞留，停药后复发率较高。曾获批的单克隆抗体包括那他珠单抗(natalizumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、达克珠单抗(daclizumab)和奥瑞珠单抗(ocrelizumab)。其中那他珠单抗靶向vlan-4(活化的t细胞和b细胞上高表达)，抑制vlan-4血管细胞粘附分子-1(vcam-1)的相互作用从而阻断t细胞对bbb的渗透。但停用后会导致炎症活动异常、ms复发和进展性脑白质病。阿伦单抗和达克珠单抗以cd52(t细胞和b细胞上高表达)为靶点，均可导致免疫反应。其中达克珠单抗因有导致肝炎和脑炎、脑膜脑炎等炎症性脑疾病高风险，已于2018年被撤销上市许可。奥瑞珠单抗是一种靶向cd20的人源化单抗，也被认为靶向b细胞，能有效地清除产生炎症细胞因子的高度激活的cd20 t细胞亚群，cd20 炎性t细胞的缺失可能是奥瑞珠单抗治疗效果的原因。但是该单抗会导致免疫缺陷副作用，如溃疡性结肠炎和脑白质病。虽然针对th细胞的药物疗效较好，但是由于未有针对性的对异常激活细胞定向调节和疏导等原因，导致耐药性差、复发明显和
副作用多等。因此急需开发针对异常激活致炎性th细胞的关键性调控靶点的治疗手段。
5.髓系细胞触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells，trem)家族作为模式识别受体，近些年来在肿瘤和感染治疗领域受到广范关注。该类分子在以往的研究中广范表达在髓系细胞，比如巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞中。其中有代表性的是trem-1和trem-2。这两个分子均可与dap12相结合行使各自功能。其中trem-1可扩增tlr信号通路和促进宿主炎症，而trem-2则可抑制细菌或真菌感染并诱导的促炎细胞因子的分泌。在神经退行性疾病中trem-2还可以促进小胶质细胞的激活，在炎症调节中发挥关键作用。据报道，各种分子可与trem-2结合，包括某些细胞表面分子、细菌或热休克蛋白，以及轴突损伤时暴露的脂质和死亡细胞释放的核酸。尽管有大量证据表明trem-2在先天免疫细胞中具有抗炎作用，但体内研究显示trem-2对感染性和炎性疾病的调节作用存在争议。一方面，trem-2微调了革兰氏阴性菌诱导的脓毒症小鼠模型的炎症反应。在化学试剂诱导的肝损伤模型中，trem-2缺乏的小鼠肝脏损伤和炎症加重。另一方面，trem-2缺乏可减轻炎症反应，限制伪氏伯克霍尔德菌感染引起的器官损伤和死亡。
6.目前，trem-2在cd4 t细胞上的作用机制尚未完全明确。已有文章表明trem-2可通过其特有的cd3ζ/zap70通路来促进th1细胞应答。说明trem-2可作为t细胞向促炎性th细胞转化的潜在调控靶点。
7.然而现阶段关于多发性硬化症中trem-2的表达变化和功能活动的研究甚少，尤其是trem-2对于疾病特异性的致病性t淋巴细胞的功能目前还没有相关报导研究。目前对于多发性硬化症的免疫治疗还存在很大的应用局限以及无效性。为了提高多发性硬化症的早期诊断和药物治疗效果，改善患者的生存状态，所以亟需寻找一种新的免疫调控分子来提高多发性硬化症的诊断率和免疫治疗疗效。


技术实现要素：

8.针对目前现有的多发性硬化症的诊疗方式早期诊断率低，长期治疗效果差，本发明提供了髓系细胞触发受体-2(triggering receptor expressed on myeloid cells，trem-2)表达在制备多发性硬化症的治疗药物和/或诊断试剂中的应用。
9.本发明通过以下技术方案实现上述目的：
10.本发明提供了trem-2作为靶点在制备多发性硬化症的诊断和/或预后试剂中的应用。
11.髓系细胞触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells，trem)2在以往的研究中广范表达在髓系细胞，比如巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞中。近些年来在肿瘤和感染治疗领域受到广范关注。
12.本发明研究发现，采用流式细胞术检测，trem-2在多发性硬化患者外周血cd4 淋巴细胞的表达明显高于健康对照。进一步采用实时荧光定量pcr技术检测促炎性因子ifn-γ、il-17、tnf-α和gm-csf的表达均伴随trem-2的表达增高而增多。提示trem-2与病情和体内免疫状态密切相关。因此，trem-2可以作为多发性硬化症的诊断和预后的标志物。
13.优选地，所述trem-2表达于cd4 t淋巴细胞表面。
14.优选地，所述试剂用于检测cd4 t淋巴细胞表面的term-2的表达水平。
15.优选的，所述试剂为能够与trem-2特异性结合的抗体。
16.优选的，所述抗体可以带有trem-2的单克隆抗体做为检测标记。
17.更优选的，所述抗体来自cd4 t细胞。
18.本发明还提供了上述以trem-2为靶点制备的用于多发性硬化症的诊断和/或预后试剂。
19.多发性硬化患者的cd4 t细胞中的trem-2表达丰度显著高于健康人。且病情和体内免疫状态密切相关。因此，检测cd4 t细胞中trem-2的表达诊断准确率高和灵敏度高，可以通过检测外周血中cd4 t细胞的trem-2的表达量，来诊断多发性硬化症，并且预测患者病情进展是否进展。
20.具体的，当作为诊断试剂时，诊断过程包括：利用与trem-2特异性结合的抗体检测受试者的血液样品(或者活检组织样品)中cd4 t细胞的trem-2的表达水平，并将其与参考水平进行比较，当trem-2的表达水平显著调高，诊断结果为阳性；当trem-2的表达水平没有显著变化，诊断结果为阴性，其中参考水平为健康人群外周血样品中所述trem-2的表达水平。
21.具体的，当作为预后试剂时，预后过程包括：利用与trem-2特异性结合的抗体检测受试者不同病程时期的血液样品(或者活检组织样品)中的trem-2的表达水平，并将其与参考水平进行比较，绘制不同病程时期trem-2的表达水平曲线，从而确定患者的动态进展，指导用药。
22.本发明还提供trem-2抗体在制备多发性硬化症的诊断和/或预后试剂中的应用。
23.优选的，所述抗体可以偶联或者带有检测标记。
24.本发明研究发现，采用mog
35-55
蛋白刺激条件下，trem-2促进cd4 细胞分泌细胞因子包括白介素-6(il-6)和白介素-17(il-17)。进一步敲除trem-2后，减少了cd4 t细胞分化及分泌以上2个细胞因子的水平。
25.因此，通过干预体内靶向髓系细胞触发受体2的表达，能够减轻多发性硬化症患者的过度炎症反应，从而可用于治疗多发性硬化症。
26.因此，本发明另一个目的在于提供了trem-2为靶点在制备治疗多发性硬化症的功能产品中的应用，所述功能产品具有抑制多发性硬化症进展的作用。
27.优选地，所述功能产品具有下调trem-2基因的表达、转录、或者其表达产物的功能。
28.优选地，所述功能产品包括：trem-2蛋白抑制剂、trem-2基因缺陷或者沉默的免疫相关细胞、其分化细胞或者基因重组构建体中的一种或者多种。
29.更优选地，所述功能产品包括：
30.(i)以trem-2转录本为靶序列，且能够抑制trem-2基因表达产物的表达或基因转录的激活型抗体、核苷酸、慢病毒或腺病毒；
31.(ii)含有trem-2竞争序列，且能够在转入体内后形成抑制trem-2基因表达产物的表达或基因转录的抑制分子的构建体；
32.(iii)抑制trem-2基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
33.因此，所述功能产品可以包括靶向trem-2的sirna、融合蛋白、特异性抗体、反义rna。
34.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
35.本发明通过研究发现trem-2在多发性硬化病人外周血cd4 t细胞中高表达，并且与疾病严重程度具有相关性。表明trem-2可以作为多发性硬化症得诊断和预后的标志物，该标志物可以来自于外周血，直接取血液样品进行检测相对于生化、凝血、血样饱和度多指标检测等复杂程序，减轻了患者的痛苦，并且创伤小，敏感性高。
36.本发明还研究了采用敲除trem-2对小鼠cd4 t细胞进行干预，发现敲除trem-2后明显降低细胞因子il-6和il-17的水平，提示干预trem-2的表达可以缓解甚至有望治疗多发性硬化症。
37.本发明提供的多发性硬化症诊断和预后的分子标志物，具有简便、快捷、创伤小、易复查等优点，应用前景广阔。
附图说明
38.图1为trem-2在健康体检者和多发性硬化患者外周血cd4 t细胞表面的表达水平图，其中***表示p＜0.001。
39.图2为trem-2敲除后诱导的疾病模型的临床评分、和临床表现图，其中，图2a为cfa对照组、wt-eae组和cd4
cre
trem-2
flox-eae组小鼠的临床评分；图2b为应用伊文思蓝法检测小鼠血脑屏障损伤情况展示图及统计图；图2c为wt-eae和cd4
cre
trem-2
flox-eae小鼠脑内炎性浸润图；图2d为脑和脊髓中th细胞浸润图；其中*表示p＜0.05；**表示p＜0.01；***表示p＜0.001。
40.图3为trem-2的比例与il-6和il-17相关性分析，其中，图3a为cfa和eae小鼠外周血中il-17的浓度；图3b为cfa和eae小鼠脾脏中il-6的表达情况；图3c为il-17的浓度与trem-2

cd4

t细胞比例的相关性；图3d为il-6的表达与trem-2

cd4

t细胞比例的相关性；其中***表示p＜0.001。
41.图4为trem-2敲除后，th1、th2和th17的比例图，其中，图4a为th1的比例统计；图4b为th2的比例统计；图4c为th17的比例统计；其中ns表示统计学差异p＞0.05；*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
42.图5为mog
35-55
蛋白刺激条件下，eae模型鼠的trem-2-/-‑
cd4

t细胞和wt-cd4

t细胞分泌il-6、il-17的水平图；其中，图5a为培养液中il-17的浓度统计图；图5b为培养液中il-6的浓度统计图；其中**表示p＜0.01。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
45.实施例1多发性硬化患者外周血cd4 t细胞表面的表达水平分析
46.(1)检测样本的收集：
47.实验组血液样本：活动期多发性硬化复发缓解型患者
48.对照组血液样本：无临床症状的体检受试者
49.(2)检测方法及步骤：
50.a.采集实验组和对照组外周血5ml，3000rpm离心5min，吸取上层血清；
51.b.用淋巴细胞分离液(tmb)分离淋巴细胞；
52.c.裂解红细胞制备单细胞悬液，将细胞调整至1
×
108个/ml，吸取50μl并加入trem-2抗体(r&d公司，货号fab1278p)和cd4抗体(biolegend公司)；
53.e.混匀4度避光孵育30分钟，用pbs清洗两遍后用流式细胞仪进行检测；
54.f.fsc和ssc门控下分析trem-2阳性细胞占cd4阳性细胞的比例。
55.结果分析：
56.如图1所示，在fsc和ssc门控下，trem-2在多发性硬化患者和健康体检者的外周血cd4细胞上均有表达，但患者组的表达量显著高于健康对照组，并且差异具有统计学意义。说明trem-2在多发性硬化患者外周血cd4上高表达。
57.实施例2trem-2敲除后诱导的疾病模型的临床评分和表现分析
58.(1)检测样品的收集：
59.选取建模的小鼠的脑和脊髓(每组6只进行临床评分的观测；3只进行解剖)。
60.(2)检测方法及步骤：
61.a.利用mog
35-5
5诱导多发性硬化动物模型的构建——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)。实施对象为c57bl/6wt或者trem-2f/f-cd4-cre小鼠；
62.b.根据eae临床评分准则观察监测小鼠状态并记录；
63.c.待wt-eae组小鼠临床评分达3分后，每组选取3只进行尾静脉注射伊文思蓝(evans blue，eb)。待注射6-8小时候通过放血休克致死；
64.d.心脏灌流后剥离中枢神经系统(大脑、小脑、脑干和脊髓)；
65.e.用甲酰胺溶液浸泡并收集上清；
66.f.设置eb标曲，620nm酶标仪计算肺组织总eb含量；
67.e.将大脑一半进行石蜡包埋和he染色，一半进行研磨；
68.g.研磨后的悬液应用percoll梯度离心，获取免疫细胞；
69.h.细胞进行cd45标记并进行流式检测。
70.结果分析：
71.如图2所示，cd4细胞上trem-2敲除小鼠的临床评分显著下降，中枢神经系统eb、炎性浸润和cd4

t细胞浸润度均减低。说明敲除cd4细胞上trem-2后会抑制eae的诱导，主要表现为临床症状的减轻和血脑屏障损伤程度降低。
72.实施例3trem-2

cd4

t细胞的比例与il-6和il-17的关联性分析
73.(1)检测样品的收集：
74.构建mog
35-55-eae模型，获取脑组组织。
75.(2)检测方法及步骤：
76.a.利用mog
35-55
诱导eae模型。实施对象为c57bl/6wt小鼠。同时设立阴性对照模型cfa；
77.b.待wt-eae组小鼠临床评分达3分后，通过放血休克致死；
78.c.取脾脏并研磨；
79.d.制备为单细胞悬液；
80.e.细胞进行cd45、cd4和trem-2标记并进行流式检测；
81.f.血液离心取血浆；
82.g.elisa法检测il-6和il-17浓度。
83.结果分析：
84.如图3所示，与cfa对照组相比，eae小鼠血液中il-6和il-17的浓度较高。eae脾脏中的trem-2

cd4细胞的比例有正相关。说明cd4细胞上trem-2的表达与th17相关性促炎性因子il-6和il-17具有一定关系。
85.实施例4trem-2敲除后th1、th2和th17的情况分析
86.(1)检测样品的收集：
87.构建mog
35-55-eae模型，获取脾脏组织。
88.(2)检测方法及步骤：
89.a.利用mog
35-55
诱导eae模型。实施对象为c57bl/6wt或者trem-2f/f-cd4-cre小鼠。同时设立阴性对照模型cfa；
90.b.待wt-eae组小鼠临床评分达3分后，通过放血休克致死；
91.c.剥离脾脏；
92.d.研磨后的破红细胞、过滤和离心，获取单细胞悬液；
93.e.取1
×
106个细胞进行cd4、il-17、il-4和ifn-γ标记进行流式检测。
94.结果分析：
95.如图4所示，在构建了eae模型后，th1和th17等促炎性细胞显著增多、th2抑炎性细胞相应减少。而cd4细胞上trem-2敲除小鼠在诱导eae模型后，则th17细胞回降。说明敲除cd4细胞上trem-2后会抑制促炎性cd4 t细胞——th17细胞的增多。
96.实施例5trem-2敲除后，mog
35-55
蛋白刺激条件下cd4 t细胞分泌il-6和il-17的表达水平分析
97.(1)检测样品的收集：
98.收集实验小鼠脾脏组织，包括对照小鼠、wt-eae建模小鼠和wt-eae建模小鼠各6只。
99.(2)检测方法，具体包括如下步骤：
100.a.利用mog
35-55
诱导eae模型。实施对象为c57bl/6wt或者trem-2f/f-cd4-cre小鼠。同时设立阴性对照模型cfa；
101.b.待wt-eae组小鼠临床评分达3分后，通过放血休克致死；
102.c.剥离脾脏；
103.d.研磨后的破红细胞、过滤和离心，获取单细胞悬液；
104.e.取1
×
106个细胞以1
×
106个/ml浓度进行培养。期间加入mog
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进行特异性刺激；
105.f.48h后收取上清进行elisa检测il-6和il-17的表达。
106.结果分析：
107.如图5所示，mog
35-55
特异性刺激下，脾脏细胞分泌更多的il-6和il-17。但是cd4上
敲除trem-2的小鼠的细胞则分泌水平显著降低。说明trem-2的敲除可以有效抑制促炎性因子：il-6和il-17的表达。