自组装的两亲性肽水凝胶的制作方法

自组装的两亲性肽水凝胶
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年8月10日提交的题为“自组装的两亲性肽水凝胶”的美国临时专利申请号63/063,743的优先权，其全部公开内容出于所有目的通过引用的方式整体并入本文。
3.关于联邦赞助的研究的声明
4.本发明是在国立卫生研究院(nih)授予的小企业创新研究(sbir)资助号1r44gm133305-01下的政府支持下进行的。政府对本发明拥有某些权利。
5.序列表
6.本技术包含序列表，所述序列表以ascii格式的电子方式提交，其全部内容通过引用的方式并入本文。所述ascii副本创建于2021年8月6日，名为g2093-7001wofsr_sl.txt，大小为9,674字节。
技术领域
7.本文公开的方面和实施方案涉及施用自组装肽的系统和方法。特别是，各方面和实施方案涉及两亲性肽制剂和施用两亲性肽制剂的方法。


背景技术：

8.组织工程涉及使用具有合适的生物化学和生理特性的材料来替代、修复和/或增强生物组织。所涉及的特定组织可能有一定的机械和结构要求，以实现正常的功能。需要易于调整以用于特定的靶组织并具有适合组织工程的生物化学和生理特性的材料。


技术实现要素：

9.根据一个方面，提供了一种制剂，其包括纯化的两亲性肽，所述两亲性肽包括折叠基团，所述折叠基团具有多个以基本交替的模式排列的带电荷的氨基酸残基和疏水性氨基酸残基以及转角序列。所述肽可以被配置为自组装成水凝胶，并具有-7至 11的净电荷。所述制剂可以包括水性生物相容性溶液。所述制剂可以是热稳定的。
10.根据另一个方面，提供了一种制剂，其包括0.5％w/v和6.0％w/v之间的纯化的两亲性肽，所述两亲性肽包括折叠基团，所述折叠基团具有多个以基本交替的模式排列的带电荷的氨基酸残基和疏水性氨基酸残基以及转角序列。所述肽可以被配置为自组装成水凝胶。所述制剂可以包括水性生物相容性溶液。所述制剂可以是热稳定的。
11.根据另一个方面，提供了一种制剂，其包括纯化的两亲性肽，所述两亲性肽包括折叠基团，所述折叠基团具有多个以基本交替的模式排列的带电荷的氨基酸残基和疏水性氨基酸残基以及转角序列。所述肽可以被配置为自组装成水凝胶。所述制剂可以包括有效量的反离子。所述制剂可以包括水性生物相容性溶液。所述制剂可以是热稳定的。
12.根据另一个方面，提供了一种水凝胶，其由包括纯化的两亲性肽的制剂形成，所述两亲性肽包括折叠基团转角序列，所述折叠基团转角序列具有多个以基本交替的模式排列
的带电荷的氨基酸残基和疏水性氨基酸残基以及转角序列。所述肽可以被配置为自组装成水凝胶。所述制剂可以包括水性生物相容性溶液。所述制剂可以包括缓冲液，其包括有效量的离子盐和生物缓冲剂以形成水凝胶。所述制剂可以是热稳定的。
13.所述制剂可以包括缓冲液，其被配置为导致肽的自组装以形成水凝胶。
14.在一些实施方案中，肽、生物相容性溶液和缓冲液中的任何一种或多种可以是单独提供的。
15.所述肽可以具有约10-200个氨基酸残基。
16.折叠基团可以具有约2-50个氨基酸残基。
17.疏水性氨基酸残基可以独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸及其组合。
18.在一些实施方案中，疏水性氨基酸残基可以是缬氨酸。
19.在一些实施方案中，所述制剂可以是无菌的。
20.带电荷的氨基酸残基可以是带正电荷的氨基酸残基。
21.带电荷的氨基酸残基可以独立地选自精氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸及其组合。
22.折叠基团可以具有2至10个带正电荷的氨基酸残基。
23.折叠基团可以具有6个带正电荷的氨基酸残基，其选自精氨酸和赖氨酸。
24.带电荷的氨基酸残基可以是带负电荷的氨基酸残基。
25.带电荷的氨基酸残基可以独立地选自天冬氨酸、谷氨酸及其组合。
26.在一些实施方案中，所述肽的n末端和c末端中的至少一个可以是被修饰的。
27.所述修饰可以是酰胺化。
28.在一些实施方案中，所述肽的n末端和c末端中的至少一个可以是游离的。
29.在一些实施方案中，折叠基团可以具有包括y[ay]n[t][ya]my的序列，其中a是1-3个选自碱性、中性、脂肪族、芳香族、极性和带电荷的氨基酸中的一种或多种的氨基酸，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-8个转角序列氨基酸，n和m各自独立地在2和10之间。
[0030]
在一些实施方案中，折叠基团可以具有包括y[xy]n[t][yx]my的序列，其中x是1-3个带电荷的氨基酸，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-8个转角序列氨基酸，n和m各自独立地在2和10之间。
[0031]
转角序列可以具有2-8个氨基酸残基，其独立地选自d-脯氨酸、l-脯氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和天冬酰胺。
[0032]
转角序列可以具有1-4个脯氨酸残基。
[0033]
在一些实施方案中，折叠基团可以具有包括(z)c(y)b(x)a-[(d)pp,(d)pg或ng]-(x)a(y)b(z)c的序列，其中转角序列是(d)pp、(d)pg或ng，(d)p是d-脯氨酸，x是带电荷的氨基酸，y是疏水性氨基酸，z是疏水性氨基酸或极性氨基酸，a、b和c各自独立地是1-10的整数。
[0034]
所述肽可以包括有效量的反离子。
[0035]
反离子可以包括乙酸盐、柠檬酸盐和氯化物反离子中的至少一种。
[0036]
反离子可以包括乙酸盐反离子。
[0037]
所述肽可以基本上不含氯化物反离子。
[0038]
生物相容性溶液可以基本上不含氯离子。
[0039]
所述肽可以是至少80％纯化的。例如，所述肽可以是至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9％纯化的。
[0040]
纯化的肽可以具有少于10重量％的残留有机溶剂。例如，纯化的肽可以具有少于8％、少于5％、少于2％、少于1％或少于0.1％的残留有机溶剂。
[0041]
纯化的肽可以具有小于约1％w/v的残留三氟乙酸(tfa)浓度。
[0042]
纯化的肽可以具有小于约410ppm的残留乙腈浓度。
[0043]
纯化的肽可以具有小于约880ppm的残留n,n-二甲基甲酰胺浓度。
[0044]
纯化的肽可以具有小于约5000ppm的残留三乙胺浓度。
[0045]
纯化的肽可以具有小于约1000ppm的残留乙醚浓度。
[0046]
纯化的肽可以具有小于约100ppm的残留异丙醇浓度。
[0047]
纯化的肽可以具有小于约0.1％w/v的残留乙酸浓度。
[0048]
纯化的肽可以是冻干的。
[0049]
所述肽可以被配置为响应于温度变化、ph变化、暴露于光、施加声波和失效期中的至少一种而自组装成具有预先确定的二级结构的水凝胶。
[0050]
所述肽可以具有-7至 11的净电荷。
[0051]
所述肽可以具有 2至 11的净电荷。
[0052]
所述肽可以具有 5至 9的净电荷。
[0053]
所述肽可以具有70％w/v和99.9％w/v之间的氮。
[0054]
所述肽可以具有小于约10eu/mg的细菌内毒素水平。
[0055]
所述肽可以具有约1％w/v和约15％w/v之间的水含量。
[0056]
所述制剂可以包括0.1％w/v和8.0％w/v之间的肽。
[0057]
所述制剂可以包括0.5％w/v和6.0％w/v之间的肽。
[0058]
所述制剂可以包括0.5％w/v和3.0％w/v之间的肽。
[0059]
所述制剂可以包括0.5％w/v和1.5％w/v之间的肽。
[0060]
所述制剂可以包括0.5％w/v和1.0％w/v之间的肽。
[0061]
所述制剂可以包括0.7％w/v和2.0％w/v之间的肽。
[0062]
所述制剂可以包括0.7％w/v和0.8％w/v之间的肽。
[0063]
所述水凝胶可以包括0.25％w/v和6.0％w/v之间的肽。
[0064]
所述水凝胶可以包括1.5％w/v和6.0％w/v之间的肽。
[0065]
所述水凝胶可以包括0.25％w/v和3.0％w/v之间的肽。
[0066]
所述肽可以被配置为自组装成具有90％w/v和99.9％w/v之间的水溶液的水凝胶。
[0067]
所述制剂可以包括缓冲液，所述缓冲液包括有效量的离子盐和生物缓冲剂以形成水凝胶。
[0068]
缓冲液可以进一步包括水、酸、碱和矿物质中的至少一种。
[0069]
缓冲液可以具有基本生理性的ph。
[0070]
缓冲液可以是酸性的。
[0071]
缓冲液可以是碱性的。
[0072]
缓冲液可以是基本中性的。
[0073]
在一些实施方案中，可以选择缓冲液的量和组成来控制水凝胶的ph，以保持靶部
位的基本生理性的ph。
[0074]
缓冲液可以包括约5mm至约200mm的离子盐。
[0075]
离子盐可以解离成钠、钾、钙、镁、铁、铵、吡啶(pyridium)、季铵、氯、柠檬酸、乙酸和硫酸离子中的至少一种。
[0076]
离子盐可以包括氯化钠、氯化铵、氯化镁、氯化钾、氯化钙、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、碳酸氢钠中的至少一种及其组合。
[0077]
缓冲液可以包括约10mm至约150mm的氯化钠。
[0078]
缓冲液可以包括有效控制水凝胶硬度的离子盐的量。
[0079]
缓冲液可以包括约1mm至约150mm的生物缓冲剂。
[0080]
生物缓冲剂可以选自双三丙烷(btp)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、dulbecco改良eagle培养基(dmem)、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、2-(n-吗啉)乙磺酸半钠盐、4-吗啉乙磺酸半钠盐(mes)、3-(n-吗啉)丙磺酸(mops)和3-(n-吗啉)丙磺酸(mobs)、tricine、bicine、(三(羟甲基)甲胺基)丙磺酸(taps)、n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(aces)、β-羟基-4-吗啉丙磺酸、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(mopso)、(n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)(bes)及其组合。
[0081]
缓冲液可以包括约10mm至约100mm的btp。
[0082]
所述肽可以被配置为自组装成具有4.0和9.0之间的ph水平的水凝胶。
[0083]
所述肽可以被配置为自组装成具有7.0和8.0之间的ph水平的水凝胶。
[0084]
所述肽可以被配置为自组装成基本透明的水凝胶。
[0085]
所述基本透明的水凝胶可以通过宏观和微观光学成像确定为基本上没有可见的浊度。
[0086]
如静态光散射(sls)和uv-vis测试所示，所述基本透明的水凝胶可以基本上没有可见的肽聚集体。
[0087]
所述基本透明的水凝胶在约205nm至约300nm的波长下可以具有约0.1至3.0
±
1.5的uv-vis光吸光度。
[0088]
所述制剂可以进一步包括生物相容性染料。
[0089]
所述肽可以被配置为自组装成具有纳米多孔结构的水凝胶。
[0090]
所述纳米多孔结构可以具有1nm至1000nm的平均孔径和1nm至100nm的原纤维宽度。
[0091]
所述纳米多孔结构可以被选择为对靶标微生物不可渗透。
[0092]
所述纳米多孔结构可以被选择为允许气体交换。
[0093]
所述肽可以被配置为自组装成阳离子水凝胶。
[0094]
所述肽可以被配置为自组装成剪切稀化的水凝胶。
[0095]
所述肽可以被配置为响应于施加的机械力而可逆地分解。
[0096]
所述肽可以被配置为响应于温度变化、ph变化、与离子螯合剂接触、用溶剂稀释、施加声波、冻干和空气干燥中的至少一种而可逆地分解。
[0097]
所述肽可以被配置为自组装成基本可喷雾和/或可注射的水凝胶。
[0098]
所述肽可以被配置为自组装成具有如通过流变学测试所确定的约2pa至约3500pa的剪切模量的水凝胶。
[0099]
所述肽可以被配置为自组装成基本离子交联的水凝胶。
[0100]
可以选择疏水性氨基酸残基来将肽自组装成具有预先确定的二级结构的聚合物。
[0101]
所述预先确定的二级结构可以包括预选自β-折叠、α-螺旋和无规卷曲中的至少一种的结构。
[0102]
预选的结构可以包括β-发夹。
[0103]
可以选择疏水性氨基酸残基来将肽自组装成具有大部分β-折叠结构的聚合物。
[0104]
在一些实施方案中，可以选择疏水性氨基酸残基的数量和类型来控制水凝胶的硬度。
[0105]
在一些实施方案中，折叠基团可以被配置为采用β-发夹二级结构。
[0106]
在一些实施方案中，折叠基团可以被配置为采用纳米多孔水凝胶三级结构。
[0107]
所述肽可以被配置为自组装成具有抗微生物特性、抗病毒和/或抗真菌特性的水凝胶。
[0108]
所述肽可以被配置为自组装成基本生物相容的水凝胶。
[0109]
所述肽可以被配置为自组装成细胞友好型水凝胶。
[0110]
所述肽可以被配置为自组装成基本可生物降解的、非炎症的和/或无毒的水凝胶。
[0111]
所述肽可以包括官能团。
[0112]
所述官能团可以具有3至30个氨基酸残基。
[0113]
所述官能团可以被工程化为表达生物活性特性。
[0114]
所述官能团可以被工程化为控制或改变肽或制剂的电荷。
[0115]
所述官能团可以被工程化为控制或改变肽或制剂的ph。
[0116]
所述官能团可以被工程化用于靶标指示。
[0117]
所述靶标指示可以选自细胞培养、细胞递送、伤口愈合、生物膜处理及其组合。
[0118]
所述官能团可以具有选自rgd、ikvav、yigsr、lkktetq、snkpgvl、pkpqqffglm、gkltwqelyqlkykgi和ggg的序列。
[0119]
所述肽可以包括选自接头和间隔区的修饰。
[0120]
所述制剂可以被配制用于局部、肠内或肠外施用。
[0121]
所述制剂可以被配制成通过喷雾器、气雾剂、滴管、管、安瓿、薄膜、灌注、注射或注射器施用。
[0122]
所述制剂可以被配制用于全身性施用。
[0123]
所述制剂可以被配制用于治疗微生物污染或消除或抑制靶标微生物的增殖。
[0124]
所述靶标微生物可以是病原微生物。
[0125]
所述制剂可以被配制用于管理微生物生物负荷。
[0126]
所述制剂可以被配制用于治疗真菌污染。
[0127]
所述制剂可以被配制用于治疗病毒污染。
[0128]
所述制剂可以被配制用于治疗细菌污染。
[0129]
所述制剂可以被配制用于细胞培养和/或细胞递送。
[0130]
所述制剂可以被配制用于组织培养和/或组织递送。
[0131]
所述制剂可以被配制用于治疗受感染的伤口和/或处理或抑制生物膜。
[0132]
所述制剂可以被配制用于伤口和/或生物膜管理。
[0133]
所述制剂可以被配制用于伤口或组织的水分管理和/或渗出物管理。
[0134]
所述制剂可以被配制成薄膜、屏障敷料、清创剂和/或止血剂。
[0135]
所述制剂可以进一步包括活性剂，例如，以下中的至少一种：抗细菌组合物、抗真菌组合物、抗病毒组合物、抗肿瘤组合物、抗臭组合物、止血剂、抗炎组合物、细胞培养基、细胞培养血清以及镇痛剂、局部麻醉剂或止痛组合物。
[0136]
所述制剂可以进一步包括有效量的矿物粘土。
[0137]
所述制剂可以包括约0.1％w/v至约20％w/v的矿物粘土。
[0138]
矿物粘土可以包括锂藻土(laponite)和蒙脱石中的至少一种。
[0139]
所述制剂可以在-20℃至150℃是热稳定的。
[0140]
所述制剂可以通过终端和/或高压灭菌器进行灭菌。
[0141]
所述制剂在室温下可以具有至少约1-5年的保质期。
[0142]
所述制剂可以在2℃至125℃是热稳定的。
[0143]
所述制剂可以被超声处理。
[0144]
所述制剂在高达约25psi的压力下可以是稳定的，例如，物理稳定、化学稳定和/或生物稳定。
[0145]
所述肽能够在2℃和40℃之间的温度下自组装。
[0146]
所述肽可以在大于40℃的温度下基本上不组装。
[0147]
所述肽可以被配置为在少于约60分钟内自组装。
[0148]
所述肽可以被配置为在少于约30分钟内自组装。
[0149]
所述肽可以被配置为在少于约15分钟内自组装。
[0150]
所述肽可以被配置为在少于约10分钟内自组装。
[0151]
所述肽可以被配置为在少于约5分钟内自组装。
[0152]
所述肽可以被配置为在少于约2分钟内自组装。
[0153]
所述肽可以被配置为在少于约60秒内自组装。
[0154]
所述肽可以被配置为在少于约30秒内自组装。
[0155]
所述肽可以被配置为在少于约10秒内自组装。
[0156]
所述肽可以被配置为在少于约3秒内自组装。
[0157]
所述肽可以被配置为在少于约1秒内自组装。
[0158]
所述肽可以被配置为在少于约30秒内开始自组装。
[0159]
所述肽可以被配置为在少于约10秒内开始自组装。
[0160]
所述肽可以被配置为在少于约3秒内开始自组装。
[0161]
所述肽可以被溶解在生物相容性溶液中。
[0162]
生物相容性溶液可以是水溶液。生物相容性溶液可以包括去离子水、医药用水或注射用水。生物相容性溶液可以基本上由去离子水、医药用水或注射用水组成。
[0163]
所述制剂可以基本上不含防腐剂。
[0164]
根据另一个方面，提供了一种治疗受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的制剂。
[0165]
根据另一个方面，提供了一种生产肽制剂的方法，其包括将前述权利要求中任一项的肽和生物相容性溶液组合。
[0166]
根据另一个方面，提供了一种生产自组装的肽水凝胶的方法，其包括将前述权利要求中任一项的肽、生物相容性溶液和缓冲液组合。
[0167]
根据又一个方面，提供了一种试剂盒，其包括制剂、配置为导致肽自组装成水凝胶的缓冲液以及在向受试者施用制剂之前或同时将制剂和缓冲液组合的说明。
[0168]
缓冲液可以包括有效量的离子盐和生物缓冲剂以形成水凝胶。
[0169]
所述试剂盒可以进一步包括递送装置。
[0170]
所述递送装置可以是注射器、滴管、薄膜或喷雾器。
[0171]
所述试剂盒可以进一步包括混合装置。
[0172]
所述混合装置可以是多室装置。
[0173]
所述混合装置可以是双室装置。
[0174]
所述混合装置可以是静态混合装置。
[0175]
所述试剂盒可以进一步包括将混合装置中的缓冲液与制剂组合以形成水凝胶的说明。
[0176]
所述试剂盒可以进一步包括以下中的至少一种：抗细菌制剂、抗真菌制剂、抗病毒制剂、止血剂制剂、抗肿瘤制剂、抗炎制剂、细胞培养基、细胞培养血清、除臭制剂以及镇痛、局部麻醉或止痛制剂。
[0177]
所述试剂盒可以进一步包括局部敷料。
[0178]
所述试剂盒可以进一步包括在室温下储存所述试剂盒的说明。
[0179]
所述试剂盒可以进一步包括包装后约1-5年的失效指示。
[0180]
所述试剂盒可以进一步包括温度控制装置、ph控制添加剂、离子螯合剂组合物、溶剂、声音控制装置、冻干装置和空气干燥装置中的至少一种。
[0181]
本公开考虑了上述方面和/或实施方案中的任何一个或多个的所有组合，以及与具体实施方式和任何实施例中列出的实施方案中的任何一个或多个的组合。
附图说明
[0182]
附图不打算按比例绘制。在附图中，各图中说明的每个相同或几乎相同的部件都用一个类似的数字表示。为了清楚起见，并非每个部件都在每张图中标注。在附图中：
[0183]
图1a包括根据一个实施方案的具有封装细胞的组装的肽水凝胶基质与胶原蛋白相比的示意图和显微图像；
[0184]
图1b包括根据一个实施方案的混合装置的示意图和水凝胶基质中细胞的示意图；
[0185]
图2包括根据一个实施方案的所施用的肽水凝胶的持续治疗活性与传统聚合物相比的图；
[0186]
图3是根据一个实施方案的带正电荷的肽水凝胶的显微图像；
[0187]
图4是显示根据一个实施方案的肽水凝胶的抗微生物活性的图表；
[0188]
图5包括小鼠模型烧伤后细菌感染的图像，显示了根据一个实施方案的肽水凝胶的抗微生物活性；
[0189]
图6包括根据一个实施方案的移植在肽水凝胶上的细胞的显微图像；
[0190]
图7a是根据一些实施方案的示例性肽在266nm处的静态光散射(sls)作为温度的函数的图表；
[0191]
图7b是根据一些实施方案的示例性肽在266nm处的静态光散射(sls)作为温度的函数的图表；
[0192]
图8包括显示根据一个实施方案的肽水凝胶的吸光度作为肽浓度的函数的图表；
[0193]
图9是显示根据一个实施方案的肽制剂的净电荷作为ph值的函数的图表；
[0194]
图10是根据一个实施方案，在ph为7.4时，几个氨基酸残基的肽净电荷的直观表示；
[0195]
图11是根据一个实施方案，用肽制剂治疗后mrsa的微生物增殖的图表；
[0196]
图12是根据一个实施方案的制剂的储存模量和损失模量的图表；
[0197]
图13a是显示根据一个实施方案，应用所述制剂后铜绿假单胞菌的生长的图表；
[0198]
图13b是显示根据一个实施方案，应用所述制剂后mrsa的生长的图表；
[0199]
图14a是根据一个实施方案，所述制剂的储存模量和损失模量的图表；
[0200]
图14b是根据一个实施方案，所述制剂的储存模量和损失模量的图表；
[0201]
图15是根据一个实施方案的制剂的抗微生物活性的图表；
[0202]
图16a是根据一个实施方案的制剂的uplc的图表；
[0203]
图16b是根据一个实施方案的制剂的uplc的图表；
[0204]
图17是根据一个实施方案的制剂的抗微生物活性的图表；
[0205]
图18是根据一个实施方案的制剂的细胞活力的图表；
[0206]
图19是根据一个实施方案的制剂的流变学数据的图表；
[0207]
图20a是根据一个实施方案的锂藻土制剂的流变学数据的图表；
[0208]
图20b是根据一个实施方案的制剂的流变学数据的图表；
[0209]
图21包括根据一个实施方案的锂藻土制剂的流变学数据的图表和肽制剂的流变学数据的图表；
[0210]
图22是根据一个实施方案，通过鼻腔喷雾器施用制剂的图像；
[0211]
图23是根据一个实施方案，通过雾化施用所述制剂之后的细菌菌落的图像；
[0212]
图24是根据一个实施方案的制剂的抗微生物活性的图表；
[0213]
图25包括根据一个实施方案，通过雾化施用所述制剂之前和之后的细菌菌落图像；以及
[0214]
图26是根据一个实施方案，在最终使用的容器中提供的制剂的照片。
具体实施方式
[0215]
本文公开了包含自组装的肽水凝胶的制剂。自组装的肽可以是两亲性的。所述肽通常可以具有折叠基团，所述折叠基团具有多个以基本交替的模式排列的带电荷的氨基酸残基和疏水性残基。所述肽可以包括官能团，以在施用时提供所需的物理或化学特性。纯化的肽可以包括反离子，以提高制剂的生物相容性。反离子可以控制肽的自组装、物理和化学特性。反离子可以提高肽的治疗功能特性。所述制剂可以包括水性生物相容性溶液中的肽。所述制剂可以包括能够导致肽接触后自组装的缓冲溶液。缓冲溶液可以包含缓冲剂和离子盐。缓冲溶液组合物可以被设计用来控制组装的水凝胶的物理或化学特性。所述制剂可以被设计成是热稳定的。
[0216]
通常，所述制剂可以具有剪切稀化的特性和基本生理性的ph水平。自组装水凝胶
可以具有抗微生物、抗病毒和/或抗真菌特性。所述制剂可以局部或肠外施用。所述制剂可用于组织工程应用。某些示例性应用包括细胞递送、细胞培养、治疗和预防真菌感染、治疗和预防细菌感染、伤口愈合、生物膜处理、生物膜管理以及预防生物膜和伤口感染，包括慢性伤口的感染。其他组织工程应用也在本公开的范围内。
[0217]
本文公开了向受试者施用所述制剂的方法。这些方法通常可以包括选择施用的靶部位并将所述制剂施用于靶部位。施用所述制剂的方法还可以包括将所述制剂与缓冲液混合，所述缓冲液被配置为导致肽的自组装以形成水凝胶，并将水凝胶施用于靶部位。在某些示例性的实施方案中，所述制剂和/或水凝胶可以通过喷雾器、气雾剂、滴管、管、安瓿、灌注、注射或注射器施用。
[0218]
在某些实施方案中，本文公开了向受试者施用细胞的方法。这些方法通常可以包括将细胞悬浮在包含自组装肽的溶液中，并将有效量的悬浮液施用于受试者的靶部位。这些方法可以包括将所述溶液与缓冲液组合，所述缓冲液被配置为导致肽的自组装。所述溶液可以在施用前、与施用同时或在施用后与缓冲液组合。缓冲液通常包括有效量的离子盐和生物缓冲剂。
[0219]
与水溶液中的其他肽不同，本文公开的肽会进行自组装。自组装可以使所述肽以集中或局部的方式施用于靶组织。例如，与自由漂浮的肽相比，自组装肽可以以更高的浓度施用。由于施用时的局部效应，自组装肽可以表现出减少肽的部位外毒性的临床益处。此外，在靶标施用部位附近，肽的治疗剂量可能会增加。
[0220]
与水溶液中的其他聚合物不同，本文公开的肽可以在靶部位进行原位自组装。原位自组装可以使所述肽被施用于靶组织，并允许物理或离子交联，例如，在施用后几秒内。例如，自组装肽可以直接施用于靶部位。传统的自由漂浮的肽或聚合物通常需要交联剂或外源添加的共价交联剂。因此，本文公开的自组装肽可以提供减少产物应用和复杂性的临床益处。此外，自组装时肽的离子交联可以提供在产物去除和永久粘附于靶标施用部位之间选择的益处。
[0221]
选择定义
[0222]
水凝胶是一类很有希望用于软组织和骨工程的材料。水凝胶的一般特性使其成为这些应用的重要材料，它们具有良好的水化、多孔结构。水凝胶可以被设计成与各种类型的细胞(如成纤维细胞和成骨细胞)的粘附和增殖相容，使它们成为潜在的组织工程支架，用于生成结缔组织，如软骨、肌腱和韧带以及骨。
[0223]
水凝胶材料可以具有细胞相容性。本文定义的细胞相容性是指水凝胶在体外和/或体内不得对所需的细胞产生不利影响。对细胞的不利性可以通过细胞毒性、细胞粘附、增殖、表型维持和/或祖细胞的分化来衡量。
[0224]
水凝胶材料可以具有生物相容性。本文定义的“生物相容性”是指一种材料如果放在体内不会引起明显的免疫和/或炎症反应。生物相容性可以根据国际标准化组织(iso)10993标准来衡量。
[0225]
水凝胶材料可以是可生物降解的、提供无毒的种类。水凝胶材料可以通过蛋白水解被生物降解。本文定义的“蛋白水解”生物降解是指材料在细胞衍生的蛋白酶存在下的局部降解和/或随着细胞的增殖而逐渐降解。水凝胶材料可以是可通过水解生物降解的。本文定义的“水解”生物降解是指在生物条件下没有酶的帮助的聚合物降解。
[0226]
水凝胶材料可以是生物可吸收的。本文定义的生物可吸收是指水凝胶材料分解成残留物，所述残留物是容易被身体吸收的天然产物，从而完全失去原来的质量。
[0227]
水凝胶材料可以是剪切稀化的。如本文所述，“剪切稀化”是指可变的表观粘度，特别是随着施加的压力的增加，粘度下降。例如，剪切稀化的水凝胶可以表现出非牛顿流体特性。特别是，本文公开的水凝胶可以通过针头或导管施用，并在去除机械力后迅速恢复凝胶化。
[0228]
本文公开的水凝胶和/或其他材料可以被称为具有一种或多种生理特性。如本文所公开的，生理特性或值是指那些与受试者相容的特性。特别是，生理特性或值可以指那些与特定靶组织相容的特性。在某些实施方案中，生理特性或值可以指那些与靶组织的特性或值基本相似的特性或值。生理特性可以包括ph值、温度、净电荷、水含量、硬度和其他中的一种或多种。
[0229]“自组装”肽包括这样的肽，其通常在暴露于刺激之后，会呈现出所需的二级结构。所述肽可以自组装成高阶结构，例如三维网络，从而形成水凝胶。自组装水凝胶可以通过电荷屏蔽、疏水和二硫化物相互作用而包含三级和/或四级结构的肽。已经观察到所述肽自组装成螺旋带、纳米纤维、纳米管和囊泡、表面组装结构和其他。自组装肽可以响应于某些环境条件，例如ph、温度、净电荷、暴露于光、施加声波，或在存在或不存在环境因素的情况下进行组装。这些环境条件可以在向受试者施用时存在，或与缓冲液组合。在其他实施方案中，所述肽可以在中性ph水平下自发地在溶液中组装。所述肽可以在生理条件下和/或在阳离子和/或阴离子的存在下自发地在溶液中组装。
[0230]
所述自组装肽可以组装成α螺旋、π螺旋、β折叠、无规卷曲、转角、β褶状平行、反平行、扭曲、隆起或链状连接二级结构及其组合。例如，自组装成β-链的20个氨基酸的肽可以包括交替的缬氨酸和赖氨酸残基，侧面是四肽序列(-vdppt-)。当溶解在低离子强度和缓冲水溶液中时，由于带正电荷的赖氨酸残基的静电排斥作用，示例性的肽驻留在无规卷曲构象异构体的集合中。当增加溶液的离子强度和/或ph时，基于赖氨酸的正电荷会因电荷的屏蔽或足够数量的侧链胺的去质子化而得到缓解。这种示例性的作用使肽折叠成两亲性的β-发夹。在折叠状态下，示例性的肽通过发夹的侧面和正面结合进行自组装，形成非共价交联的富含β-折叠的原纤维素的水凝胶。因此，自组装肽可以被设计成通过合理设计肽的序列，在不同的条件下进行水凝胶化。
[0231]
本文公开的自组装肽可以组装成纳米多孔三级结构。如本文所公开的，纳米多孔结构是含有平均尺寸为1-1000nm的孔隙的三维基质。孔隙或空隙按体积可占三维基质的10％至90％。例如，孔隙或空隙按体积可占三维基质的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。孔隙可以是可透过的，允许液体和/或气体的扩散。纳米多孔结构是由物理交联构成的，允许离子键在声称的压力下被打破和重新形成。这些纳米多孔结构可以使细胞在基质中粘附和/或迁移。纳米多孔结构也可以模拟组织的内源性细胞外基质环境，并且任选地可以被选择为模拟特定的组织。
[0232]
肽的“分解”可以指肽在暴露于刺激后呈现低阶结构的能力。分解也可以指物理交联的肽在暴露于刺激后暂时打破疏水键和二硫键以呈现低阶结构的能力。例如，三级结构蛋白质可以分解成二级结构蛋白质，并进一步分解成一级结构肽。根据某些实施方案，肽的自组装和分解可以是可逆的。
[0233]
本文公开的制剂和配方通常可称为肽制剂。肽制剂可以包括本文公开的自组装肽和/或自组装水凝胶。肽制剂可以包括细胞相容性和/或生物相容性溶液。所述制剂可以包括缓冲液。虽然提到了溶液，但应理解，所述制剂可以是液体、凝胶或固体颗粒的形式。在某些实施方案中，例如，所述制剂可以是组装的水凝胶的形式。在其他实施方案中，所述制剂可以是冻干粉末的形式。
[0234]
肽制剂可以进一步包括一种或多种用于组织工程的生物活性组分，例如，功能化肽、细胞、培养基、血清、胶原蛋白和其他赋予结构的组分、抗体和抗原、生物活性小分子和其他生物活性药物。如本文所述，“生物活性”是指化合物赋予生物效应的能力。
[0235]
本文公开的含有细胞的制剂和配方可称为细胞悬浮液。细胞悬浮液包括悬浮在溶液中的多个细胞，例如活细胞。溶液可以是或包括水、介质或缓冲液。悬浮液通常可以进一步包括自组装肽和/或自组装水凝胶，如本文所公开的。虽然提到了细胞，但应理解，除了细胞之外或代替细胞，悬浮液可以包含细胞碎片和/或组织，例如组织移植物。例如，悬浮液可以包含活的或死的细胞或细胞碎片、球状体和/或细胞聚集体。
[0236]
细胞可以从活组织中分离出来，随后在细胞培养中维持和/或生长。细胞培养条件可以不同，但通常包括将细胞维持在合适的容器中，所述容器中的基质或培养基可以提供必要的营养物质，如氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质、生长因子、激素和气体，如二氧化碳和氧气，并调节生理化学环境，如ph、渗透压、温度。细胞可以保持在活细胞系中，例如，从单个细胞传代并含有相同的基因构成的hela细胞群。
[0237]
如本文所用，术语“分离的”是指从其原始或原生环境(例如，如果是天然存在的，则是自然环境)中取出的材料。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但在人类的干预下从自然系统中的一些或全部共存材料中分离出来的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是它在自然界中发现的环境的一部分。
[0238]
如本文所用，损伤、病况或疾病的“治疗”是指与类似但未经治疗的受试者相比，减少所述损伤、病况或疾病的至少一种症状的严重程度或频率。治疗也可以指与类似但未经治疗的受试者相比，停止、减缓或逆转损伤、病况或疾病的进展。治疗可以包括解决损伤、病况或疾病的根本原因和/或一个或多个症状。损伤、病况或疾病的“管理”可以指将所述损伤、病况或疾病的至少一种症状的严重程度或频率降低到可容忍的水平，这由受试者或保健提供者确定。
[0239]
如本文所用，有效量是指足以实现所需结果的剂量。例如，有效量可以指足以实现水凝胶的自组装和/或提供所需特性的浓度。有效量可以指足以防止损伤、病况或疾病的进展或导致其消退的剂量，或能够缓解损伤、病况或疾病的症状，或能够实现所需结果的剂量。有效量可以被测量，例如，作为制剂、溶液或缓冲液中的肽或其他组分的浓度。有效量可以被测量，例如，作为生物活性剂的浓度或生物活性剂的效果或副产物。有效量可以被测量，例如，作为细胞的数量或活细胞的数量，或细胞的质量(例如，以毫克、克或公斤为单位)，或细胞的体积(例如，以mm3为单位)。
[0240]
在本公开中，制剂可以指组合物或配制剂或产物。
[0241]
如本文所用，“联合”施用是指在受试者遭受损伤的过程中向受试者递送两种(或
更多种)不同的治疗，例如，在受试者被诊断出患有病况或损伤后，在病况或损伤被治愈或消除之前，将所述制剂与第二药剂一起递送。在某些实施方案中，联合施用是指所述制剂另外包括一种或多种第二药剂。在一些实施方案中，当第二药剂的递送开始时，一种治疗的递送仍在进行中，因此存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“相伴”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。这在本文中有时被称为“连续”或“顺序递送”。
[0242]
在任一情况的实施方案中，治疗由于联合施用而更加有效。例如，第二药剂更加有效，例如，用较少的第二药剂就能看到相当的效果，或者第二药剂在更大程度上减少了症状，比在没有本文公开的制剂的情况下施用第二药剂所看到的效果要好，或者与所述制剂一起使用时看到的情况类似。在一些实施方案中，递送是这样的，即症状或与病症有关的其他参数的减少比在没有另一种治疗的情况下递送一种治疗时所观察到的减少要大。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的(即协同的)。递送可以是这样的，即当递送第二药剂时，仍可检测到施用所述制剂的效果。在一些实施方案中，一种或多种治疗可以在对具有损伤的患者进行诊断之前递送。
[0243]
如本文所用，受试者可以包括动物、哺乳动物、人类、非人类动物、家畜或伴生动物。术语“受试者”旨在包括人类和非人类动物，例如，脊椎动物、大型动物和灵长类动物。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，在特定的实施方案中，受试者是人类受试者。虽然明确预见了对人类的应用，但本文也设想了兽医应用，例如对非人类动物的应用。本公开的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(如鸟类，例如鸡；两栖动物；爬行动物)和哺乳动物，例如非人类灵长类动物、驯养的和农业上有用的动物，例如绵羊、狗、猫、牛、猪、鼠等。术语“非人类动物”包括研究动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪等。
[0244]
肽序列和二级结构的特性
[0245]
本文公开的肽可以具有配置为折叠成所需二级结构的序列。二级结构可以指蛋白质局部片段的三维形式。二级结构可以包括，例如，褶状折叠、螺旋带、纳米管和囊泡、表面组装结构以及其他。本文公开的肽可以具有配置为自组装成所需三级结构的序列。三级结构可以指二级结构蛋白质形式的三维组织。三级结构可以包括，例如，三维基质、多孔基质、纳米多孔基质。
[0246]
所公开的自组装肽可以被设计成响应于一个或多个信号而采用二级结构，例如β-发夹，和/或三级结构。通常，在采用二级结构后，所述肽将自组装成高阶结构，例如水凝胶。在某些实施方案中，除非肽分子上的侧链以二级结构构象唯一呈现，否则自组装不会发生。自组装肽可以响应于某些环境条件，例如ph、温度、净电荷、暴露于光、施加声波，或在存在或不存在环境因素的情况下进行组装。导致自组装的环境条件可以在向受试者施用时发生，例如，在与靶组织接触时发生。在一些实施方案中，导致自组装的环境条件可以在肽制剂与配置为导致自组装的缓冲液组合时发生。缓冲液可以具有配置为导致自组装的ph或组成。例如，缓冲液可以具有配置为导致自组装的离子浓度。
[0247]
本文公开的肽的自组装可以产生紧凑的结构，这些结构与肽的预期功能表现出生物物理结构关系。例如，与未组装的肽相比，紧凑的三级结构在每单位面积上可能有更多的活性氨基酸残基。在抗微生物肽的特定实例中，三级结构能够使单位面积的带电荷，如带正电荷的氨基酸残基的浓度更高，增加抗微生物特性(例如，细菌膜的去稳定和破坏)。
[0248]
在某些实施方案中，自组装的肽水凝胶可以包括那些在美国专利号8,221,773；7,884,185；8,426,559；7,858,585；和8,834,926中公开的和/或通过在上述美国专利中的任何一个中公开的方法制备的水凝胶，这些专利出于所有目的通过引用的方式整体并入本文。例如，自组装的肽水凝胶可以是或包括来自美国专利号8,221,773、7,884,185和7,858,585的seq id no:1-20；以及来自美国专利号8,834,926的seq id no:1-33中的任何一个。其他自组装肽是已知的，并且可用于实现本文公开的方法。
[0249]
自组装肽的所需特性可以通过肽的设计来控制。自组装肽可以是小肽，例如，约6至约200个残基，或约6至约50个残基，或约10至约50个残基。氨基酸残基中的任何一个可以是d异构体。氨基酸残基中的任何一个可以是l异构体。
[0250]
本文公开的自组装肽可以被设计成在组装成三级结构时是基本两亲性的。如本文所公开的，“两亲性”分子，例如大分子或聚合物，通常包含疏水性和亲水性组分。肽两亲物是两亲性分子的一个示例性类别。肽两亲物是基于肽的分子，其通常在某些条件下具有自组装成高纵横比的纳米结构的趋势。示例性的条件可以包括选定的ph、温度和离子强度值。一种特定类型的肽两亲物包括以重复模式存在的交替的带电荷的、中性和疏水性残基，例如，如本文所公开的。分子间氢键和疏水及静电相互作用的组合可以被设计成通过组装所公开的肽两亲物来形成明确的自组装的纳米结构。
[0251]
自组装肽可以包括另外的氨基酸，例如表位。例如，自组装肽可以包括另外的官能团，任选地通过肽的设计来选择。本文公开的示例性官能团包括生物衍生的基序，例如，对生物过程如细胞信号转导、细胞外基质(ecm)中的细胞粘附、细胞生长和细胞移动有影响。所述肽可以包括一个或多个修饰，例如接头或间隔区。在一些实施方案中，n末端和c末端中的至少一个可以被修饰。例如，n末端和c末端中的至少一个可以被酰胺化。n末端和c末端中的至少一个可以被乙酰化。在某些示例性的实施方案中，c末端可以被酰胺化和/或n末端可以被乙酰化。在一些实施方案中，n末端和c末端中的至少一个可以是游离的。
[0252]
通常，自组装肽可以具有折叠基团，被配置为采用二级和/或高阶结构。示例性的自组装肽可以具有折叠基团，被设计成采用β-发夹二级结构。示例性的自组装肽可以具有折叠基团，被设计成采用三维纳米多孔基质三级结构。本文公开的自组装肽可以被设计成在靶部位，例如在局部或肠外部位响应于一种或多种环境刺激而采用β-发夹二级结构和/或纳米多孔基质三级结构。自组装肽也可以被设计成自组装成一系列其他的自组装结构，如球形胶束、囊泡、双层(层状结构)、纳米纤维、纳米管和带状。
[0253]
自组装的折叠基团可以具有约2至约200个残基，例如，约2至约50个残基、约10至约30个残基、约15至约25个残基，例如，约20个残基。
[0254]
根据一些实施方案，自组装的折叠基团可以包括疏水性氨基酸。“疏水性”氨基酸残基是那些倾向于排斥水的氨基酸。这种疏水性氨基酸可以包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸。在某些实施方案中，疏水性氨基酸残基可以包括缬氨酸。
[0255]
折叠基团可以通过添加本文所述的其他功能残基而被官能化，或为自组装而保留。示例性的功能残基包括碱性、中性、脂肪族、芳香族和极性氨基酸残基。
[0256]
折叠基团可以具有多个碱性、中性、脂肪族、芳香族、极性、带电荷的氨基酸残基。折叠基团可以具有与非疏水性氨基酸残基以基本交替的模式排列的多个疏水性氨基酸残
基。在某些实施方案中，折叠基团可以具有与多个带电荷的氨基酸残基以基本交替的模式排列的多个疏水性氨基酸残基。
[0257]
折叠基团可以包括转角序列。转角序列可以包括折叠基团内的一个或多个内部氨基酸残基。在某些实施方案中，转角序列可以基本上位于折叠基团的中心位置。
[0258]
转角序列可以具有约2至约20个残基，例如，约2至约10个残基、约2至约8个残基、约2至约5个残基，例如，约2个残基、约3个残基、约4个残基或约5个残基。
[0259]
在示例性的实施方案中，转角序列可以包括脯氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和天冬酰胺中的一个或多个。转角序列可以包括d-脯氨酸和/或l-脯氨酸。在一些实施方案中，转角序列可以具有1-4个脯氨酸残基，例如，1个脯氨酸残基、2个脯氨酸残基、3个脯氨酸残基或4个脯氨酸残基。
[0260]
示例性的自组装肽可以具有包括[ay]n[t][ya]m的折叠基团序列，其中a是1-3个选自碱性、中性、脂肪族、芳香族、极性和带电荷的氨基酸中的一种或多种的氨基酸，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-8个转角序列氨基酸，n和m各自独立地在2和10之间。y氨基酸可以独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，折叠基团序列可以是y[ay]n[t][ya]my-nh2。
[0261]
某些示例性的自组装肽可以具有包括[xy]n[t][yx]m的折叠基团序列，其中x是1-3个带电荷的氨基酸，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-8个转角序列氨基酸，n和m各自独立地在2和10之间。x氨基酸可以独立地选自精氨酸、赖氨酸、色氨酸和组氨酸。y氨基酸可以独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，折叠基团序列可以是y[xy]n[t][yx]my-nh2。
[0262]
某些示例性的自组装肽可以具有包括[zy]n[t][yz]m的折叠基团序列，其中z是1-3个极性或带电荷的氨基酸，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-8个转角序列氨基酸，n和m各自独立地在2和10之间。z氨基酸可以独立地选自谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。y氨基酸可以独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，折叠基团序列可以是y[zy]n[t][yz]my-nh2。
[0263]
一个示例性的自组装肽可以具有包括-ryryrytyryryr-的折叠基团，其中r是精氨酸残基，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-6个转角序列氨基酸。
[0264]
一个示例性的自组装肽可以具有包括-vxvxvxvxvtxvxvxvxv-的折叠基团，其中v是缬氨酸残基，x可以独立地选自带电荷的和中性氨基酸残基丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸和组氨酸，t是2-8个转角序列氨基酸。在一些实施方案中，示例性的折叠基团可以包括与独立选择的亲水性和/或中性氨基酸残基交替的一系列疏水性缬氨酸氨基酸残基。
[0265]
一个示例性的自组装肽可以具有包括-kykykytykykyk-的折叠基团，其中r是精氨酸残基，y是1-3个疏水性氨基酸，t是2-6个转角序列氨基酸。
[0266]
一个示例性的自组装肽可以具有包括-vzvzvzvtvzvzvzv-的折叠基团，其中v是缬氨酸残基，z是1-3个亲水性氨基酸，t是2-6个转角序列氨基酸。
[0267]
示例性的自组装肽可以具有转角序列，所述转角序列包括2-8个转角序列氨基酸，例如2-5个转角序列氨基酸。转角序列氨基酸可以选自脯氨酸如d-脯氨酸和/或l-脯氨酸、
天冬氨酸和天冬酰胺。在一些实施方案中，转角序列可以是(d)pp、(d)pg或ng。
[0268]
具有转角序列的示例性自组装肽包括vkvrvrvrv(d)pptrvrvrvkv-nh2和vltkvktkv(d)pptkvevkvlv-nh2。在示例性的肽中，四肽转角序列(-v(d)ppt-)被选择为采用ii’型转角，并位于肽序列的中间。这个四残基转角序列占据了转角的i、i 1、i 2和i 3位置。选择异手性序列((d)p(i 1)
–
p(i 2))二肽，因为它倾向于采用与ii’型转角一致的二面角。在转角序列的i位置处并入大的β支链残基(缬氨酸)使得在i 1位置处强制形成反式脯氨酰酰胺键(trans prolyl amide bond)。选择在所述位置处放置缬氨酸是为了防止顺式脯氨酰键(cis prolyl bond)的形成，因为顺式脯氨酰键会导致β-链采用延伸的构象而不是预期的发夹。苏氨酸在统计学上有停留在i 3位置处的倾向。因此，选择将苏氨酸并入四肽序列中的所述位置，它带有侧链羟基，能够与i位置处的酰胺骨架羰基氢键键合，以进一步稳定转角。
[0269]
示例性的折叠肽可以被设计成包括在ii型’转角序列两侧的形成高倾向性β-折叠的残基。疏水性和亲水性残基沿链的交替选择在肽折叠时提供两亲性的β-折叠。例如，可以选择赖氨酸作为亲水性残基，以提供约10.5的侧链pka值。侧链胺在轻微酸性条件下溶解时通常会被质子化，在发夹的β-链之间形成不利的静电相互作用，并抑制肽的折叠和自组装。然而，当ph增加到约ph 9时，足够部分的赖氨酸侧链变得去质子化，允许肽折叠成两亲性的β-发夹。静电相互作用可用于设计所公开的肽的ph响应性。
[0270]
虽然不希望受到理论的束缚，但相信两亲性β-发夹在分子内折叠状态下是通过同一发夹内相邻的氨基酸侧链之间的范德华接触而稳定的。发夹的交叉β-链之间的分子内氢键的形成和转角序列采用ii’型转角的倾向可能进一步稳定了折叠构象。一旦处于折叠状态，可以选择β-发夹的侧向和正向结合来设计自组装。例如，β-发夹的侧向结合可以促进分子间氢键的形成和相邻氨基酸之间的范德华接触。
[0271]
示例性的自组装肽可以具有包括(x)a(y)b(z)c-[(d)pp,(d)pg或ng]-(z)c(y)b(x)a的折叠基团序列，其中转角序列是(d)pp、(d)pg或ng，(d)p是d-脯氨酸，x是带电荷的氨基酸，y是疏水性氨基酸，z是疏水性氨基酸或极性氨基酸，a、b和c各自独立地是1-10的整数。在某些实施方案中，x独立地选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸及其组合。在某些实施方案中，y独立地选自谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸及其组合。在某些实施方案中，z独立地选自谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸及其组合。
[0272]
示例性的自组装肽可以具有包括(z)c(y)b(x)a-[(d)pp,(d)pg或ng]-(x)a(y)b(z)c的折叠基团序列，其中转角序列是(d)pp、(d)pg或ng，(d)p是d-脯氨酸，x是带电荷的氨基酸，y是疏水性氨基酸，z是疏水性氨基酸或极性氨基酸，a、b和c各自独立地是1-10的整数。在某些实施方案中，x独立地选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸及其组合。在某些实施方案中，y独立地选自谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸及其组合。在某些实施方案中，z独立地选自谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸及其组合。
[0273]
本文公开的任何带电荷的、疏水性、极性或两亲性氨基酸可以从生物相容性溶液的组合物中获得一种或多种特性。
[0274]
疏水性氨基酸是那些倾向于排斥水的氨基酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸。疏水性氨基酸可以独立地选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸及其
组合。在一些实施方案中，疏水性氨基酸包括缬氨酸。
[0275]
带电荷的氨基酸是那些在给定条件下倾向于具有电荷的氨基酸。带电荷的氨基酸可以具有形成盐桥的侧链。带电荷的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。折叠基团可以包括2-10个带电荷的氨基酸，例如2-8个带电荷的氨基酸。
[0276]
带电荷的氨基酸可以是带正电荷的氨基酸。折叠基团可以包括2-10个带电荷的氨基酸，例如2-8个带电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸可以独立地选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其组合。折叠基团可以包括2-8个精氨酸残基、赖氨酸残基或精氨酸和赖氨酸残基的组合。在一些实施方案中，折叠基团可以包括6个带正电荷的残基，所述残基选自精氨酸、赖氨酸或精氨酸和赖氨酸的组合。
[0277]
带电荷的氨基酸可以是带负电荷的氨基酸。折叠基团可以包括2-10个带负电荷的氨基酸，例如，2-8个带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸可以独立地选自天冬氨酸、谷氨酸及其组合。
[0278]
极性氨基酸是那些具有不均匀电荷分布的氨基酸。极性氨基酸可能倾向于形成氢键作为质子供体或受体。极性氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
[0279]
两亲性氨基酸是那些同时具有极性和非极性组分的氨基酸。两亲性氨基酸可以在蛋白质或脂质膜的表面找到。两亲性氨基酸包括色氨酸、酪氨酸和蛋氨酸。
[0280]
示例性的自组装肽可以具有seq id no:1-23中的任何一个的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:1的折叠基团序列。在某些实施方案中，自组装肽可以具有seq id no:2的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:3的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:4的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:5的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:6的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:7的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:8的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:9的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:10的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:11的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:12的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:13的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:14的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:15的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:16的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:17的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:18的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:19的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:20的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:21的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:22的折叠基团序列。自组装肽可以具有seq id no:23的折叠基团序列。
[0281]
具有剪切稀化特性的示例性的自组装肽包括vkvrvrvrv(d)pptrvrvrvkv-nh2和vkvrvrvrv(d)pptrvevrvkv-nh2(其在亲水面第15位处有谷氨酸的单一取代)。谷氨酸取代导致自组装的肽凝胶在生物相容性溶液中的离子盐存在下凝胶化的速度更快。带负电荷的谷氨酸降低了肽的整体正电荷，使折叠和自组装更快。
[0282]
剪切稀化特性可根据肽的净电荷进行调整的示例性的自组装肽包括vkvrvrvrv(d)pptrvevrvkv-nh2和vkvkvkvkv(d)pptkvevkvkv-nh2(其在亲水面上精氨酸被取代为赖氨酸)。赖氨酸取代降低了肽在生理性ph下的净电荷，与高精氨酸含量(较高的净电荷)的肽相
比，可以实现更好的哺乳动物细胞相容性。示例性的肽是抗微生物的自组装肽。
[0283]
具有剪切稀化特性的示例性的自组装肽，其可以调整为具有更快的凝胶化速度和增加硬度的肽凝胶，包括fkfrfrfrv-(d)pptrfrfrfkf-nh2(其在疏水面上缬氨酸取代为苯丙氨酸)。苯丙氨酸取代增加了肽的疏水面，使肽凝胶的凝胶化更加坚硬和快速。示例性的肽是抗微生物的自组装肽。
[0284]
具有剪切稀化特性的示例性的自组装肽包括上述示例性序列的对映体形式，例如vkvrvrvrv(d)pptrvrvrvkv-nh2,(d)v(d)k(d)v(d)r(d)v(d)r(d)v(d)r(d)v(l)p(d)p(d)t(d)r(d)v(d)r(d)v(d)r(d)v(d)k(d)v-nh2的对映体形式(其具有所述序列的d异构体和p的l异构体)。异构体取代可以提供对肽降解的控制，增加稳定性，而不影响肽在生理性ph下的净电荷。所述序列可以提供与哺乳动物细胞更好的相容性。所述肽可以是完全对映体(如上所示)或部分对映体，这样任何一个或多个氨基酸可以是上述序列的对映体。示例性的肽是抗微生物的自组装肽。
[0285]
其他示例性的自组装肽包括ac-vevsvsvev(d)pptevsvevevggggrgdv-nh2和vevsvsvevdpptevsvevev-nh2。
[0286]
自组装肽可以包括至少一个胍部分。所述胍部分可以与构成肽链的一部分的有机分子结合。在示例性的实施方案中，胍部分可作为精氨酸残基的侧链的一部分被并入。然而，所述肽可以包括不与精氨酸残基结合的胍部分。
[0287]
胍部分通常是高度极性的基团，当它位于阳离子肽上时，可能允许与疏水性和亲水性基团配对形成盐桥和氢键。这样的肽可以显示出穿透细胞膜的高能力，并提供抗微生物活性。胍部分还可以通过改善肽和/或水凝胶的肽折叠、物理特性和热稳定性来促进肽的稳定性。
[0288]
所述肽通常可以具有20-50％的胍含量，按肽的氨基酸残基总数的胍基数量计算。例如，具有20个氨基酸残基的示例性肽序列，其中6个是具有胍基的精氨酸残基，具有30％的胍含量。示例性的肽可以穿透并破坏细胞膜。
[0289]
肽水凝胶制剂的特性
[0290]
所述制剂通常可以包括生物相容性溶液中的自组装肽。例如，所述肽可以溶解或基本上溶解在生物相容性溶液中。所述制剂可以包括约0.1％w/v和约8.0％w/v之间的肽。所述制剂可以被配制用于靶标指示。例如，自组装肽的浓度可以根据靶标指示来选择。例如，具有抗微生物特性的示例性制剂可以包括少于1.5％w/v的肽，例如，约0.5％w/v的肽和1.0％w/v的肽之间。
[0291]
示例性制剂可以包括约0.25％w/v和约6.0％w/v之间的肽，例如，约0.5％w/v和约6.0％w/v之间的肽。当肽被纯化时，所述制剂可以包括高达约6.0％w/v的肽。在某些实施方案中，所述制剂可以包括少于约3.0％w/v的肽，例如，约0.25％w/v和约3.0％w/v之间的肽之间，约0.25％w/v和约2.0％w/v之间的肽之间，约0.25％w/v和约1.25％w/v之间的肽，或约0.5％w/v的肽和约1.5％w/v的肽之间。所述制剂可以包括约0.5％w/v和约1.0％w/v之间的肽，约0.7％w/v和约2.0％w/v之间的肽，或约0.7％w/v和约0.8％w/v之间的肽。例如，所述制剂可以包括约0.25％w/v、约0.5％w/v、约0.7％w/v、约0.75％w/v、约0.8％w/v、约1.0％w/v、约1.5％w/v的肽，约2.0％w/v或约3.0％w/v。在特定的实施方案中，所述制剂可以包括少于约1.5％w/v的肽。所述制剂可以包括少于约1.25％w/v的肽或少于约1.0％w/v
的肽。在一个示例性的实施方案中，所述制剂可以包括约0.75％w/v的肽。
[0292]
与缓冲液组合后，水凝胶可以具有约0.05％w/v和6.0％w/v之间的肽。例如，水凝胶可以具有约0.1％w/v和6.0％w/v之间的肽，约0.25％w/v和6.0％w/v之间的肽，约1.5％w/v和6.0％w/v之间的肽，约0.25％w/v和3.0％w/v之间的肽，约0.25％w/v和1.0％w/v之间的肽，约0.25％w/v和0.5％w/v之间的肽，或约0.3％w/v和0.4％w/v之间的肽。肽制剂和缓冲液可以按肽制剂与缓冲液约2:1至0.5:1的比例组合形成水凝胶。在一些实施方案中，肽制剂和缓冲液可以按约1:1的比例组合形成水凝胶。
[0293]
所述制剂中的肽可以被纯化。如本文所公开的，“纯化的”可以指为去除污染物而接受处理的组合物。特别是，纯化的肽可以具有适合临床应用的组成。例如，所述肽可以被纯化以满足临床施用的健康和/或监管标准。所述肽可以是至少80％纯化的，例如，至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9％。
[0294]
在某些实施方案中，可以对肽进行纯化，以去除或减少肽的固相合成中的残留有机溶剂含量。所述肽可以包括少于20重量％的残留有机溶剂。所述肽可以包括少于15重量％的残留有机溶剂。所述肽可以包括少于10重量％的残留有机溶剂。例如，所述肽可以包括少于8重量％、少于5重量％、少于2重量％、少于1重量％或少于0.1重量％的残留有机溶剂。可以从合成的肽中去除或减少的示例性的有机溶剂包括三氟乙酸(tfa)、乙腈、异丙醇、n,n-二甲基甲酰胺、三乙胺、乙醚和乙酸。
[0295]
纯化的肽可以基本上不含三氟乙酸(tfa)。例如，纯化的肽可以具有少于1％w/v的残留tfa，或约0.005％w/v和1％w/v之间的残留tfa。
[0296]
纯化的肽可以基本上不含乙腈。在一些实施方案中，纯化的肽可以具有少于约410ppm的残留乙腈。纯化的肽可以具有约0.005ppm和约410ppm之间的残留乙腈。
[0297]
纯化的肽可以基本上不含异丙醇。在一些实施方案中，纯化的肽可以具有少于约400ppm的残留异丙醇。纯化的肽可以具有少于约100ppm的残留异丙醇。纯化的肽可以具有约0.005ppm和100ppm之间的残留异丙醇。
[0298]
纯化的肽可以基本上不含n,n-二甲基甲酰胺。在一些实施方案中，纯化的肽可以具有少于约880ppm的残留n,n-二甲基甲酰胺。纯化的可以具有约0.005ppm和约880ppm之间的残留n,n-二甲基甲酰胺。
[0299]
纯化的肽可以基本上不含三乙胺。在一些实施方案中，纯化的肽可以具有少于约5000ppm的残留三乙胺。纯化的肽可以具有约0.005ppm和约5000ppm之间的残留三乙胺。
[0300]
纯化的肽可以基本上不含乙醚。在一些实施方案中，纯化的肽可以具有少于约1000ppm的残留乙醚。纯化的肽可以具有约0.005ppm和约1000ppm之间的残留乙醚。
[0301]
纯化的肽可以基本上不含乙酸。例如，纯化的肽可以具有少于2％w/v的残留乙酸，例如，少于1％w/v的残留乙酸，少于0.5％w/v的残留乙酸，少于0.1％w/v的残留乙酸，约0.0001％w/v和2％w/v之间的残留乙酸，或约0.005％w/v和0.1％w/v之间的残留乙酸。
[0302]
通常，纯化的肽和/或生物相容性溶液可以具有与国际人用药品技术要求协调委员会(ich)定义的监管限制一致的特性。
[0303]
所述制剂的生物相容性溶液可以指肽的基本液体载体。生物相容性溶液通常可以是水溶液。生物相容性溶液可以包括水，例如，去离子水。去离子水在25℃下可以具有大于约18mω的电阻率和小于约0.056μs的电导率。去离子水可以具有0.03内毒素单位(eu)/ml
的最大内毒素规格和1cfu/ml的微生物作用或更少。去离子水可以具有10ppb或更低的总有机碳(toc)浓度可为。生物相容性溶液可以包括医药用水。医药用水可以具有500ppb的总有机碳(toc)浓度或更少和100cfu/ml的微生物作用或更少。生物相容性溶液可以包括注射用水。注射用水可以具有0.25内毒素单位(eu)/ml的最大内毒素规格和10cfu/10ml的微生物作用或更少。在某些实施方案中，所述制剂或生物相容性溶液可以基本上不含氯离子。
[0304]
所述制剂或肽可以包括反离子。如本文所公开的，反离子可以指平衡电荷的离子。所述制剂或肽可以具有有效量的反离子，以使所述制剂基本上呈电中性。所述制剂或肽可以具有有效量的反离子，以使所述制剂基本上具有生物相容性和/或稳定性。所述制剂或肽可以具有有效量的反离子以控制肽的阴离子或阳离子残基的排斥。反离子的浓度可以取决于肽序列以及肽和任何添加剂的浓度。在示例性的实施方案中，所述肽可以包括0.1-20％的反离子。此外，反离子的电荷可以取决于肽和任何添加剂的电荷。因此，反离子可以是阴离子或阳离子。通常，反离子可以是细胞相容的。在某些实施方案中，反离子可以是生物相容的。例如，反离子可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、铵、氟化物或氯化物。在其他实施方案中，所述制剂或肽可以基本上不含氯化物反离子。
[0305]
在示例性的实施方案中，所述制剂或肽可以包括有效量的乙酸盐反离子。特别是，具有包括残留tfa的肽浓度的制剂可以具有足以平衡残留tfa的乙酸盐反离子的量。简而言之，tfa通常用于从固相树脂中释放合成的肽。在肽的反相hplc纯化过程中，tfa也是常用的。然而，残留的tfa或氟化物在预期用于临床的肽中可能是有毒的和不需要的。此外，tfa可能与n末端的游离胺基和带正电荷的残基(如赖氨酸、组氨酸和精氨酸)的侧链相互作用。肽制剂中存在的tfa-盐反离子可能对生物材料不利，并可能对预期的肽活性的准确性和可重复性产生负面影响。
[0306]
可以采用通过乙酸盐或盐酸盐进行的tfa-乙酸盐交换来抵消上述tfa的一些或全部负面影响。本发明人已经确定，乙酸盐反离子出人意料地很好地适合于保持肽制剂的生物活性，并控制肽的溶解度和肽自组装的电荷。此外，乙酸(pka＝4.5)比三氟乙酸(pka约0)和盐酸(pka＝-7)都要弱。乙酸盐反离子可以额外控制肽制剂的ph，使其为生理性中性。
[0307]
所述制剂可以具有可变的水凝胶化动力学。根据某些实施方案，所述制剂的水凝胶化动力学可以为特定的施用方式设计。所述制剂可作为液体施用。所述制剂可作为固体或半固体施用。所述制剂可作为凝胶施用。所述制剂可作为悬浮在液体中的水凝胶的组合来施用。所述制剂可以具有可变的表观粘度。例如，所述制剂可以具有有效的表观粘度，以便在施用条件下进行注射。在某些实施方案中，所述制剂可以具有一个表观粘度，所述表观粘度随着剪切应力的增加而降低。
[0308]
所述制剂可以被配置为响应于施加的压力，例如施加的机械力，而可逆地自组装和分解。固体或凝胶制剂可以随着施加的压力的增加而被破坏，随后一旦施加的压力减少，就会恢复。固体或凝胶可以响应于施加的压力而成为流体，例如在通过递送装置递送的过程中。所述肽能够响应于施加的压力而进行连续的相变。所述肽能够在每一个或多个连续的相变后恢复。
[0309]
所述制剂可以被配置为响应于温度变化、ph变化、与离子螯合剂接触、用溶剂稀释、施加声波、冻干、真空干燥和空气干燥中的至少一种而可逆地自组装和分解。施用的液体在重新形成为固体或凝胶之前可以与组织空隙相适应。因此，在适当的剪切应力下，固体
或凝胶制剂可以是可注射的、可流动的或可喷雾的。一旦施用，所述制剂可恢复为固体或凝胶形式，基本上与靶部位相适应。所述形成可以在少于一分钟、约一分钟、少于约2分钟、少于约3分钟、少于约5分钟或少于约10分钟内发生。所述形成可以在约1分钟、少于约30秒、少于约10秒或约3至5秒内发生。
[0310]
所述肽可以被纯化。例如，所述肽可以被冻干。如图9所示，净电荷可作为ph值的函数被量化。图9中测量的示例性肽是富含精氨酸的肽，其具有两个赖氨酸残基。图9的示例性肽在ph为7时净电荷为 9。其他肽也在本公开的范围内。例如，纯化的肽在ph 7下可以具有-9至 11的净电荷，例如，在ph 7下具有-7至 9的净电荷。如本文所公开的，“净电荷”可以指肽的作为生物物理和生物化学特性的总电荷，通常是在ph为7时测量的。
[0311]
纯化的肽在ph 7下可以具有-7至 11的净电荷。在一些实施方案中，所述肽可以具有 2至 9的净电荷，例如， 5至 9或 7至 9。纯化的肽在ph 7下可以具有约 5、 6、 7、 8、 9、 10或 11的电荷。具有 5至 9的电荷的示例性肽包括vltkvktkv(d)pptkvevkvlv、vkvrvrvrv(d)pptrvrvrvkv和vkvrvrvrv(d)pptrvevrvkv。在其他实施方案中，纯化的肽可以是基本中性的。在其他的实施方案中，所述肽可以具有净负电荷。具有净负电荷的示例性肽是vevsvsvev(d)pptevsvevev。如图10所示，肽序列中谷氨酸的单一取代可以使肽的净电荷在ph 7下从 7(上图)变为 9(下图)，并使等电点从11.45变为14。可以通过肽的设计来选择净电荷。肽水凝胶中静电电荷的设计可以允许控制与细胞膜和蛋白质相互作用的电荷。
[0312]
所述肽可以被设计成具有吸附和/或促进蛋白质在施用的靶部位失活的电荷。例如，带正电荷的肽水凝胶可以促进对带负电荷和中性电荷的分子的吸附，如小分子、蛋白质和囊外膜。带负电荷的肽水凝胶可以促进对带正电荷和中性电荷的分子的吸附，如小分子、蛋白质和囊外膜。此外，所述肽可以被设计成具有不同程度的正电荷、中性电荷或负电荷的区域。在某些实施方案中，肽的电荷可以被设计成这样，即当被放入富含带电荷的分子的溶液中时，所述肽可以浸出或吸收分子进入水凝胶，通过吸附将分子粘附至肽。图3是显示带负电荷的台盼蓝被吸附在带正电荷的水凝胶上的显微图像。
[0313]
纯化的肽可以具有大于70％w/v、大于80％w/v或大于90％w/v的氮，例如，70％w/v和99.9％w/v之间的氮。
[0314]
纯化的肽可以具有小于约10eu/mg的细菌内毒素水平，例如，小于约5eu/mg、小于约2eu/mg或小于约1eu/mg。在其他实施方案中，纯化的肽可以具有约-0.010至-0.015eu/ml的内毒素水平。例如，纯化的肽在410nm处的od可以在0.004至0.008之间，例如约0.006。肽水凝胶在410nm处的od可以在0.010至0.020之间，例如约0.015。在一些实施方案中，纯化的肽和/或制剂可以基本上不含内毒素。
[0315]
生物相容性溶液中的纯化的肽可以具有约1％w/v和约20％w/v之间的水含量，例如，至少约10％w/v或小于约15％w/v。
[0316]
纯化的肽可以具有约7-14之间的等电点。例如，纯化的肽可以具有约7、8、9、10、11、12、13或14的等电点。
[0317]
纯化的肽可以被配置为自组装成水凝胶，所述水凝胶具有通过流变学测试确定的约2pa至3500pa的剪切模量。例如，纯化的肽可以自组装成具有大于100pa、100pa至3500pa、100pa至3000pa、2pa至1000pa或2pa至500pa的剪切模量的水凝胶。例如，具有0.75％w/v的肽的制剂可以具有约2pa至500pa的剪切模量。具有1.5％w/v的肽的制剂可以具有约100pa
至3000pa的剪切模量。具有3.0％w/v的肽的制剂可以具有约1000pa至10000pa的剪切模量。因此，水凝胶的剪切模量可以通过选择制剂中的肽浓度来控制。
[0318]
所述肽可以被设计成采用预先确定的二级结构。例如，如前所述，所述肽可以被设计成采用β-发夹二级结构。预先确定的二级结构可以包括预选自β-折叠、α-螺旋和无规卷曲中的至少一种的结构。在示例性的实施方案中，可以选择疏水性氨基酸残基(例如，疏水性氨基酸残基的数量、位置和/或结构)来将肽自组装成具有大部分β-折叠结构的聚合物。在特定的实施方案中，可以选择疏水性氨基酸残基来控制水凝胶的硬度。例如，可以选择疏水性氨基酸残基的数量和类型来控制水凝胶的硬度。
[0319]
在一些实施方案中，外部刺激如温度、ph变化、光和施加声波可用于控制和促进自组装肽的优先二级结构形成。二级结构形成的控制可以增强肽的生物、生物物理和化学治疗功能。例如，通过将β-发夹肽暴露于高ph(例如，至少ph9)或高温(例如，至少125℃)或低温(例如，4℃或更低)，可以实现自组装肽的更高的细胞膜透过。结果是具有大部分β-折叠或α-螺旋形成的肽二级结构的水凝胶。
[0320]
所述肽可以被设计成使制剂具有剪切稀化特性。特别是，所述肽可以被设计成可注射的。例如，所述肽可以通过采用剪切稀化动力学来设计成可注射的固体或凝胶。所述制剂在应用前为固体或凝胶形式，可以被配置为在通过递送装置施用期间施加的有效剪切应力下剪切稀化至可流动状态。在一些示例性的实施方案中，固体或凝胶可以在注射或用注射器进行局部应用时剪切稀化至可流动状态。也可以采用其他施用方式。固体或凝胶可以在内窥镜施用期间剪切稀化至可流动状态。固体或凝胶可以被配置为剪切稀化以流经解剖学内腔，例如动脉、静脉、胃肠道、支气管、肾管、生殖道等。在一些实施方案中，可以在经腔手术期间采用剪切稀化特性。所述肽可以被设计成可喷雾的。例如，所述肽可以被设计成作为喷雾或其他液滴施用，例如，其他推进的液滴，通过采用剪切稀化动力学，如前所述。
[0321]
水凝胶的剪切稀化动力学可以通过改变肽的净电荷而工程化。在一些实施方案中，可以通过控制阳离子颗粒或肽的存在或不存在、阴离子颗粒或肽的存在或不存在、缓冲液、盐、肽浓度、肽纯度以及肽反离子的存在或不存在中的一个或多个来改变净电荷。特别是，可以通过改变肽的纯度来控制剪切稀化，以实现所需的剪切稀化动力学。肽的净电荷可以是正的。肽的净电荷可以是负的。
[0322]
剪切稀化可以通过对水凝胶的机械搅拌或环境刺激来导致。机械搅拌可以例如通过递送或超声混合来导致。环境刺激可以通过添加热、光、离子剂、螯合剂、缓冲液或蛋白质或改变ph水平来导致。
[0323]
因此，这些制剂可以是基本上可流动的。这些方法可以包括通过插管或针头分配制剂。这些方法可以包括对任何大小和形状的创面进行适形填充。肽水凝胶可以具有剪切稀化的机械特性。剪切稀化的机械特性可以使凝胶网络在施用过程中，例如在从针头注射或用喷嘴施用过程中被破坏并成为液体。当施加的压力停止时，凝胶网络可以重新形成，弹性模量可以在预先确定的时间例如几分钟内恢复。剪切稀化的肽水凝胶可用于保护细胞在注射过程中免受损害，显示出比在生理盐水或培养基中直接注射改善的活力。剪切稀化的水凝胶可以显示出非牛顿流体的流动，这可能允许有效地混合赋形剂，例如，在几分钟到几个小时内。在一些实施方案中，染料、小分子和大分子可以在少于120分钟内，例如在30-120分钟内基本均匀地分散在水凝胶中。
[0324]
所述肽可以自组装成半透明的水凝胶。在一些实施方案中，所述肽可以自组装成基本透明的水凝胶。水凝胶的透明度可以使用户或医疗服务提供者通过水凝胶观察周围组织。在示例性的实施方案中，外科手术可以在不被水凝胶严重阻挡视野的情况下进行。水凝胶可以具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的透光率。水凝胶可以是无色的。水凝胶的透光率和颜色可以通过调整肽的序列和/或制剂或溶液的组成来工程化。如图8的图表所示，肽水凝胶的透明度可以通过吸光度测量来量化。图8中测量的示例性的肽水凝胶是基本透明的。
[0325]
在一些实施方案中，所述制剂可以包括染料。染料可以是食品用染料或医药用染料。染料可以是细胞相容的。染料可以是生物相容的。通常，染料可以帮助用户或医疗保健提供者在应用后查看水凝胶。所述制剂可以包括有效量的染料，以提供所需的水凝胶的不透明度。水凝胶可以包括有效量的染料，使其透光率小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。当包括染料时，水凝胶可以是基本不透明的。
[0326]
所述肽可以自组装成基本离子交联的水凝胶。“离子交联”可以指肽之间的离子键，以形成二级结构蛋白质，和/或二级结构蛋白质之间的离子键，其形成水凝胶三级结构。水凝胶的剪切稀化特性可以通过物理交联来实现，使得离子键被打破和重新形成。根据某些实施方案，水凝胶是由大部分的离子交联形成的。例如，50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、99％以上或基本上所有形成的水凝胶的物理交联可以是离子性质的。
[0327]
所述制剂和/或组装的水凝胶可以被设计成具有基本生理性的ph水平。所述制剂或水凝胶可以具有约4.0至9.0的ph水平。在一些实施方案中，所述制剂或水凝胶可以具有约7.0至8.0的ph水平。所述制剂或水凝胶可以具有约7.3至7.5的ph水平。基本生理性的ph可以允许在凝胶化时施用制剂。在一些实施方案中，水凝胶可以在照护点制备。这些方法可以包括将制剂与配置为导致自组装的缓冲液混合，任选地搅拌所述混合物，并在照护点施用制剂或水凝胶。施用可以是局部的或肠外的，如下文更详细描述的。
[0328]
所述肽可以被设计成响应于刺激而自组装。刺激可以是环境刺激，例如，温度变化(例如，加热)、暴露于光、ph变化、施加声波或暴露于离子剂、螯合剂或蛋白质。刺激可以是机械搅拌，例如通过递送、超声处理或混合来导致。在一些实施方案中，这些方法可以包括以液体的形式施用制剂。这些方法可以包括以凝胶的形式施用所述制剂。这些方法可以包括以固体或半固体的形式施用制剂。
[0329]
在一些实施方案中，所述制剂可以被设计成在一段时间终止后自组装。例如，所述制剂可以被设计成使肽被配置为在少于约5分钟、少于约3分钟、少于约2分钟、少于约30秒、少于约10秒或少于约3秒内开始自组装。在某些实施方案中，所述制剂可以被设计成使肽被配置为在约60分钟内、约30分钟内、约15分钟内、约10分钟内、约5分钟内、约3分钟内、约2分钟内、约30秒内、约10秒内、约5秒内或约3秒内自组装，即基本自组装。所述制剂可以具有配置为控制自组装时机的组成。例如，所述制剂可以具有配置为定时释放离子剂或ph改变剂的组成。在某些实施方案中，所述肽的序列或结构可以被设计成控制肽的自组装。
[0330]
在某些实施方案中，这些方法可以包括将所述制剂与缓冲液组合。“缓冲液”可以指配置为在向受试者施用制剂之前、之后或与之同时导致凝胶化的药剂。因此，在一些实施方案中，所述制剂可以包括缓冲液。例如，所述制剂可以包括高达约1000mm的缓冲液或与之
组合。缓冲液可以包括有效量的离子盐和缓冲剂，例如，以导致凝胶化和/或提供所需的特性。例如，缓冲液可以被配制成控制或保持制剂的ph。
[0331]
在特定的实施方案中，缓冲液可以具有有效量的离子盐来控制水凝胶的硬度。“离子盐”可以指在溶液中解离成离子的化合物。缓冲液可以包括约5mm至400mm的离子盐。例如，缓冲液可以包括约5mm至200mm的离子盐，约50mm至400mm的离子盐，约50mm至200mm的离子盐，或约50mm至100mm的离子盐。离子盐可以是解离成钠、钾、钙、镁、铁、铵、吡啶、季铵、氯、柠檬酸、乙酸和硫酸离子中的至少一种的盐。离子盐可以包括氯化钠、氯化铵、氯化镁、氯化钾、氯化钙、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、碳酸氢钠及其组合。
[0332]
在示例性的实施方案中，缓冲液可以包括约1mm至约200mm的氯化钠。例如，缓冲液可以包括约10mm至约150mm的氯化钠，例如约50mm至约100mm的氯化钠。
[0333]
缓冲液可以包含反离子。缓冲液可以具有有效量的反离子，以使水凝胶基本上呈电中性。缓冲液可以具有有效量的反离子，以导致肽的自组装。反离子的浓度可以取决于肽制剂的组成。此外，反离子的电荷可以取决于肽制剂的电荷。因此，反离子可以是阴离子或阳离子。通常，反离子可以是细胞相容的。在某些实施方案中，反离子可以是生物相容的。例如，反离子可以包括乙酸盐或氯化物。在其他实施方案中，生物相容性溶液可以基本上不含氯化物反离子。
[0334]
缓冲液可以包括约1mm至约150mm的生物缓冲剂。例如，缓冲液可以包括约1mm至约100mm的生物缓冲剂，约1mm至约40mm的生物缓冲剂，或约10mm至约20mm的生物缓冲剂。生物缓冲剂可以选自双三丙烷(btp)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、dulbecco改良eagle培养基(dmem)、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、2-(n-吗啉)乙磺酸半钠盐、4-吗啉乙磺酸半钠盐(mes)、3-(n-吗啉)丙磺酸(mops)和3-(n-吗啉)丙磺酸(mobs)、tricine、bicine、(三(羟甲基)甲胺基)丙磺酸(taps)、n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(aces)、β-羟基-4-吗啉丙磺酸、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(mopso)、(n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)(bes)及其组合。其他生物缓冲剂也在本公开的范围内。
[0335]
在示例性的实施方案中，缓冲液可以包括约1mm至约150mm的btp。缓冲液可以包括约10mm至约100mm，例如，约10mm至约50mm的btp，约10mm至约40mm，约20mm至约40mm，或约20mm至约40mm的btp。
[0336]
缓冲液可以额外包括水、酸和碱中的至少一种。酸和/或碱可以以有效控制缓冲液的ph使其为基本生理性的ph的量添加。在其他实施方案中，缓冲液可以是酸性的、碱性的或基本中性的。可以选择缓冲液来控制水凝胶的ph，并在靶部位保持所需的ph。例如，控制水凝胶的ph，使其在靶部位为基本生理性的ph。因此，可以根据靶部位来选择缓冲液的特性。缓冲液可以具有额外的所选特性，例如，净电荷、额外蛋白质的存在或不存在等。缓冲液可以额外包括一种或多种矿物质。
[0337]
所述制剂可以进一步包括有效量的矿物粘土。所述制剂可以包括约0.1％w/v至约20％w/v的矿物粘土。例如，所述制剂可以包括0.75％w/v、1.5％w/v、2％w/v、3％w/v、4％w/v、8％w/v、10％w/v或20％w/v的矿物粘土。矿物粘土的量可以有效地为应用的靶部位提供所需的流变学特性。矿物粘土的量可以有效地形成薄膜。矿物粘土可以是天然的或合成的。矿物粘土可以包括锂藻土和蒙脱石中的至少一种。在一些实施方案中，所述制剂可以包括肽与矿物粘土的1:1至1:2的比例(w/v)。例如，制剂中肽与矿物粘土的比例可以是1:1、3:4、
3:8或1:2(w/v)。
[0338]
所述制剂可以被配制用于靶标指示。例如，所述制剂可以被配制用于治疗微生物感染或抑制微生物如病原微生物的增殖。所述制剂可以被配制用于治疗真菌感染或抑制真菌生物体的增殖。所述制剂可以被配制用于细胞培养和/或细胞递送。所述制剂可以被配制用于治疗或抑制伤口，如慢性伤口，或生物膜。所述制剂可以通过如下文更详细描述的对肽进行工程化来配制。所述制剂可以通过选择生物相容性溶液和/或添加剂来配制。
[0339]
在某些实施方案中，所述制剂可以被配制用于联合治疗。所述制剂可以包括至少一种配置为提供联合治疗的活性剂。在一些实施方案中，所述制剂可以表现出与活性剂组合的协同作用结果。活性剂可以是，例如，抗细菌组合物、抗病毒组合物、抗真菌组合物、抗肿瘤组合物、抗炎组合物、止血剂、细胞培养基、细胞培养血清、抗臭组合物、镇痛剂、局部麻醉剂或止痛组合物。所述制剂可以被配制用于与上述组合物之一结合施用。所述制剂可以被配制用于同时或并行联合施用。所述制剂可以被配制用于顺序联合施用。
[0340]
在一些实施方案中，所述制剂和/或水凝胶可以被设计成在-20℃和150℃之间、-20℃和125℃之间、-20℃和100℃之间、2℃和125℃之间以及37℃和125℃之间是热稳定的。如本文所公开的，“热稳定性”是指经受温度处理而不发生大量降解、生物活性丧失或化学活性丧失的能力。图7a-7b的图表显示了通过静态光散射(sls)在266nm处测量的示例性肽的肽聚集作为温度的函数。示例性肽包括精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基。如图7a-7b的图表所示，所述肽水凝胶和肽作为温度的函数是热稳定的。
[0341]
在某些实施方案中，所述制剂和/或肽可以是机械稳定的。例如，所述制剂可以被剪切稀化或超声处理。所述制剂可以被超声处理而不发生大量降解、生物或化学活性的丧失。所述制剂可以被剪切稀化而不发生大量降解、生物或化学活性的丧失。
[0342]
在某些实施方案中，所述制剂和/或肽可以是无菌的或灭菌的。所述制剂和/或肽可以通过高压灭菌进行灭菌。在高压灭菌期间，所述制剂和/或肽可以被加热到120℃至150℃的温度，例如，高至125℃、高至135℃或高至150℃。所述制剂和/或肽可以在高压灭菌温度下保持至少约2分钟，例如，约2-20分钟或约10-160分钟。高压灭菌可足以对任何病原微生物进行至少约90％、95％、99％、99.9％、99.99％、99.999％或100％的灭菌。所述制剂和/或肽在高压灭菌期间和之后可以保持稳定。例如，所述制剂和/或肽可以在高压灭菌后保持物理、化学、生物和/或功能上的稳定。
[0343]
在某些实施方案中，所述制剂和/或肽可以被巴氏灭菌。在巴氏灭菌过程中，所述制剂和/或肽可以被加热到50℃至100℃的温度，例如，高达60℃、高达70℃或高达100℃。所述制剂和/或肽可以在巴氏灭菌温度下保持至少约15秒，例如，约1-30分钟或约3-15分钟。巴氏灭菌可足以对任何病原微生物进行至少约90％、95％、99％、99.9％、99.99％或99.999％的灭菌。
[0344]
在某些实施方案中，可以通过超高温(uht)或高温/短时(htst)灭菌对制剂进行灭菌。在uht或htst灭菌过程中，所述制剂和/或肽可以被加热到100℃至150℃的温度，例如，高达130℃、高达140℃或高达150℃。所述制剂和/或肽可在uht或htst温度下保持至少约15秒，例如，约少于1分钟至约6分钟，例如，约2-4分钟。uht或htst灭菌可足以对任何病原微生物进行至少约90％、95％、99％、99.9％、99.99％或99.999％的灭菌。
[0345]
在某些实施方案中，灭菌或巴氏灭菌可以是终端的。终端灭菌或巴氏灭菌可以指
在密封的最终使用包装中对制剂进行处理。
[0346]
所述制剂和/或肽在热处理期间和之后可以是稳定的。如本文所公开的，热处理(例如高压灭菌)期间和之后的稳定性可以指减少或抑制降解、生物活性和化学活性。例如，所述制剂和/或肽可以经受热处理而不发生降解、生物活性的丧失或化学活性的丧失。生物活性可以指本文公开的肽的任何生物活性特性。在一些实施方案中，生物活性可以指抗微生物活性。化学活性可以指本文公开的肽的任何化学或物理化学特性。在一些实施方案中，化学活性可以指本文公开的肽的自组装能力和/或剪切稀化特性。因此，所述制剂和/或肽可以经受热处理而不丧失抗微生物活性、自组装或剪切稀化特性。在某些实施方案中，热处理可以增强肽和/或制剂的一种或多种生物活性或化学活性。例如，热处理可以增强肽或制剂的抗微生物活性、自组装或剪切稀化特性。
[0347]
所述制剂可以是无菌的。例如，所述制剂可以保持基本无菌而无需添加防腐剂。所述制剂可以基本无菌而无需伽马辐照处理。所述制剂可以基本无菌而无需电子束处理。
[0348]
所述制剂可以具有预先确定的保质期。“保质期”可以指制剂在给定条件下储存后可保持稳定和/或维持疗效的时间长度。所述制剂和/或水凝胶在-20℃至150℃的温度下可以具有至少约1年的保质期。例如，所述制剂和/或水凝胶在室温下(约20℃至25℃)可以具有至少约1年的保质期。所述制剂和/或水凝胶在室温下可以具有至少约2年、约3年、约4年、约5年或约6年的保质期。所述制剂和/或水凝胶可以在高至约25psi，例如高至约15psi的压力下是稳定的。
[0349]
所述肽能够在2℃至40℃的温度下自组装。例如，所述肽能够在温度为2℃至20℃、20℃至25℃或36℃至40℃的环境中自组装。
[0350]
所述肽可以在高于40℃的温度下基本上不组装。例如，肽制剂可以在40℃至150℃的温度下基本上为液体。肽制剂可以在40℃至125℃或高达150℃的温度下基本上为液体且热稳定。可以控制温度以处理所述制剂。例如，所述制剂可以被加热到高于40℃的温度，以便在液体状态下包装、处理和/或施用。
[0351]
所述制剂可以按所需的施用途径配制。例如，所述制剂可以被配制用于局部或肠外施用。特别是，所述制剂可以被工程化为具有适合局部施用或肠外施用的粘度。用于局部施用的制剂可以被配制成承受施用部位或靶部位的环境和机械压力。用于肠外施用的制剂可以被配制成减少从施用部位到靶部位的迁移。在其他实施方案中，用于肠外施用的制剂可以被配制成引发从施用部位到靶部位的迁移。所述制剂可以被配制成通过特定的递送装置施用。例如，所述制剂可以被配制成通过喷雾器、滴管或注射器施用。所述制剂可以被配制成通过注射或导管施用。
[0352]
表1包括三个示例性肽制剂样品的分析表征。这些示例性肽具有富含精氨酸的序列，包括两个赖氨酸氨基酸残基。这些值是通过常规检测方法检测的。表示为“n.d.”的组分低于检测限。可以选择肽纯化、残留溶剂、肽含量和水含量来控制水凝胶的抗微生物活性和细胞膜破坏潜力。
[0353]
表1：示例性的肽制剂
[0354][0355]
如表2所示，纯化的肽和水凝胶可以基本上不含内毒素，不需要添加防腐剂或灭菌。因此，在一些实施方案中，肽制剂可以基本上不含防腐剂。
[0356]
表2：不同组成的内毒素水平
[0357] 410nm处的od内毒素水平(eu/ml)不含内毒素的水-0.000333333-0.016148109ro水3.4366666671.267607913tap水3.4636666671.2776927缓冲溶液-0.056-0.036940201肽0.006-0.013782542肽凝胶0.015-0.010420946
[0358]
自组装的肽水凝胶
[0359]
可以提供本文公开的制剂来自组装成具有预选特性的水凝胶。聚合物水凝胶可以具有基本上生理性的ph。通常，聚合物水凝胶的ph可以在4.0和9.0之间，例如在7.0和8.0之间，7.2和7.8之间，或7.3和7.5之间。
[0360]
聚合物水凝胶可以是基本透明的。例如，聚合物水凝胶可以基本上没有浊度，例如，可见的浊度。可见的浊度可以通过宏观和微观光学成像来确定。聚合物水凝胶可以基本上没有肽聚集体(肽簇)，例如，可见的肽聚集体。可见的肽聚集体可以通过静态光散射(sls)和uv-vis测试来确定。“透明度”可以指水凝胶通过可见光的能力。基本透明的水凝胶在约205nm至约300nm的波长下可以具有约0.1至3.0
±
1.5的uv-vis光吸光度。
[0361]
组装的聚合物水凝胶可以具有纳米多孔结构。聚合物水凝胶可以是水合的或基本饱和的。在一些实施方案中，水凝胶可以具有90％w/v至99.9％w/v的水溶液，例如，92％w/v至99.9％w/v或94％w/v至99.9％w/v。纳米多孔结构可以被选择为对靶标微生物不可透过。因此，水凝胶可用于封装靶标微生物或保持靶部位不受靶标微生物的影响。纳米多孔结构可以被选择为允许靶部位的气体交换。聚合物水凝胶可以具有孔径在1nm和1000nm之间的纳米多孔结构，如所选择的(例如，基于靶标微生物、靶细胞或所需功能)。聚合物水凝胶可以具有1nm至100nm的原纤维宽度，如所选择的。
[0362]
水凝胶通常可以是阳离子性质的。在其他实施方案中，水凝胶可以是阴离子性质的。在其他实施方案中，水凝胶可以被混合成包含阳离子和/或阴离子组分的多结构域。水凝胶可以被设计成具有预选的电荷。本文公开的自组装的肽水凝胶可以调整到具有支持移植的治疗性细胞的活力和功能的生物功能，表现出允许在术中轻松和快速施用的剪切稀化
的机械特性，表现出控制伤口生物负荷的抗微生物特性，表现出治疗或抑制病毒感染的抗病毒特性，和/或表现出治疗或抑制真菌感染的抗真菌特性。
[0363]
特别是，肽的序列和结构可以包括形成纳米纤维的肽官能团，它们进一步自组装形成大分子结构(图1a-1b)。所述肽可以响应于环境刺激而自组装。所述肽可以在基本生理性的缓冲液如介质或盐水的存在下而自组装。肽水凝胶可以组装成类似于天然纤维状胶原蛋白的细胞外支架基质(图1a-1b)。图1a-1b显示了凝胶基质自组装的示意图和示例性的纳米结构。如图1a所示，当加入离子缓冲液时，单个肽纳米纤维自组装成凝胶。图1a包括tem图像，表明肽凝胶的纳米结构和孔径看起来类似于天然ecm(胶原蛋白)。图1b包括术中混合装置的示意图，所述装置用于将细胞悬浮液与肽凝胶基质混合。负载细胞的基质在图1b中的示意性sem图像展示了细胞在基质中的示例性概念。
[0364]
所述肽可以通过设计被工程化为自组装成基本生物相容的水凝胶。所述肽可以通过设计被工程化为自组装成细胞友好型水凝胶。在某些实施方案中，细胞友好型聚合物水凝胶可以是非炎性和/或无毒的。细胞友好型聚合物水凝胶可以是基本可生物降解的。所述肽可以通过设计被工程化为基本抗微生物的、抗病毒的和/或抗真菌的。
[0365]
短肽和/或肽官能团可以通过合成方式生产。因此，这些肽可以提供制造、扩大规模和质量控制的便利。通常，可以在不使用植物或动物表达系统的情况下制造这些肽。这些肽可以基本上不含天然存在的内毒素和传播疾病的病原体。此外，肽的序列和官能团可以被调整，允许控制和设计组装的水凝胶的多功能性，包括物理和化学特性，如生物降解、机械特性和生物活性方面。
[0366]
所述肽可以具有被工程化用于靶标指示的官能团。例如，所述肽可以具有生物活性官能团。靶标指示可以是靶组织的组织工程。靶标指示可以包括，例如，细胞培养、细胞递送、伤口愈合和/或生物膜处理。因此，所述肽可以通过设计被工程化为自组装成基本生物相容的水凝胶。肽官能团可以具有约3至约30个氨基酸残基。例如，肽官能团可以具有约3至约20个氨基酸残基。肽官能团可以具有选自rgd、ikvav、yigsr、lkktetq、snkpgvl、pkpqqffglm、gkltwqelyqlkykgi和ggg的序列。
[0367]
在一些实施方案中，所述肽可以包括选自接头和间隔区的修饰。肽“接头”通常可以指包括在内的连接肽的多个结构域的短氨基酸序列。肽“间隔区”通常可以指设置为连接和控制组装的蛋白质的多个结构域的空间关系的氨基酸序列。接头或间隔区可以是疏水性的或亲水性的。接头或间隔区可以是刚性的或柔性的。示例性的间隔区包括氨基己酸(ahx)(疏水性)和聚(乙烯)二醇(peg)(亲水性)。富含甘氨酸的间隔区通常是柔性的。
[0368]
示例性的生物活性官能团包括层粘连蛋白、骨髓归巢(bone marrow homing)、胶原蛋白(如i、ii和vi)、骨髓净化(bone marrow purification)和rgd/纤连蛋白类型。示例性的生物活性官能团包括vegf、p物质(substance p)、胸腺素β、心脏归巢肽、骨髓归巢肽、骨桥蛋白(osteopontin)和成骨肽(ostegenic peptide)。示例性的生物活性官能团包括以下表3-5中的那些。
[0369]
表3：示例性的生物活性官能团
[0370]
ecm基序ecm类型-ggpdsgr层粘连蛋白-ggsdpgyigsr层粘连蛋白-ggskppgtss骨髓归巢-ggdgea胶原蛋白ii-ggpfsstkt骨髓归巢-ggflgfpt骨髓净化-ggrgdsrgd/纤连蛋白-ggikvav层粘连蛋白-ggfpdergvegpgp胶原蛋白i-ggprgdsgyrgdsf胶原蛋白vi
[0371]
表4：示例性的生物活性官能团
[0372][0373][0374]
表5：示例性的生物活性官能团
[0375]
[0376]
[0377][0378]
所述肽可以具有控制或改变肽或制剂的电荷或ph的官能团。预选的电荷或ph可以提供生物活性特性。在一些实施方案中，预选的电荷或ph可以提供抗微生物、抗真菌和/或抗病毒特性。在一些实施方案中，预选的电荷或ph可允许制剂被施用到相容的靶部位。
[0379]
所述肽可以具有抗微生物官能团。抗微生物官能团可以包括抗微生物残基的保守序列。在其他实施方案中，抗微生物官能团可以与自组装官能团重叠或部分重叠。在至少一个实施方案中，所述肽可以具有交替的或基本交替的抗微生物和自组装残基。
[0380]
所述肽可以具有抗真菌官能团。抗真菌官能团可以包括抗真菌残基的保守序列。在其他实施方案中，抗真菌官能团可以与自组装官能团重叠或部分重叠。在至少一个实施方案中，所述肽可以具有交替的或基本交替的抗真菌和自组装残基。
[0381]
所述肽可以具有抗病毒官能团。抗病毒官能团可以包括抗病毒残基的保守序列。在其他实施方案中，抗病毒官能团可以与自组装官能团重叠或部分重叠。在至少一个实施方案中，所述肽可以具有交替的或基本交替的抗病毒和自组装残基。
[0382]
自组装水凝胶可以被设计成在靶部位具有细胞保护特性。特别是，自组装水凝胶可以被设计成对外来微生物如病原微生物具有防护作用。自组装水凝胶可以被设计成对真菌生物体有防护作用。自组装水凝胶可以被设计成对来自环境免疫细胞的免疫攻击具有防护作用。水凝胶的抗微生物、抗病毒、抗真菌和/或保护特性可以不对靶部位的细胞的活力、生长或功能产生大量影响。
[0383]
水凝胶的保护特性可以通过改变肽的净电荷来工程化。在一些实施方案中，可以通过控制阳离子颗粒或肽的存在或不存在、阴离子颗粒或肽的存在或不存在、缓冲液、盐、肽浓度、肽纯度以及肽反离子的存在或不存在中的一个或多个来改变净电荷。所述肽可以被工程化为具有带正电荷、带负电荷、疏水性或亲水性的氨基酸残基。在示例性的实施方案中，所述肽可以通过包含在基本中性ph水平下带正电荷的氨基酸来提供抗微生物、抗病毒和/或抗真菌特性。此类氨基酸可以包括，例如，精氨酸、赖氨酸、色氨酸和组氨酸。
[0384]
肽水凝胶可以额外表现出抗微生物特性。通常，抗微生物特性可以通过包含抗微生物官能团来提供。在一些实施方案中，抗微生物官能团可以包括富含阳离子的肽序列。在示例性的实施方案中，抗微生物官能团可以包括不同比例的赖氨酸(k)和精氨酸(r)(图4)。抗微生物的肽水凝胶可以针对革兰氏阳性和阴性细菌提供抗微生物效果，包括例如大肠杆菌(图4)、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。图4是显示具有8个精氨酸残基(pep8r)、6个精氨酸残基(pep6r)、4个精氨酸残基(pep4r)和2个精氨酸残基(pep2r)的不同浓度的肽的抗微生物活性(表示为施用24小时后剩余的不存活的大肠杆菌的百分比)的图表。
[0385]
肽水凝胶可以表现出广谱抗微生物活性。根据某些实施方案，肽水凝胶可以减少接种了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的部分皮层伤口的体内生物负荷(图5)。图5显示
了初步数据，证明了用肽凝胶处理生物发光mrsa(us300)的抗微生物益处。图(a)和(b)显示了用100μl凝胶和100μl us300(1x108cfu/ml)平铺的孔，显示了与对照相比，肽凝胶在1小时和3小时的抗微生物活性(n＝3)。图(c)显示了部分皮层烧伤的小鼠接种了50μl 108cfu/ml的us300，并用肽凝胶处理。如图(c)所示，小鼠在施用后3小时表现出生物负荷的减少。
[0386]
特别是，肽水凝胶可以表现出针对外来和/或病原微生物的抗微生物特性，并与施用的细胞相容。例如，这种肽水凝胶可以与哺乳动物的红细胞和巨噬细胞相容。在一个示例性实验中，当细菌和哺乳动物细胞同时被接种到本文公开的肽水凝胶上时，细菌被杀死，而哺乳动物细胞在24小时后仍有》90％的活力，并可继续增殖。
[0387]
在一些实施方案中，所述肽可以包括官能团，以增强或促进与msc功能相容或协同的生物活性。例如，在某些实施方案中，肽序列可以包含模拟纤连蛋白的官能团，并比其他ecm配体更大程度地促进人类msc的粘附和增殖。在某些实施方案中，肽序列可以含有包含神经肽的官能团，以通过抑制炎症和导致血管生成来促进糖尿病伤口愈合。在某些实施方案中，肽序列可以含有包含神经肽的官能团，以导致msc的增殖和迁移，以及增强msc的免疫调节功能。在某些实施方案中，肽序列可以含有官能团，以通过增加血管生成和导致msc增殖和迁移来改善伤口愈合。在某些实施方案中，肽序列可以缺乏抑制蛋白水解活性的官能团。所述肽可以被工程化为含有本领域技术人员已知的其他官能团。
[0388]
在体外，本文公开的肽水凝胶可允许细胞在三维构建体中侵入和增殖，使水凝胶可以充当组织再生的支架基质。肽水凝胶在皮下植入后可显示生物相容性。实验显示，皮下施用后7天，凝胶植入部位的细胞碎片或死细胞极少。实验进一步显示，与新生组织相比，凝胶和周围组织中的细胞因子浓度增加极少，这表明凝胶的急性炎症效应不明显。
[0389]
包含肽制剂的试剂盒
[0390]
本文描述了包含肽制剂的试剂盒。所述试剂盒可以包括肽制剂和缓冲溶液。缓冲液可以被配置为在施用肽之前或与之同时导致肽的自组装。肽制剂和缓冲液中的每一种都可以包括在小瓶或腔室中。例如，所述试剂盒可以包括预填充的包装，所述包装含有一种或多种制剂和缓冲液。所述试剂盒可以包括一个或多个用于使用和/或递送肽制剂的装置。所述试剂盒可以包括混合装置。所述试剂盒可以包括递送装置。在某些实施方案中，递送装置和/或混合装置可以是预填充的包装，例如，所述试剂盒可以包括预填充的注射器、喷雾瓶、安瓿或管。图26是将制剂包装在最终使用的容器中的照片。图26的示例性的最终使用的容器是预填充的注射器。最终使用的容器可作为递送装置或混合装置使用。所述试剂盒和/或所述试剂盒的任何组分可以是无菌的或灭菌的。例如，所述试剂盒和/或任何组分可采用高压灭菌法，任选地采用终端高压灭菌法进行灭菌。
[0391]
所述试剂盒的任何一个或多个组分可以是高压灭菌的。包装好的试剂盒可以是高压灭菌的。所述试剂盒的任何一个或多个组分可以是灭菌的或无菌的。例如，所述试剂盒的任何一个或多个组分可以通过高压灭菌器进行灭菌。灭菌后的一个或多个组分可以被包装在基本密闭的容器中。在一些实施方案中，包装好的试剂盒可以例如通过高压灭菌器进行灭菌。
[0392]
在某些实施方案中，所述试剂盒可以包括干燥或粉末形式的纯化的肽。例如，纯化的肽可以被冻干。所述试剂盒可以包括与纯化的肽组合以得到肽制剂的生物相容性溶液。在其他实施方案中，所述试剂盒可以包括将纯化的肽与生物相容性溶液组合以得到制剂的
说明。所述试剂盒可以额外地包括缓冲溶液。
[0393]
所述试剂盒可以包括使用说明。特别是，所述试剂盒可以包括，任选地在混合装置中，将缓冲液与制剂组合以形成水凝胶的说明。可以指示用户在使用点组合制剂和缓冲液。在一些实施方案中，可以指示用户在施用前或与施用同时组合制剂和缓冲液。可以指示用户将制剂和缓冲液单独应用于靶部位。
[0394]
所述试剂盒可以额外包括在推荐的储存条件下储存试剂盒的说明。例如，所述试剂盒可以包括在室温(约20-25℃)下储存制剂或任何组分的说明。所述试剂盒可以包括在冷藏温度(约1-4℃)下储存制剂或任何组分的说明。所述试剂盒可以包括在冷冻温度(约0至-20℃)下储存制剂或任何组分的说明。所述试剂盒可以包括在体温(约36-38℃)下储存制剂或任何组分的说明。所述试剂盒可以包括在凉爽和干燥条件下储存制剂或任何组分的说明。
[0395]
所述试剂盒可以额外包括制剂或任何组分的失效指示。失效指示可以是包装后约1年。失效指示可以是包装后约6个月至约10年，例如，包装后约1年至约5年。
[0396]
所述试剂盒可以包括与制剂组合施用的额外组分。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括在施用前或与施用同时组合额外组分的说明。所述试剂盒可以包括向靶部位单独施用制剂和额外组分的说明。额外组分可以是或包括抗细菌制剂、抗病毒制剂、抗真菌制剂、抗肿瘤制剂、抗炎制剂、细胞培养基、细胞培养血清、抗臭制剂、镇痛剂、止血制剂、局部麻醉剂或止痛制剂。在特定的实施方案中，所述试剂盒可以包括用于与本文所述的制剂组合施用的细胞培养物。在一些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括敷料，例如局部敷料、屏障敷料和/或伤口敷料。
[0397]
所述试剂盒可以包括一种或多种配置为导致水凝胶的剪切稀化的组分。可采用混合装置或递送装置(如下所述)，通过机械搅拌导致水凝胶的剪切稀化。所述试剂盒可以包括一个或多个选自温度控制装置、ph控制添加剂、离子螯合剂组合物、溶剂、声音控制装置、冻干装置和空气干燥装置的部件，以导致剪切稀化。例如，所述试剂盒可以包括加热器或冷却器、酸或碱的来源、离子螯合剂的来源、溶剂的来源、扬声器或声音发射器、冻干机或压缩空气干燥器或风扇。
[0398]
混合装置
[0399]
本文公开了用于在照护点制备水凝胶的混合装置。所述装置可以是多室装置。在示例性的实施方案中，所述装置可以是双室装置。所述装置可以包括用于肽制备的第一室。所述制剂可以包括生物相容性溶液中的自组装肽。所述装置可以包括用于缓冲溶液的第二室。第一室和第二室可以被屏障隔开，以防止第一室和第二室之间的液体交流。所述装置可以任选地进一步包括混合室。混合室可以与第一室和第二室进行流体连接。在混合之前，混合室可以通过屏障与第一室和/或第二室隔开。在其他实施方案中，混合装置可以被配置为直接混合第一和第二室的内容物。在一些实施方案中，所述装置可以包括用于向受试者施用的额外的制剂或化合物的第三室。第三室可以与第一室、第二室和/或混合室隔开。第三室可直接或通过混合室与第一室和/或第二室流体连接。
[0400]
所述装置可以是一次性使用的装置。所述装置可以是多次使用的装置。
[0401]
在示例性的实施方案中，第一、第二或第三室中的每一个可以是注射器筒。每个桶可以具有相关的柱塞来进行搅拌。每个桶可以密封地安装在连接适配器上，所述适配器形
成混合室。密封安装可以是，例如，鲁尔锁或鲁尔锥形连接。
[0402]
所述制剂和缓冲液可以被搅拌或以其他方式混合，以形成均匀或基本均匀的混合物，导致水凝胶化。在一些实施方案中，可以通过在第一室和第二室之间来回转移混合物来搅拌制剂和缓冲液。在一些实施方案中，水凝胶表现出剪切稀化特性，因此在搅拌过程中，混合物基本上是液体。沉淀后，混合物可形成固体或凝胶材料。
[0403]
在示例性的实施方案中，所述装置可以被配置为在使用点制备细胞移植物。在使用中，第一室可以包括细胞制剂，第二室可以包括肽制剂。细胞制剂可以包括缓冲液。替代地，第三室可以包括缓冲液。启动后，细胞制剂和肽制剂可以混合或接触，即在混合室中。细胞可以悬浮在肽溶液中，形成包含自组装肽的细胞悬浮液。
[0404]
细胞制剂和肽制剂可以与缓冲液混合，形成缓冲悬浮液。缓冲悬浮液可以如上所述进行搅拌，导致水凝胶的自组装。缓冲悬浮液可以被搅拌以分散细胞，形成均匀或基本均匀的混合物。均匀或基本均匀的悬浮液可以自组装，以形成水凝胶细胞移植物。
[0405]
混合装置可以是静态混合装置。静态混合器通常可以包括在不移动部件的情况下基本连续混合制剂的装置。例如，静态混合器可以包括圆柱形或矩形的外壳，每个待混合的部件有一个或多个入口，混合物有一个出口。静态混合器可以包括一个板式混合器。
[0406]
混合装置通常可以由惰性、热稳定的材料形成或用其作衬垫。在某些实施方案中，所述材料可以是不透明的和/或抗碎的。
[0407]
递送装置
[0408]
在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括递送装置。例如，所述试剂盒可以包括注射器或导管。所述试剂盒可以包括滴管。所述试剂盒可以包括喷雾器，例如与瓶子结合。喷雾装置可以是，例如，鼻腔喷雾器。所述试剂盒可以包括管或安瓿。所述试剂盒可以包括薄膜，例如。可以根据靶标指示选择递送装置的类型。此外，可以根据靶标指示选择递送装置的特性。例如，用于局部递送制剂的注射器可以较用于注射制剂的注射器有更大的通道。
[0409]
在一些实施方案中，注射器可用于制剂的局部应用。在其他实施方案中，注射器可以包括用于肠外应用的针头。注射器的针头可以具有7至34之间的birmingham系统规格。导管可用于肠外应用。导管的针头可以具有14至26之间的birmingham系统规格。所述肽可以被配制用于通过特定规格的针头施用。例如，所述肽可以被选择为具有可变的粘度，从而允许制剂通过特定规格的针头应用。
[0410]
在一些实施方案中，喷雾瓶可用于制剂的局部应用。喷雾瓶可以包括用于制剂的容器和喷嘴。喷嘴可以被配置为靶向递送到靶组织。例如，用于向上皮组织靶向递送的喷嘴可以具有基本平坦的表面，用于向鼻内组织靶向递送的喷嘴可以具有基本锥形的表面。喷嘴可以被配置为递送预先确定的量的制剂。在一些实施方案中，喷嘴可以被配置为以基本单向流动的方式递送制剂，任选地，与喷雾瓶的方向无关。
[0411]
喷嘴可以被配置为减少逆向流动。在某些实施方案中，喷嘴可以是弹簧加载的。在其他实施方案中，喷嘴可以是压力驱动的。可以根据制剂的可变粘度选择驱动压力。例如，驱动压力可以被选择为足以通过喷嘴分配水凝胶。
[0412]
薄膜可用于制剂的局部应用。薄膜可以被制剂浸透。薄膜可用作屏障敷料和/或止血剂。在一些实施方案中，薄膜可以与屏障敷料一起使用。
[0413]
递送装置可以是一次性使用的装置。递送装置可以是多次使用的装置。递送装置
可以包括用于肽制剂的第一室。所述制剂可以包括生物相容性溶液中的自组装肽。递送装置可以包括用于缓冲溶液的第二室。第一室和第二室可以被屏障隔开，以防止第一室和第二室之间的流体交流。递送装置可以被构造和设置为同时或基本同时施用肽制剂和缓冲溶液。在一些实施方案中，递送装置可以包括用于向受试者施用的额外的制剂或化合物的第三室。第三室可以与第一室和/或第二室隔开。
[0414]
递送装置通常可以由惰性、热稳定的材料形成或用其作衬垫。在某些实施方案中，所述材料可以是不透明的和/或抗碎的。
[0415]
涂覆的医疗或手术装置
[0416]
在一些实施方案中，医疗或手术工具的至少一部分外表面可以涂覆有本文公开的制剂或水凝胶。涂层可使工具的外表面表现出抗微生物特性，减少感染的发生率。涂层可使工具的外表面具有生物相容性或细胞相容性，减少接触后的排斥和不良反应。
[0417]
手术工具可以是手术器械。例如，所述工具可以是抓取器(如镊子、夹钳或咬合器)、针驱动器或持针器、缝合器或缝合针、牵引器(retractor)、牵张器(distractor)、定位器、立体定向装置、机械切割器(如手术刀、柳叶刀(lancet)、钻头、锉刀、套管针、结扎束(ligasure)、谐波手术刀、外科剪刀或骨钳)、扩张器、窥器、吸头或管、密封装置(如外科订书机)、灌洗或注射针、针头和针管(tip and tube)、动力装置(如钻机、颅骨钻机或皮刀(dermatome))、窥镜或探针(包括光纤内窥镜和触觉探针)、光学、电子和机械装置的载体或应用者、超声组织破坏器、低温切片机、切割激光导引器或测量装置(如尺子或卡尺)。其他手术工具或器械也在本公开的范围内。
[0418]
医疗或外科工具可以是可植入的工具。例如，医疗或手术工具可以是可植入的装置，如植入式心律转复除颤器(icd)、起搏器、子宫内避孕器(iud)、支架，如冠状动脉支架、耳管或目镜。其他可植入的工具也在本公开的范围内。可植入的医疗或手术工具可以是假体或假体装置的一部分，如假体髋关节、膝关节、肩关节、或骨或假体肢体的一部分。可植入的医疗或外科工具可以是机械工具，如螺丝、杆、针、板、盘或其他机械支撑。可植入的医疗或手术工具可以是美容工具，如乳房植入物、小腿植入物、臀部植入物、下巴植入物、颧骨植入物或其他整形或重建手术植入物。其他医疗或可植入的工具也在本公开的范围内。
[0419]
涂层的制剂和/或厚度可以被选择为暂时性的，例如，在预先确定的时间段内降解，例如，少于约3个月、少于约1个月或少于约2周。涂层的制剂和/或厚度可以被选择为半永久性的，例如，在约3个月至3年或约6个月至2年的预先确定的时间段内降解。涂层的制剂和/或厚度可以被选择为永久性的，例如，具有2年以上或3年以上的寿命，或具有比医疗或手术工具与受试者接触的预先确定的时间段更长的寿命。
[0420]
通过施用肽水凝胶进行治疗的方法
[0421]
在一些实施方案中，本文公开的制剂可根据预先确定的方案施用。本文公开的制剂可以每天、每周、每月、每年或每两年施用一次。
[0422]
本文公开的制剂可以提供即时释放效果。例如，活性成分的起效时间可少于一分钟、数分钟或少于一小时。
[0423]
本文公开的制剂可以提供延迟释放效果。例如，活性成分的起效时间可超过一小时、数小时、一天以上、数天以上或一周以上。
[0424]
本文公开的制剂可以提供延长释放效果。例如，这些制剂可在一天以上、数天以
上、一周以上、一个月以上、数月或多达约6个月内有效。
[0425]
本文公开的制剂可以与治疗相关疾病或病症、或相关疾病或病症的症状的医疗方法结合施用。例如，这些制剂可以与批准用于治疗相关疾病或病症、或相关疾病或病症的症状的医疗方法结合施用。这些制剂可以与通常用于治疗相关疾病或病症、或相关疾病或病症的症状的医疗方法结合施用。
[0426]
本文公开的制剂可以与手术治疗联合施用。可以施用本文公开的制剂来治疗与手术治疗相关的伤口和/或预防或处理生物膜。
[0427]
本文公开的制剂可以与抗炎剂或抗炎治疗联合施用。抗炎剂可以指减少或抑制局部或全身炎症的组合物或治疗。抗炎剂可以包括，例如，非甾体抗炎药(nsaid)、抗白三烯、免疫选择性抗炎衍生物(imsaid)和/或低温治疗。
[0428]
本文公开的制剂可以与抗细菌剂、抗病毒剂和/或抗真菌剂联合施用。此类药剂可以指分别消除或抑制细菌、病毒和/或真菌生物体增殖的组合物或治疗。示例性的抗细菌剂包括抗生素和局部防腐剂和消毒剂。抗病毒剂可以是靶标特异性抗病毒剂或广谱抗病毒剂(如瑞德西韦、利托那韦/洛匹那韦)。示例性的局部抗病毒剂包括局部防腐剂和消毒剂。示例性的抗真菌剂包括抗真菌抗生素、合成剂(如氟胞嘧啶、唑类、丙酰胺类和棘白菌素类)以及局部防腐剂和消毒剂。
[0429]
可以施用本文公开的制剂来治疗伤口，例如，急性、亚急性或慢性伤口。伤口可以是手术伤口、裂伤、烧伤、咬伤/蜇伤、血管伤口(静脉、动脉或混合)、糖尿病伤口、神经性伤口、压迫性伤口、缺血性伤口、湿气相关皮炎，或由病理过程导致。在某些实施方案中，可以以有效治疗糖尿病足溃疡(dfu)的量施用所述制剂。在某些实施方案中，可以以有效治疗胃肠道伤口如肛瘘、憩室炎或溃疡的量施用所述制剂。特别是，可以以有效促进无感染伤口闭合的量施用所述制剂。
[0430]
本文公开的制剂可以与提供麻醉和/或止痛的治疗或药剂(例如局部麻醉剂)联合施用。“麻醉剂”可以指提供暂时丧失知觉或意识的组合物。麻醉剂可以是全身麻醉剂(例如gaba受体激动剂、nmda受体拮抗剂或双孔钾通道激活剂)或局部麻醉剂(例如酯基剂、酰胺基剂和天然衍生剂)。
[0431]
这些制剂可以与镇痛剂或止痛剂联合施用。“镇痛剂”可以指用于全身治疗或抑制疼痛的组合物。镇痛剂可以包括抗炎剂或阿片类药物。
[0432]
本文公开的制剂可以与止血剂联合施用。“止血剂”可以指控制出血的工具或组合物。示例性的止血剂组合物包括基于胶原蛋白的药剂、基于纤维素的药剂和基于壳聚糖的药剂。
[0433]
本文公开的制剂可以与增强细胞或组织移植疗法的治疗或药剂联合施用。在某些实施方案中，本文公开的制剂可以与防止或抑制细胞死亡和/或控制或减少炎症的治疗或制剂联合施用。本文公开的制剂可以与细胞培养基或细胞培养血清联合施用。
[0434]
所施用的肽水凝胶可以具有即时的局部效果。例如，所施用的制剂可以通过封闭伤口或填充空隙来提供局部伤口愈合或损伤治疗效果。在某些实施方案中，所施用的水凝胶可以具有全身效果。例如，所施用的水凝胶可以使细胞迁移或在细胞移植物和环境细胞之间进行交流，从而产生全身效果。在其他实施方案中，所施用的水凝胶可以使细胞产物或副产物递送，从而产生全身效果。所施用的肽水凝胶在局部施用部位可以具有抗微生物、抗
病毒和/或抗真菌特性。在其他实施方案中，所施用的肽水凝胶可以提供全身性抗微生物、抗病毒和/或抗真菌特性。
[0435]
所施用的肽水凝胶可以在局部施用部位具有长期、持续的抗微生物、抗病毒和/或抗真菌特性。所述肽可以被设计成形成具有直接接触的抗微生物、抗病毒、抗真菌效果的水凝胶。因此，水凝胶可以根除在靶部位直接接触水凝胶的微生物。水凝胶可以基本上不含封装的抗微生物剂、抗病毒剂和/或抗真菌剂。此外，只要水凝胶与靶组织接触，局部抗微生物、抗病毒和/或抗真菌效果就会持续存在。图2包括显示靶部位的持续抗微生物、抗病毒和/或抗真菌效果的图。
[0436]
为了提供全身性抗微生物、抗病毒和/或抗真菌效果，所述肽水凝胶可以额外包括封装的抗微生物剂、抗病毒剂和/或抗真菌剂。这种水凝胶的施用通常可以提供：(1)如前所述，通过直接接触进行的局部抗微生物、抗病毒和/或抗真菌治疗，以及(2)作为封装的治疗剂的载体进行的全身性抗微生物、抗病毒和/或抗真菌治疗。
[0437]
本文公开的制剂可以被配制成止血剂、清创剂或屏障敷料(例如，抗微生物、抗真菌或抗病毒屏障敷料)。这些制剂可以被配制用于伤口治疗。可以通过使用所述制剂治疗的示例性伤口包括部分皮层伤口和全层伤口(例如压疮、腿部溃疡、糖尿病溃疡)、一级和二级烧伤、隧道式/埋藏式伤口、手术伤口(例如，与供体部位/移植物、组织和细胞移植物、moh’s手术后、激光手术后、足部、声音裂开有关的)、创伤伤口(例如擦伤、撕裂伤、烧伤、皮肤撕裂)、胃肠道伤口(例如肛瘘、憩室炎、溃疡)和引流伤口。这些制剂可以被配制用于向预先确定的靶组织如间质组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织、胚胎组织、真皮组织、骨组织、牙齿组织、角膜组织、皮肤组织、外皮组织、软组织和硬组织或生物液体施用。
[0438]
治疗微生物感染的方法
[0439]
所述制剂可以被配制成在靶部位施用时提供抗微生物特性。例如，自组装的聚合物水凝胶可以具有抗微生物特性。如本文所公开的，“抗微生物”特性可以指对微生物群体的影响，例如，杀死或抑制来自微生物群体的一种或多种微生物。因此，本文公开了治疗微生物感染或杀死或抑制靶标微生物增殖的方法。“增殖”通常可以指生物体的代谢或繁殖活动。本文公开了减少或消除微生物污染的方法。本文公开了管理微生物生物负荷的方法。这些方法通常可以包括以有效促进靶标微生物失活的量施用所述制剂。特别地，包含约3.0％w/v或更少，例如，1.5％w/v或更少，或1.0％w/v或更少的肽的制剂，可以在靶部位提供抗微生物特性。
[0440]
这些方法可以包括确定需要治疗微生物污染、定植或感染的受试者。通常，微生物定植或感染可以由病原微生物(致病微生物)的增殖引起。微生物污染可以通过一种或多种微生物的存在来确定。在一些实施方案中，这些方法可用于预防或治疗微生物定植或感染。微生物定植可以指一种或多种微生物的建立的菌落。微生物感染可以指一种或多种已通过临床评估进行诊断的微生物的建立的菌落。微生物定植或感染可以是局部的或全身的。通常，如果不提供适当的治疗，微生物污染可能发展为微生物定植或感染。
[0441]
可以以有效处理生物膜或微生物感染的量施用所述制剂。这些方法通常可以包括以有效促进病原微生物失活的量施用所述制剂。在某些实施方案中，病原微生物可以是病原性细菌生物体。例如，所述制剂和方法可有效促进广谱(革兰氏阳性和革兰氏阴性)细菌的失活。病原微生物可以是选自芽孢杆菌(bacillus)、巴尔通氏体(bartonella)、博代氏杆
菌(bordetella)、包柔氏螺旋体(borrelia)、布鲁氏菌(brucella)、弯曲杆菌(campylobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜衣原体(chlamydophila)、梭状芽孢杆菌(clostridium)、棒状杆菌(corynebacterium)、肠球菌(enterococcus)、埃希氏菌(escherichia)、弗朗西斯菌(francisella)、嗜血杆菌(haemophilus)、螺杆菌(helicobacter)、军团菌(legionella)、钩端螺旋体(leptospira)、李斯特菌(listeria)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、奈瑟氏菌(neisseria,)、假单胞菌(pseudomonas)、立克次氏体(rickettsia)、沙门氏菌(salmonella)、志贺氏菌(shigella)、葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌(streptococcus)、密螺旋体(treponema)、脲原体(ureaplasma)、弧菌(vibrio)和耶尔森氏菌(yersinia)的属的物种。
[0442]
所述制剂可以与外科手术联合施用。这些方法可以包括以有效对靶部位至少90％的靶标微生物进行灭菌的量施用所述制剂。例如，这些方法可以包括以有效在靶部位对至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％、至少99.99％或至少99.999％的靶标微生物进行灭菌的量施用所述制剂。示例性的靶部位包括上皮组织、胃肠系统组织、呼吸系统组织、心脏系统组织、神经系统组织、生殖系统组织、眼组织、听觉组织和血流。上皮组织可以包括，例如，表皮、真皮、头发和指甲。然而，额外的靶部位可以通过本文公开的方法进行治疗。如本文所公开的，灭菌可以指消除、去除、杀死或灭活靶部位的微生物的任何过程。
[0443]
治疗真菌感染的方法
[0444]
所述制剂可以被配制成在靶部位施用时提供抗真菌特性。例如，自组装的聚合物水凝胶可以具有抗真菌特性。如本文所公开的，“抗真菌”特性可以指对真菌群体的影响，例如，杀死或抑制来自真菌群体的一种或多种生物体。因此，本文公开了治疗真菌感染或抑制真菌生物体增殖的方法。这些方法通常可以包括以有效促进真菌生物体失活的量施用所述制剂。本文公开了减少或消除真菌污染的方法。在示例性的实施方案中，包含约3.0％w/v或更少的肽的制剂，例如1.5％w/v或更少，或1.0％w/v或更少，可以在靶部位提供抗真菌特性。
[0445]
这些方法可以包括确定需要治疗真菌污染、定植或感染的受试者。在某些实施方案中，可以以有效治疗受试者的生物膜、体癣、念珠菌病、芽生菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、隐球菌病、副球孢子菌病(paracoccidioidomycosis)、曲霉菌病、曲霉肿(aspergilloma)、脑膜炎、毛霉菌病、肺囊虫肺炎(pcp)、篮状菌病(talaromycosis)、孢子丝菌病(sporotrichosis)和真菌性足菌肿(eumycetoma)中的至少一种的量施用所述制剂。在一些实施方案中，真菌生物体可以是选自曲霉菌和白色念珠菌的一个属的物种。
[0446]
这些制剂和方法可有效促进广谱(有孢子的和无孢子的)真菌生物体的失活。可以以有效治疗与棒曲霉(aspergillus clavatus)、费氏曲霉(aspergillus fischerianus)、黄曲霉(aspergillus flavus)、烟曲霉(aspergillus fumigatus)、黑曲霉(aspergillus niger)、须癣毛癣菌(trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(trichophyton rubrum)、犬小孢子菌(microsporum canis)、白假丝酵母菌(candida albicans)、耳道假丝酵母菌(candida auris)、近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)、热带假丝酵母菌(candida tropicalis)、皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)、粗球孢子菌(coccidioides immitis)、波萨达斯球孢子菌(coccidioides posadasii)、盖蒂隐球菌
(cryptococcus gattii)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、巴西副球孢子菌(paracoccidioides brasiliensis)、杰氏肺孢子菌(pneumocystis jirovecii)、mucormycetes rhizopus、mucormycetes mucor、mucormycetes lichtheimia、马尔尼菲篮状菌(talaromyces marneffei)、申克氏孢子丝菌(sporothrix schenckii)、点枝顶孢霉(acremonium strictum)、noetestudina rosatii、phaeoacremonium krajdenii、pseudallescheria boydii、新月弯孢霉(curvularia lunata)、cladophilaophora bantiana、甄氏外瓶霉(exophiala jeanselmei)、leptosphaeria senegalensis、leptosphaeria tompkinsii、灰马杜拉分枝菌(madurella grisea)、足马杜拉分枝菌(madurella mycetomatis)、pyrenochaeta romeroi、阿萨希毛孢子菌(trichosporon asahii)、蜡叶芽枝霉(cladosporium herbarum)和拟枝孢镰刀菌(fusarium sporotrichioides)中的至少一种有关的真菌感染或抑制其增殖的量施用所述制剂。
[0447]
所述制剂可以与外科手术联合施用。这些方法可以包括以有效在靶部位对至少90％的真菌生物体进行灭菌的量施用所述制剂。例如，这些方法可以包括以有效在靶部位对至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％、至少99.99％或至少99.999％的真菌生物体进行灭菌的量施用所述制剂。示例性的靶部位可以包括上皮组织、口腔组织、食道组织、气管组织、肺部组织、心脏组织、肾脏组织、眼部组织和血流。上皮组织可以包括，例如，表皮、真皮、头发和指甲。然而，额外的靶部位可以通过本文公开的方法进行治疗。如本文所公开的，灭菌可以指消除、去除、杀死或灭活靶部位的真菌生物体的任何过程。
[0448]
处理生物膜的方法
[0449]
所述制剂可以被配制用于处理生物膜。因此，本文公开的方法可以包括生物膜的处理。生物膜的处理通常可以包括消除至少一部分生物膜或抑制生物膜的形成。所述制剂的施用可以对生物膜群体产生影响，例如，杀死或抑制生物膜群落中的一种或多种生物体。通常，带电荷的肽聚合物水凝胶可以在接触后解构多菌类真菌和细菌生物膜屏障。虽然不希望被理论所束缚，但相信本文公开的制剂可以被选择来分解生物膜群体的细胞外基质，使生物膜的真菌、病毒和微生物生物体暴露于水凝胶的阳离子肽。肽水凝胶可以通过破坏生物膜内的微生物、真菌和病毒生物体而有效。所述制剂可作为抗真菌、抗微生物和/或抗病毒肽施用，以通过细胞裂解破坏真菌、微生物和/或病毒生物体，例如，在生物膜群体中。
[0450]
本文还公开了管理生物膜的方法。例如，可采用这些方法来预防生物膜。所述制剂可以被施用于具有生物膜群体或被确定为容易形成生物膜的靶组织，例如，伤口或受伤的组织。所述制剂可在应对组织污染或异味时施用。
[0451]
这些方法通常可以包括以有效促进生物膜的处理和/或生物膜群体的失活的量施用所述制剂。生物膜群体可以包括细菌生物体，例如，革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌生物体。生物膜群体可以包括真菌生物体，例如，有孢子和/或无孢子的真菌生物体。因此，所述制剂可以通过上述的抗微生物和/或抗真菌特性和方法对生物膜进行处理。在某些实施方案中，生物膜群体可以包括病毒生物体。所述制剂可以通过本文所述的抗病毒特性和方法提供对生物膜的处理。
[0452]
所述制剂可以被配制成生物膜去除剂。在一些实施方案中，所述制剂可以被施用
于靶组织以去除生物膜。例如，所述制剂可以被施用于生物膜和/或生物膜感染组织的清创。
[0453]
治疗病毒感染的方法
[0454]
所述制剂可以被配制成在靶部位施用时提供抗病毒特性。例如，自组装的聚合物水凝胶可以具有抗病毒特性。如本文所公开的，“抗病毒”特性可以指对病毒群体的影响，例如，杀死或抑制来自病毒群体的一种或多种生物体。因此，本文公开了治疗病毒感染或抑制病毒生物体增殖的方法。这些方法通常可以包括以有效促进病毒生物体失活的量施用所述制剂。本文公开了减少或消除病毒污染的方法。在示例性的实施方案中，包含约3.0％w/v或更少的肽的制剂，例如，1.5％w/v或更少，或1.0％w/v或更少，可以在靶部位提供抗病毒特性。
[0455]
这些方法可以包括确定需要治疗病毒污染、定植或感染的受试者。在某些实施方案中，可以以有效治疗受试者的呼吸道病毒定植或感染(例如，与鼻病毒、流感、冠状病毒或呼吸道合胞病毒有关)、病毒性皮肤感染(例如，与传染性软疣、单纯疱疹病毒或水痘-带状疱疹病毒有关)、食源性病毒感染(例如，与甲型肝炎、诺如病毒或轮状病毒有关)、性传播病毒感染(例如，与人类乳头瘤病毒、乙型肝炎、生殖器疱疹或人类免疫缺陷病毒有关)和其他病毒感染(例如，与epstein-barr病毒、west nile病毒或病毒性脑膜炎有关)的量施用所述制剂。
[0456]
所述制剂可以与外科手术联合施用。所述方法可以包括以有效在靶部位对至少90％的病毒生物体进行灭菌的量施用所述制剂。例如，所述方法可以包括以有效在靶部位或全身对至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％、至少99.99％或至少99.999％的病毒生物体进行灭菌的量施用所述制剂。在一些实施方案中，所述方法可以包括以有效在靶部位或全身对100％的病毒生物体进行灭菌的量施用所述制剂。在某些实施方案中，可以以有效处理生物膜或杀死或失活含有病毒生物体的生物膜群体的量施用所述制剂。
[0457]
示例性的靶部位可以包括上皮组织、口腔组织、食道组织、气管组织、肺部组织、心脏组织、肾脏组织、眼部组织和血流。然而，额外的靶部位也可以通过本文公开的方法进行治疗。如本文所公开的，灭菌可以指消除、去除、杀死或灭活靶部位的病毒生物体的任何过程。
[0458]
肽水凝胶的施用方法
[0459]
肽水凝胶可以通过本领域技术人员已知的任何施用方式施用。施用方法可以包括选择受试者的靶部位并将制剂施用于靶部位。在某些实施方案中，这些方法可以包括将肽与缓冲液混合，所述缓冲液被配置为导致肽的自组装以形成水凝胶。通常，所述肽可以在施用前与缓冲液混合。然而，在一些实施方案中，所述肽可以在靶部位与缓冲液组合。
[0460]
靶部位可以是任何身体组织或血流。在一些实施方案中，靶部位可以是上皮组织、胃肠系统组织、呼吸系统组织、心脏系统组织、神经系统组织、生殖系统组织、眼部组织或听觉组织。施用途径可以根据靶组织来选择。下面将更详细地讨论示例性的施用途径。
[0461]
在一些实施方案中，这些方法可以包括确定需要施用所述制剂的受试者。这些方法可以包括对靶部位进行成像或监测受试者全身或靶部位的至少一个参数。可监测的示例性参数包括温度、ph、对光学刺激的反应和对电介质刺激的反应。因此，在一些实施方案中，
所述方法可以包括向受试者提供光学刺激或电介质刺激，任选地在靶部位，以测量反应。所述反应可以被记录下来，任选地在存储装置中。通常，可以监测和/或记录可告知用户需要或希望施用所述制剂的任何参数。这些方法可以包括在施用所述制剂前、施用所述制剂的同时或施用所述制剂后对靶部位进行成像或监测受试者的至少一个参数。例如，这些方法可以包括在初始剂量后和潜在的后续剂量的制剂前对靶部位进行成像或监测受试者的至少一个参数。
[0462]
在某些实施方案中，可以响应于测量的参数超出靶标值的容忍度而施用所述制剂。可以响应于所测量的参数而自动或手动施用所述制剂。
[0463]
所述制剂可以被配制用于局部、肠外或肠内施用。所述制剂可以被配制用于全身性施用。各种药学上可接受的载体及其制剂在标准制剂论文中进行了描述，例如e.w.martin的remington’s pharmaceutical sciences。另请参见wang,y.j.and hanson,m.a.,journal of parenteral science and technology,technical reportno.10,supp.42:2s,1988；aulton,m.and taylor,k.,aulton’s pharmaceutics:the design and manufacture of medicines,5th edition,2017；antoine,a.,gupta m.r.,and stagner,w.c.,integrated pharmaceutics:applied preformulation,product design,and regulatory science,2013；dodou k.exploring the unconventional routes
–
rectal and vaginal dosage formulations,the pharmaceutical journal,29aug.2012。
[0464]
肽水凝胶的肠外施用
[0465]
在某些实施方案中，水凝胶可以在肠外施用。通常，肠外施用可以包括任何非肠内的施用途径。所述制剂可以通过微创手术进行肠外施用。在特定的实施方案中，肠外施用可以包括通过注射器，例如通过针头或导管递送。例如，肠外施用可以包括通过注射递送。肠外施用可以是肌肉内的、皮下的、静脉内的或真皮内的。水凝胶的剪切稀化能力可允许通过小的内腔分布，同时仍提供微创治疗。
[0466]
所述方法可以包括对水凝胶施加机械力以进行肠外施用。水凝胶可以通过施加的机械力而稀化，例如通过注射器施加的压力来通过注射施用制剂。特别是，通过针头或导管施用制剂而施加的压力可能足以使水凝胶剪切稀化以便应用。
[0467]
肽水凝胶可以在任何需要的内部靶部位进行肠外施用。例如，心脏组织、神经组织、结缔组织、上皮组织或肌肉组织等都可作为靶部位。肽水凝胶可以被肠外施用到实体瘤的靶部位。在示例性的实施方案中，肺部组织的抗真菌治疗可以通过本文所述的肽水凝胶的肠外施用来提供。
[0468]
肽水凝胶的局部施用
[0469]
在某些实施方案中，水凝胶可以局部施用。通常，局部施用可以包括任何外部或经皮施用。例如，施用的靶部位可以是上皮组织。在特定的实施方案中，局部施用可伴有伤口敷料或止血剂。
[0470]
所述制剂可以通过递送装置进行局部施用。例如，所述制剂可以通过喷雾器、气雾剂、滴管、管、安瓿、薄膜或注射器进行局部施用。在特定的实施方案中，所述制剂可以通过喷雾器进行局部施用。喷雾器可以是，例如，鼻腔喷雾器。可选择用于施用的喷雾参数包括液滴大小、喷雾模式、容量、喷雾影响、喷雾角度和喷雾直径。因此，这些方法可以包括选择喷雾参数以与靶部位或靶标指示相关联。例如，可选择较小的喷雾直径，以便向小伤口施
用。对于难以到达的靶部位，可以选择特定的喷雾角度来施用。对于潮湿的靶部位，可以选择更密集的喷雾模式或更大的液滴尺寸来施用。
[0471]
示例性的液滴尺寸可以在65μm至650μm之间。例如，可选择平均直径为65μm至225μm的细液滴，平均直径为225μm至400μm的中液滴，或平均直径为400μm至650μm的粗液滴。喷雾模式的范围可以从密集的液滴到稀疏的液滴。喷雾直径的范围可以从小于1cm到100cm。例如，喷雾直径可以选择在小于1cm和10cm之间，10cm和50cm之间，或50cm和100cm之间。喷雾角度可以在0
°
至90
°
之间。例如，喷雾角度可以选择为0
°
和10
°
之间，10
°
和45
°
之间，或45
°
和90
°
之间。
[0472]
在一些实施方案中，所述制剂可以用薄膜进行局部施用。所述薄膜可以是刚性、半柔性或柔性的薄膜。在某些实施方案中，柔性或半柔性的薄膜可以被配置为采用靶部位的拓扑结构。通常，所述薄膜可以是被制剂或水凝胶饱和的基底形式。所述基底可以是刚性的、半柔性的或柔性的。所述薄膜可作为屏障敷料和/或止血剂施用。所述制剂可以用薄膜进行局部施用，并伴有屏障敷料。
[0473]
如前所述，配制成饱和薄膜或屏障敷料的肽可以通过与靶标人群直接接触而提供抗微生物、抗病毒和/或抗真菌治疗。常规的抗微生物伤口敷料依赖于传统的抗生素，并仅仅作为抗生素药剂的载体发挥作用。然而，本文所述的肽水凝胶饱和薄膜或屏障敷料可以被设计成提供一种针对广谱(革兰氏阳性和革兰氏阴性)细菌培养物进行细胞膜破坏的生物物理模式。因此，抗微生物、抗病毒和/或抗真菌的肽水凝胶饱和薄膜或屏障敷料通常可以避免对传统的小分子负载聚合物典型的最低抑制细菌浓度周围的关注。相反，本文公开的肽水凝胶可以被设计成对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(包括抗生素耐药菌株)发挥毒性，同时通过选择肽的氨基酸电荷比例来保持细胞友好、非炎性和无毒。同样，本文公开的肽水凝胶可以被设计成对真菌生物体(例如，有孢子和无孢子的真菌生物体)和/或病毒生物体发挥毒性。本文公开的饱和薄膜或屏障敷料可以提供用于组织再生的临时细胞外基质支架。
[0474]
肽水凝胶可以被局部施用到任何需要的靶部位。伤口愈合，例如，糖尿病伤口愈合，在本文中作为一个示例性的实施方案进行描述。然而，应理解，许多其他局部靶部位和治疗都是可以设想的，例如，如前所述。伤口可以包括急性、亚急性和慢性伤口。伤口可以是手术伤口或缺血性伤口。慢性伤口如静脉和动脉溃疡伤口或压力溃疡伤口，以及急性伤口如由创伤引起的伤口，都可以被治疗。在一些实施方案中，所述制剂可以被配制成薄膜、屏障敷料和/或止血剂。所述制剂的施用可伴有屏障敷料和/或止血剂。
[0475]
生物膜的处理和/或管理或抑制在本文中作为另一个示例性的实施方案进行描述。伤口或组织的湿度管理和/或渗出物管理在本文中作为另一个示例性实施方案进行描述。组织清创在本文中作为另一个示例性的实施方案进行描述。所述制剂可作为预防措施局部施用，例如，与伤口相关。所述制剂可作为镇痛剂局部施用，例如，用于慢性伤口或生物膜的部位。
[0476]
肽水凝胶的肠内施用
[0477]
在某些实施方案中，水凝胶可以在肠内施用。通常，肠内施用可以包括任何口服或胃肠道施用。例如，施用的靶部位可以是口腔组织或胃肠道组织。在特定的实施方案中，肠内施用可伴有食物或饮料。所述制剂可在基本空腹的情况下施用。在一些实施方案中，在施
用所述制剂后向受试者施用水。在一些实施方案中，在施用后等待数小时再食用食物。
[0478]
这种肠内制剂可以配制用于口服、舌下、唇下、口腔或直肠应用。口服应用制剂通常是专门为通过口腔摄取而制备的。舌下和唇下制剂，如片剂、条剂、滴剂、喷雾剂、气雾剂、雾剂、锭剂和泡腾片，可以口服施用，通过舌下或唇下的结缔组织扩散。具体来说，舌下施用的制剂可以放在舌下，唇下施用的制剂可以放在嘴唇和牙龈(牙床)之间。当剂型包含可能对舌下敏感组织有腐蚀性的材料时，唇下施用可能是有益的。口腔制剂通常可以在口腔区域局部保持或应用，以扩散通过沿颊部的口腔粘膜组织。直肠应用可以通过将制剂插入直肠腔来实现，无论是否有装置的协助。辅助装置的应用可以包括，例如，通过涂抹器或可插入的涂抹器、导管、喂食管或与内窥镜或超声波结合递送来递送。合适的涂抹器包括液体制剂球体和发射器以及可插入固体制剂的涂抹器。
[0479]
对于本文公开的任何一种施用途径，这些方法可以包括施用制剂的单一剂量。施用部位可以被监测一段时间，以确定是否要施用所述制剂的加强剂量或后续剂量。例如，这些方法可以包括监测施用部位。如前所述，可以监测受试者的参数，任选地在靶部位。可以每小时、每2-3小时、每6-8小时、每10-12小时、每12-18小时或每天一次监测受试者。可以每天、每隔一天、每隔几天或每周一次监测受试者。可以每月或每两个月一次监测受试者。在某些实施方案中，受试者可以被监测长达约6个月的时间。例如，受试者可以被监测约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。
[0480]
这些方法可以包括施用所述制剂的至少一个加强剂量或后续剂量。例如，这些方法可以包括在第一剂量后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天向靶部位施用加强剂量。这些方法可以包括在第一剂量后1周、2周、3周、4周、5周或6周施用加强剂量。这些方法可以包括在第一次施用后至少6个月或1年施用加强剂量。在某些实施方案中，在加强剂量时至少一部分水凝胶可存在于靶部位。在其他实施方案中，在加强剂量时水凝胶可从靶部位完全代谢或以其他方式消除。
[0481]
用肽水凝胶递送生物材料的方法
[0482]
本文公开了向受试者施用生物材料的方法。这些方法通常可以包括将生物材料悬浮在水凝胶中。生物材料可以与包含生物相容性溶液中的自组装肽和缓冲液的制剂组合，所述缓冲液包含有效量的离子盐和生物缓冲剂，以导致水凝胶的自组装。这些方法可以包括将有效量的生物材料、制剂和缓冲液(任选地为水凝胶形式)施用于受试者的靶部位。将生物材料与制剂或缓冲液一起悬浮，通常会产生液体悬浮液。将制剂与缓冲液组合，可引发悬浮液凝胶化，成为包含生物材料的水凝胶。
[0483]
待施用的生物材料可以包括生物液体、细胞和/或组织材料。在一些实施方案中，所施用的一种或多种生物材料可以是合成的。例如，生物液体可以是或包括合成液体。在其他实施方案中，生物材料可以从供体获得。生物材料可以是自体的(从受体受试者获得)。生物材料可以是同种异体的(从与受体受试者相同物种的供体受试者获得)或异种异体的(从与受体受试者不同物种的供体受试者获得)。
[0484]
自组装水凝胶可以具有与生物材料的天然细胞外基质基本相似的物理结构，使所述凝胶可以充当临时支架，以促进细胞生长、功能和/或活力。特别是，自组装水凝胶可以具有与生物材料的天然细胞外基质相似的特性，包括例如孔径大小、密度、水合、电荷、硬度等。这些特性可以根据生物材料的类型来选择。
[0485]
自组装水凝胶可以具有选定的降解率。降解率可根据植入或施用的靶部位来选择。可以选择自组装水凝胶的特性来促进细胞向水凝胶环境迁移。可以选择自组装水凝胶的特性来促进细胞在恶劣环境中的保护。可以选择自组装水凝胶的特性来促进生物材料在水凝胶内的锚定，例如，对于不会移植到宿主组织上的细胞。可以选择自组装水凝胶的特性来促进细胞产物或副产物或组织衍生的材料迁移到水凝胶环境中，例如，生长因子、外泌体、细胞裂解物、细胞碎片或遗传物质。在示例性的实施方案中，可以选择自组装水凝胶的特性来控制细胞，例如祖细胞或干细胞，如间充质干细胞的分化。
[0486]
自组装水凝胶的特性可以通过设计肽来控制。例如，所述肽可以包括提供一种或多种选定的物理特性的官能团。这些特性可以通过选择培养基或缓冲液的组成来控制。例如，培养基可以包括血清或基本上不含血清。例如，缓冲液可以具有净正电荷、为净中性或具有净负电荷。在一些实施方案中，当所述肽悬浮在溶液中时，官能团可以被配置为改变肽的净电荷或反离子。
[0487]
可以通过改变水凝胶的释放特性来控制细胞和细胞产物、副产物、组织或组织衍生材料在靶部位的施用。在一些实施方案中，释放特性可以通过控制细胞外基质或蛋白质基序的表达、融合蛋白的存在或不存在、肽的净电荷、阳离子颗粒或肽的存在或不存在、阴离子颗粒或肽的存在或不存在、缓冲液、盐、肽浓度、肽纯度以及肽反离子的存在或不存在中的一个或多个而被工程化。这些特性可以被工程化以在靶部位部署细胞。这些特性可以被工程化为在靶部位部署细胞产物或副产物，例如，递送外泌体、生长因子、遗传物质、rna、sirna、shrna、mirna等。
[0488]
自组装水凝胶可以被设计成具有细胞保护特性。特别是，自组装水凝胶可以被设计成保护免受外来微生物如病原微生物的影响。自组装水凝胶可以被设计成保护免受环境免疫细胞的免疫攻击的影响，例如，通过提供物理屏障或生化调节。水凝胶的抗微生物和/或保护特性可能不会严重影响移植细胞的活力、生长或功能。
[0489]
水凝胶的保护特性可以通过改变肽的净电荷来工程化。在一些实施方案中，可以通过控制阳离子颗粒或肽的存在或不存在、阴离子颗粒或肽的存在或不存在、缓冲液、盐、肽浓度、肽纯度以及肽反离子的存在或不存在中的一个或多个来改变净电荷。
[0490]
悬浮液可以被设计成具有基本生理性的ph水平。悬浮液可以具有约4.0至9.0的ph水平。在一些实施方案中，悬浮液可以具有约7.0至8.0的ph水平。悬浮液可以具有约7.3至7.5的ph水平。基本生理性的ph可允许在制备时施用悬浮液。在一些实施方案中，悬浮液可以在照护点制备。这些方法可以包括将细胞悬浮在肽溶液中，任选地，搅拌悬浮液以提供细胞的基本均匀分布，并在照护点施用悬浮液。施用可以是局部的或肠外的，如本文所述。
[0491]
用肽水凝胶进行生物材料移植的生物制造
[0492]
本文公开了在体外制备用于在体内施用的生物材料移植物的方法。这些方法可以包括在体外将包含细胞的液体悬浮液自组装到肽支架基质中。自组装的高阶结构可以被施用于受试者的靶部位。
[0493]
本文公开了在体内制备生物材料移植物的方法。这些方法可以包括施用包含生物材料的液体悬浮液，以便在靶部位自组装成高阶结构。
[0494]
这些方法可以包括在照护点进行生物材料移植物的生物制造，如下文更详细描述的。
[0495]
本文公开的水凝胶具有足够快的凝胶化动力学，以确保生物材料基本均匀地结合在基质中。特别是，凝胶化动力学足够快，以提供封装细胞的均匀分布，从而允许对基质内的细胞密度进行可重复的控制。此外，本文公开的水凝胶具有可在体内引入并在施用点保持定位的构造，例如，即使没有空间腔体。施用时水凝胶的定位可以限制或抑制细胞构建体向邻近组织的渗漏。
[0496]
这些方法可以包括将生物材料悬浮在制剂中，任选地，搅拌悬浮液以提供生物材料的基本均匀或非均匀分布，并在照护点施用悬浮液。在一些实施方案中，可对悬浮液进行搅拌以提供生物材料的基本均匀分布。在其他实施方案中，可以制备或搅拌悬浮液以提供非均匀的悬浮液，例如，包含生物材料的团块或球状体。
[0497]
在移植之前，细胞可以在体外进行培养。细胞培养方案通常因细胞类型而异。细胞培养方案的条件可以根据细胞类型来选择。在示例性的实施方案中，细胞可以是自体细胞、同种异体细胞或异种异体细胞。培养的细胞可以悬浮在水和/或培养基中。在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括从生物体中收集或收获细胞。例如，本文公开的方法可以包括从受试者中收集或收获细胞。本文公开的方法可以包括从生物体如受试者收集或收获组织移植物。
[0498]
悬浮液可以包括配置为响应外部刺激而自组装的肽。悬浮液和/或肽可以被工程化为表达所需的特性。例如，悬浮液和/或肽可以被设计成表达剪切稀化和/或抗微生物特性。
[0499]
在一些实施方案中，在施用之前或与之同时，可以向悬浮液或悬浮液的一部分添加缓冲溶液以导致水凝胶化。水凝胶可以形成均匀或基本均匀的细胞基质。细胞基质可作为固体或凝胶施用于靶部位，任选地具有如前所述的剪切稀化特性。
[0500]
在向受试者施用细胞悬浮液之前，可以在体外在细胞移植物中培养细胞达预先确定的时间段。所述时间段可从几分钟、几小时到几天不等。培养期可以根据细胞类型和靶标应用来选择。在其他实施方案中，细胞可以在悬浮或移植后立即施用。细胞可以在植入的细胞移植物中进行原位培养。
[0501]
悬浮液和/或肽可以被工程化为表达所需的特性。在某些实施方案中，悬浮液和/或肽可以被工程化为保护细胞免受恶劣环境的影响。特别是，悬浮液和/或肽可以被工程化为保护细胞免受具有高微生物负荷、不利免疫细胞或环境蛋白的环境的影响。悬浮液和/或肽可以被工程化以提高细胞的活力。悬浮液和/或肽可以被工程化以控制分化、控制原位细胞命运、控制体内细胞命运、控制离体细胞命运或控制体外细胞命运。悬浮液和/或肽可以被工程化以增加细胞对基质的粘附，或增加细胞在环境中的粘附和/或迁移。悬浮液和/或肽可以被工程化以减少凋亡，例如通过提供细胞粘附和/或生物调节。
[0502]
悬浮液和/或肽可以被工程化为通过改变蛋白质基序的表达或肽的净电荷来实现上述效果。可以通过控制细胞外基质或蛋白质基序的表达、融合蛋白的存在或不存在、肽的净电荷、阳离子颗粒或肽的存在或不存在、阴离子颗粒或肽的存在或不存在、缓冲液、盐、肽浓度、肽纯度、肽反离子的存在或不存在、专用蛋白的存在或不存在以及专用小分子或大分子的存在或不存在中的一个或多个来工程化水凝胶特性。
[0503]
本文公开了用于在照护点进行细胞移植物的生物制造的混合装置。这些装置可以包括用于细胞制剂的第一室。细胞制剂可以包括悬浮在水、培养基或缓冲液中的细胞。如前
所述，这些装置可以包括用于肽制剂的第二室，以及任选地用于缓冲液的第三室。
[0504]
实施例
[0505]
从下面的实施例可以更好地理解这些和其他实施方案的功能和优点。这些实施例旨在是说明性的，并不认为是对本发明的范围的限制。
[0506]
实施例1：以0.5％、0.75％和1.5％w/v的不同浓度移植的肽水凝胶治疗病原体污染的糖尿病伤口
[0507]
将检验本文所述的肽水凝胶用于递送治疗性细胞以加速清洁和污染的糖尿病伤口的组织再生的功效。将使用db/db小鼠的夹板固定的、全层切除的伤口模型。已经表明，在小鼠伤口上应用硅胶夹板可以最大限度地减少愈合过程中的皮肤收缩，从而形成更接近人类伤口愈合的模型，并允许评估新的治疗策略在提高伤口再上皮化和肉芽组织形成方面的能力。原代同种异体小鼠msc将被递送到具有免疫活性的糖尿病小鼠体内。然而，也可以使用自体或异种异体msc。随后的研究将使用猪模型。
[0508]
特别是，所述研究将确认封装在肽水凝胶中的msc的体内活力。所述研究将证明肽水凝胶可用于快速和温和地封装原代msc，并提供支持其体内活力的支架。所述研究将证明肽水凝胶在体内具有生物相容性，并且所述凝胶可以封装原代msc，在移植后具有高细胞保留率和活力。
[0509]
将证明细胞被封装在抗微生物细胞外基质后的体外活力和增殖。特定的肽将在体外测试msc封装后的高细胞保留率和活力。将在整个研究中使用来自表达gfp(cyagen)的c57bl/6小鼠的原代msc，以方便检测体内的移植细胞，所述msc已被用于小鼠伤口愈合模型。gfp msc将被封装在肽基质中，肽含量为0.5％、0.75％和1.5％w/v。混合后，凝胶将通过注射器分配到细胞培养孔板中，以模拟应用到创面上。在组织培养聚苯乙烯(tcps)和胶原蛋白支架(伤口基质或其他类似的多孔胶原蛋白支架)上播种的msc将充当对照。
[0510]
细胞封装或播种后，msc将被允许粘附30分钟。然后将培养基添加到不同的条件下，以培养细胞，并在最初的细胞封装/播种后1、3和7天评估其活力和增殖。细胞基质将通过轻柔的移液和在培养基中的稀释而被分离，以破坏肽网络。对于对照条件，细胞将使用胰蛋白酶-edta进行酶解。细胞将对于总细胞数、活力和增殖被评估，方法是用活力染色剂染色和用血细胞仪计数。所述研究将证实肽水凝胶以快速、安全和温和的方式封装原代msc，导致封装细胞的高保留率和活力。
[0511]
使用mg-63成骨细胞祖细胞系的初步结果表明，细胞在凝胶内被封装和剪切稀化后表现出高活力。所述研究将使用原代msc扩展这些发现，原代msc是一种具有治疗潜力的细胞类型。由于肽的自组装机制和凝胶的可流动特性，预计细胞在肽水凝胶内的封装将是快速和温和的。预计在肽基质内的初始细胞保留率高(》95％)，以及在封装后的几天内细胞活力高(》80％)。具有生物活性基序的肽有望进一步提高细胞的活力和/或增殖。在第1、3和7天导致msc》90％的细胞活力的肽制剂将进入体内测试。
[0512]
所述研究将证明植入的基质的体内生物相容性和封装细胞的活力。所述研究将证明植入的基质在体内具有生物相容性，并且在移植后第3天和第14天支持封装在凝胶中的msc的存活。gfp msc将被用来检测体内递送后的细胞。40只雌性cd1小鼠将接受100ul以下治疗的皮下注射：1)pbs，2)仅0.5x 106个msc(对照)，3)胶原蛋白支架 0.5x 106个msc(比较产物对照)，4)自组装的肽水凝胶 0.5x 106个msc，和5)生物活性的自组装的肽水凝胶
0.5x 106个msc。将使用0.75％w/v浓度的自组装肽，每只小鼠将接受两次皮下植入。小鼠将在第3天和第14天被安乐死，凝胶植入物将与周围组织一起被切除，以分析植入物的生物相容性，以及msc的活力和功能活性。
[0513]
在每个时间点，每个条件下的4个植入物将被处理以进行组织学检测，每个条件下的另外4个植入物将被储存，以分析与组织再生相关的旁分泌因子的表达。组织学样品将用苏木精和伊红(h&e)染色，并通过评估组织形态、坏死和植入物周围的纤维组织厚度来评估不同条件下的生物相容性。为了确定体内递送后促进msc存活的条件，将对组织切片进行分析，以列举凝胶中的gfp msc(细胞/cm2)，并排除正在发生凋亡的细胞(tunel测定)。所述研究将确认肽制剂在体内是安全的和生物相容的，并能促进植入后的msc存活。
[0514]
初步的体外结果表明，肽水凝胶与哺乳动物细胞具有细胞相容性(图5)。因此，预计肽水凝胶将在整个植入期与msc是安全和生物相容的。预计在所有时间点，凝胶内的坏死细胞少于10％(按细胞/cm2量化)，凝胶周围的纤维化组织最小(按厚度/cm2量化)。与第3天相比，凝胶在第14天会出现一些降解，但不会出现明显的巨噬细胞或巨体细胞对凝胶降解产物的反应(按细胞/cm2量化)。此外，预计肽水凝胶将支持凝胶中递送的msc的活力，这一点通过量化组织切片中可生存的gfp msc得到证实。生物活性的肽制剂可以促进msc在基质中更大的生存，并增加内源性细胞对植入物的渗透。
[0515]
我们提供了16只额外的动物，以应对退组(dropout)和测试生物活性制剂，所述制剂被赋予了可以作用于msc的生物功能。促进再生的旁分泌因子，如vegf、ang-1、egf和kgf的表达，将通过elisa(量化为pg蛋白/mg组织)使用储存的样品以及通过组织切片的免疫组化染色(图像分析以确定蛋白质在第3和14天的空间和时间定位)进行分析。
[0516]
实施例2：msc移植的肽水凝胶的抗微生物特性
[0517]
该研究将证明封装在抗微生物肽基质中的msc将增强db /db 糖尿病小鼠中全层伤口的组织再生。db/db糖尿病小鼠模型(db /db ；bks.cg-dock7m / leprdb/j)是常用的糖尿病伤口愈合模型，其表现出对感染的脆弱性、宿主反应的改变和愈合受损。将对清洁的糖尿病伤口在第14天(伤口部分闭合)和第28天(伤口完全闭合)以及被病原体污染的伤口在第28天的不同治疗组之间的组织形态进行检查，预计其会表现出延迟的组织再生。该研究将证明，与对照相比，递送msc的肽基质导致伤口闭合速度加快，再生组织的质量得到改善。
[0518]
该研究将证明在清洁的糖尿病伤口中加速组织再生。在这项研究中，将证明水凝胶基质可以改善db /db 小鼠中非感染伤口的愈合。共有30只10周大的雌性db /db 小鼠，每只将接受两个全层皮肤伤口，随后它们将被随机分为以下治疗组：1)pbs(对照)，2)仅0.5x 106个msc(对照)，3)胶原蛋白支架 0.5x106个msc(比较产物对照)，4)自组装的肽水凝胶，和5)自组装的肽水凝胶 0.5x 106个msc。
[0519]
动物手术将根据以前建立的方案进行。简而言之，小鼠将被置于麻醉下，并在每只小鼠的背部，在中线的任何一侧创建两个5mm的全层切除伤口。在伤口周围放置甜甜圈状的硅胶夹板，并使用液体粘合剂(glue,elmer’sproducts)和间断缝合进行固定。将对伤口施加100μl的治疗，再用tegaderm
tm
(3m)这种非粘性伤口敷料覆盖。对于只有msc的对照，将在伤口外围的4个部位皮内注射悬浮在100μl pbs中的msc。对于比较产物对照，msc将在37℃下预先接种到胶原蛋白支架(伤口基质或其他类似的多孔胶原蛋白支架)
上30分钟，然后再将支架放置在创面上。伤口将在第0、3、7、14、21和28天进行拍照，以测量伤口表面积，并通过图像分析量化伤口闭合随时间的百分比。
[0520]
移除伤口敷料后，将对伤口进行评分(伤口评分，对于皮肤刺激性的draize评分)，并对水合、结痂、渗出物和可处理性进行定性评估。小鼠将在第14天和第28天被安乐死，伤口和周围的组织将用10mm的活检钻孔器进行切除。每个条件下的6个伤口将被处理以进行h&e染色，组织切片将被评估为重新上皮化、肉芽组织形成、水肿、红斑、纤维化组织和巨体细胞反应(按细胞/cm2量化)。所述研究将确定与对照相比，治疗组的伤口闭合速度加快，再生组织的质量提高(再上皮化和肉芽组织形成增加)。
[0521]
初步的体外结果显示，肽水凝胶具有细胞相容性，这表明凝胶既能支持外源性递送的msc的生存和功能，也能允许内源性细胞入侵和增殖以进行组织再生。预计与对照相比，递送msc的肽水凝胶将显示出糖尿病伤口愈合的改善，这是由伤口愈合率(通过图像分析)和有资格的病理学家的组织病理学评估来衡量的。
[0522]
肽水凝胶可以介导细胞粘附(图6)，以支持封装的msc的活力和功能，并在伤口愈合过程中充当内源性细胞渗透的支架基质。图6包括展示对病原体的选择性毒性的图像。特别是，图6显示了在肽水凝胶上共同培养的mrsa和c3h10t1/2充质干细胞的测定中的活细胞(绿色)和死细胞(红色)。如图6的右图所示，mrsa被杀死，而哺乳动物细胞保持健康。更高的放大率显示c3h10t1/2细胞能够在水凝胶上粘附和扩散。
[0523]
将研究生物活性肽水凝胶对增强细胞粘附能力和伤口愈合的影响。此外，生物活性肽基质有可能通过其生物活性与msc协同作用，加速伤口愈合。
[0524]
肽水凝胶可能加速病原体污染的糖尿病伤口的组织再生。肽水凝胶的固有抗微生物特性将被确定，以保护递送到受感染的糖尿病伤口后的封装在基质中的治疗性msc，使伤口愈合得到改善。如上所述，将在20只db /db 小鼠中创建伤口。在创建伤口和使用夹板后，将10μl pbs中的105个金黄色葡萄球菌(atcc 25923)的cfu放置在创面上，并允许不受干扰地放置15分钟。接种后，将应用100μl的治疗，再用tegaderm伤口敷料覆盖。
[0525]
治疗组将由以下组成：1)pbs(对照)，2)仅0.5x 106个msc(对照)，3)胶原蛋白支架 0.5x 106个msc(比较产物对照)，4)自组装的肽水凝胶，和5)自组装的肽水凝胶 0.5x 106个msc。伤口闭合的速度将在第3、7、14、21和28天通过数码照片进行监测，伤口将按照上述相同的方法进行评分。在第28天安乐死后，将用10mm的活检钻孔器切除伤口。每个治疗组的8个伤口将被治疗以进行h&e染色并进行组织病理学评估。所述研究将确定，与对照相比，用肽水凝胶治疗的组的伤口闭合速度加快，再生组织的质量提高(重新上皮化和肉芽组织形成增加)。
[0526]
初步的体外结果表明，肽水凝胶表现出强大的抗微生物效果，同时与哺乳动物细胞保持细胞相容性。因此，预计与对照治疗相比，递送msc的肽水凝胶将改善糖尿病小鼠中受感染的伤口的愈合，这是由伤口愈合率(通过图像分析)和有资格的病理学家的组织病理学评估来衡量的。如上所述研究的平行治疗组将充当未感染伤口愈合对照，以与本文研究的受感染伤口进行比较。
[0527]
伤口中的生物负荷可以在第1-7天之间用组织活检(与拭子)进行测量。愈合表型也可以被评估。治疗组的伤口生物负荷将在第3天和第7天通过采取伤口活检和量化细菌负荷(cfu/g组织)进行比较。补充的和正在进行的研究将测试更大范围的临床相关病原体。
[0528]
肽水凝胶的可行性将通过确认封装在肽水凝胶中的移植msc的体内活力，以及在用封装在肽水凝胶中的msc治疗后的干净和受污染的糖尿病伤口的体内组织再生改善来证明。随后，将确定肽水凝胶在糖尿病猪模型中促进组织再生的功效。该研究将由封装在合成基质中的局部应用的治疗性细胞组成。
[0529]
实施例3：治疗感染mrsa的全层伤口
[0530]
在治疗感染mrsa的全层伤口时，测试了肽含量为0.75％w/v和1.5％w/v的水凝胶的效果。
[0531]
简而言之，如前所述，在小鼠中创建全层切口。切口被感染了mrsa微生物菌落。用对照、0.75％w/v肽水凝胶或1.5％w/v肽水凝胶治疗感染的伤口。感染后24小时测量mrsa的增殖。结果显示在图11的图表中。
[0532]
如图11的图表所示，与对照相比，用0.75％w/v和1.5％w/v的肽制剂治疗均减少了微生物的增殖。此外，用0.75％w/v的肽制剂治疗和用1.5％w/v的肽制剂治疗之间没有显著差异。
[0533]
实施例4：制剂的储存稳定性
[0534]
在储存一段时间后，对制剂的抗微生物功效和流变学进行了测试，以显示货架稳定性。所述制剂保留了抗微生物功效，表现出凝胶化，并在储存后允许细胞存活和增殖。
[0535]
简而言之，所述制剂是用0.75％w/v的六精氨酸肽制备的。凝胶化是通过与缓冲液组合而引起的。缓冲液包括btp、乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和作为生物缓冲剂的tris中的一种，浓度变化为33mm、50mm和100mm。凝胶被储存1天或7天。形态是通过目测确定的。测试了流变学以确定凝胶成为液体的应变情况。对革兰氏阳性mrsa(atcc 33591)和革兰氏阴性铜绿假单胞菌(atcc 9027)的抗微生物功效进行了测试。结果列于表6和图12-13b的图表中。
[0536]
表6：制造7天后的制剂
[0537][0538]
报告的《0.001％的生长值对应于大于4-log的细菌减少，这是fda的抗微生物活性标准。具有33mm btp的制剂对试验病原体显示出减少大于6-log的抗微生物功效，并形成凝胶，这是由g’》100pa的流变学特性所衡量的。图12显示了具有33mm btp的制剂在储存模量(g”)和损失模量(g’)方面的流变学数据。交叉点代表了凝胶(g’)转换为溶液状态(g”)时的
应变百分比。图13a-13b包括显示在凝胶制造后1天和7天对铜绿假单胞菌(图13a)和mrsa(图13b)测试的不同缓冲液制剂的抗微生物活性的图表。黑色虚线代表与10
6-107cfu的对照接种物相比，4log的细菌减少(0.01％生长)。红色虚线代表与10
6-107cfu的对照接种物相比，6log的细菌减少(0.0001％生长)。
[0539]
还进行了细胞相容性测定。所有用btp和tris制成的水凝胶都显示出强大的细胞活力和小鼠间充质干细胞的增殖。
[0540]
相应地，水凝胶在储存7天后仍保持抗微生物功效、流变学特性和细胞相容性。预计水凝胶在更长时间的储存后将保持类似的特性。
[0541]
实施例5：制剂的温度稳定性
[0542]
通过检查热处理后的抗微生物功效和自组装，测试了所述制剂的温度稳定性。所述制剂在加热灭菌后保持了抗微生物功效和自组装。
[0543]
简而言之，所述制剂是用0.75％w/v的六精氨酸肽制备的。通过与浓度为33mm的btp作为生物缓冲剂的缓冲液组合，导致凝胶化。所述制剂在125℃下进行湿热灭菌。将所述制剂的抗微生物活性与未加热灭菌的凝胶和0.2μm过滤的凝胶进行比较。通过将10ul细菌(106cfu)放置在无菌琼脂平板上，然后用实验制剂覆盖接种物来测定抗微生物活性。然后将处理后的接种物在37℃下孵育24小时。
[0544]
自组装结果在图14a-14b的图表中呈现。图14a显示了非加热灭菌的凝胶的流变学。图14b显示了加热灭菌的凝胶的流变学。两个样品都显示了自组装的特性。此外，两个样品之间的最大应变没有显著差异。
[0545]
抗微生物活性结果显示在图15的图表中。加热灭菌的样品显示出大于6-log的细菌减少。如图15所示，与非加热灭菌的水凝胶相比，加热灭菌的水凝胶显示出明显的抗微生物活性增加。
[0546]
肽水凝胶的另一个实验样品通过0.2μm的无菌过滤器进行灭菌。无菌过滤也实现了大于6-log的细菌减少。然而，这种灭菌方法有可能造成肽的损失。
[0547]
还测试了加热灭菌后的肽稳定性。结果显示在图16a-16b的图表中。简而言之，加热灭菌和非加热灭菌的水凝胶的超高效液相色谱(uplc)显示出相同保留时间(分别为5.2分钟和5.3分钟)的峰，证实六精氨酸肽存在于两种水凝胶中。图16a显示了非加热灭菌的水凝胶的uplc数据。图16b显示了加热灭菌的水凝胶的uplc数据。此外，色谱显示与非热灭菌的水凝胶相比，加热灭菌的水凝胶中没有额外的峰。结果表明，该肽在加热灭菌过程中没有降解。
[0548]
因此，加热灭菌的制剂表现出抗微生物活性(≥6-log减少)，自组装成水凝胶(g’》100pa)，并且在加热灭菌后是稳定的/不被降解的。
[0549]
实施例6：制剂的长期保质期稳定性
[0550]
在不同的时间和温度条件下对所述制剂的保质期稳定性进行了测试。通过测量抗微生物功效和自组装来确定货架期稳定性。
[0551]
按实施例6所述制备制剂，并按实施例5所述在室温下储存1、10、40和180天。如实施例5所述，对106cfu mrsa进行抗微生物活性测试。结果显示在图17中。
[0552]
简而言之，如图17所示，黑色虚线表示与对照相比4-log的减少。所有测试的样品都显示出大于6-log的细菌减少的抗微生物功效，如红色虚线所示。因此，测试的制剂在所
有的测试时间点都保持了抗微生物功效，最长可达180天。
[0553]
所述制剂还进行了细胞相容性测试。结果显示在图18的图表中。所有测试的样品都显示细胞活力大于100％。
[0554]
因此，正如抗微生物活性和细胞活力所显示的，加热灭菌的制剂在制造后180天内是货架稳定的。有关更长期稳定性的活力试验正在进行中。然而，预计储存超过180天的制剂会有类似的结果。
[0555]
实施例7：注射器中制剂的流变学评估
[0556]
对注射器中水凝胶的模量进行了评估。如实施例5所述，制剂是用六精氨酸肽制备的。通过与缓冲液组合来导致凝胶化。如实施例6所述，对所述制剂进行蒸汽灭菌。
[0557]
将所述制剂装入环烯烃聚合物(cop)注射器并测量流变学。结果显示在图19的图表中。
[0558]
如图19所示，所述制剂在注射器的施加的机械压力下可逆地自组装。
[0559]
实施例8：含有锂藻土的制剂
[0560]
对包括锂藻土的制剂进行了测试。当制剂中包括锂藻土时，水凝胶表现出较高的模量和较低的最大应变百分比。
[0561]
简而言之，用1.5％w/v的六精氨酸肽制备制剂。通过将2ml肽制剂与2ml浓度为2％w/v的锂藻土制剂组合来制备第一锂藻土制剂。通过将2ml肽制剂与2ml浓度为1.5％w/v的锂藻土制剂组合来制备第二锂藻土制剂。使用超声喇叭对锂藻土制剂进行脉冲均质2分钟(在20％的amp下，10秒开/10秒关)。通过与缓冲液组合来导致凝胶化。
[0562]
图20a-20b的图表中显示了2％w/v锂藻土制剂与2％w/v锂藻土水溶液的数据对比。图21的图表中显示了1.5％w/v锂藻土制剂(下行)与1.5％w/v锂藻土水溶液(上行)的数据对比。如数据所示，添加锂藻土可以提高凝胶机械特性，加强凝胶化过程。锂藻土与肽的比例为1:1的制剂显示出较高的储存模量，但比具有更大浓度的锂藻土的制剂的最大应变要低。
[0563]
实施例9：雾化水凝胶的抗微生物功效
[0564]
测试了制剂在通过鼻腔喷雾装置施用后的抗微生物功效。24小时后，观察到细菌菌落完全消除，表明雾化的制剂表现出极好的抗微生物功效。
[0565]
简而言之，制剂是用0.75％w/v的六精氨酸肽制备的。通过与缓冲液组合来导致凝胶化。所述制剂被装入连接到鼻腔喷雾器的注射器中。将10μl体积的革兰氏阳性mrsa或革兰氏阴性铜绿假单胞菌pa01(10
4-106cfu)铺在bhi琼脂平板上并在室温下干燥。15分钟后，一式三份将制剂喷雾递送到细菌点上，并将平板在37℃下孵育24小时。图22是通过鼻腔喷雾器进行的喷雾应用的图像。结果显示在图23-25的图像和图表中。24小时后，对平板进行成像(图23、图25)，并对所产生的菌落进行计数。如图24的图表所示，当水凝胶被喷雾递送时，在任何测试的cfu浓度下都没有观察到菌落。因此，通过水凝胶的雾化实现了对细菌的完全(100％)消除。
[0566]
本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，不应被视为限制性的。如本文所用，术语“多个”是指两个或更多个项目或组分。术语“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”和“涉及”，无论是在书面描述中还是在权利要求书中，都是开放式的术语，即表示“包括但不限于”。因此，此类术语的使用是指包括此后列出的项目及其等价物，以及其他项目。只有过
渡性短语“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”，就权利要求而言，分别是封闭式或半封闭式的过渡性短语。在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数术语来修饰权利要求要素，其本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先权、优先级或顺序，也不意味着一个方法的行为在时间上的顺序，而只是作为标签来区分具有某种名称的一个权利要求要素和具有相同名称(但使用序数术语)的另一个要素，以区分这些权利要求要素。
[0567]
在描述了至少一个实施方案的几个方面之后，可以理解，对于本领域技术人员来说，各种改变、修改和改进是很容易发生的。在任何实施方案中描述的任何特征都可以包括在任何其他实施方案的任何特征中或被替代。这样的改变、修改和改进是本公开的一部分，并且在本发明的范围内。因此，上述描述和附图仅是举例说明的方式。
[0568]
本领域技术人员应认识到，本文描述的参数和配置是示例性的，实际的参数和/或配置将取决于使用所公开的方法和材料的具体应用。本领域技术人员还应认识到或能够通过不超过常规实验来确定所公开的具体实施方案的等价物。