包含螺旋藻组分的组合物的制作方法

包含螺旋藻组分的组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年10月29日提交的美国临时申请号63/107,214的权益，该申请的全部内容通过援引并入本文。


背景技术：

3.人的微生物群系的组成在其健康和幸福中可以起着重要作用。实际上，破坏个体的微生物群系与多种疾病(包括炎性肠病、免疫障碍、2型糖尿病、神经退行性障碍、心血管疾病和癌症)有关。因此，微生物群系调节是用于此类疾病的有吸引力的治疗策略。
4.一种调节人的微生物群系的方式是向其口服施用一种或多种有益细菌的菌株。然而，已经证明许多细菌菌株的大规模生产具有挑战性，特别是对于需要血红蛋白(或其衍生物例如氯化血红素)用于生长的细菌菌株的事实，已经阻碍了这种疗法的发展。例如，商业血红蛋白及其衍生物典型地从动物来源(例如从猪血)进行纯化，这使得经纯化的血红蛋白很昂贵。此外，血红蛋白的动物来源可能在某些群体中引发伦理和/或宗教反对。最后，不容易获得gmp(优质生产规范)级的血红蛋白，这使得大规模用于制药目的的血红蛋白依赖性细菌的制造特别具有挑战性。


技术实现要素：

5.如本文披露的，螺旋藻可以代替血红蛋白来支持血红蛋白依赖性细菌的生长并且避免了与血红蛋白的使用有关的问题。本披露部分地基于以下发现：螺旋藻组分存在于药物组合物和/或固体剂型中，该药物组合物和/或固体剂型包含在含有螺旋藻的生长培养基中生长的细菌和/或包含来源于细菌(在含有螺旋藻的生长培养基中生长)的试剂(例如微生物胞外囊泡，或mev)。
6.因此，在某些方面，本文提供了包含细菌(或其组分，例如mev)和至少一种螺旋藻组分(例如，核酸螺旋藻组分、蛋白螺旋藻组分、和/或小分子螺旋藻组分)的药物组合物和/或固体剂型。在某些方面，本文提供了制造和/或使用此类药物组合物和/或固体剂型的方法。
7.在一些方面，本文提供了确定在这样的药物组合物或固体剂型中的至少一种螺旋藻组分的存在和/或量的方法。
8.在某些方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：一种药剂，其中该药剂包含(a)细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)；和(b)至少一种螺旋藻组分。
9.在某些方面，本文提供了一种固体剂型，该固体剂型包含：一种药剂，其中该药剂包含(a)细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)；和(b)至少一种螺旋藻组分。
10.本披露还部分地基于以下发现：螺旋藻组分存在于药剂中，该药剂包含在含有螺旋藻的生长培养基中生长的细菌和/或包含来源于细菌(在含有螺旋藻的生长培养基中生长)的试剂(例如微生物胞外囊泡，或mev)。
11.因此，在某些方面，本文提供了包含细菌(或其组分，例如mev)和至少一种螺旋藻
bryantii)、颊普雷沃菌(prevotella buccae)、口颊普雷沃菌(prevotella buccalis)、粪便普雷沃菌(prevotella copri)、牙普雷沃菌(prevotella dentalis)、栖牙普雷沃菌(prevotella denticola)、解糖胨普雷沃菌(prevotella disiens)、栖组织普雷沃菌(prevotella histicola)、中间普雷沃菌(prevotella intermedia)、小斑点普雷沃菌(prevotella maculosa)、马斯普雷沃菌(prevotella marshii)、产黑普雷沃菌(prevotella melaninogenica)、彩虹普雷沃菌(prevotella micans)、多形普雷沃菌(prevotella multiformis)、变黑普雷沃菌(prevotella nigrescens)、口腔普雷沃菌(prevotella oralis)、口普雷沃菌(prevotella oris)、龈炎普雷沃菌(prevotella oulorum)、苍白普雷沃菌(prevotella pallens)、唾液普雷沃菌(prevotella salivae)、斯特塞拉普雷沃菌(prevotella stercorea)、坦纳普雷沃菌(prevotella tannerae)、蒂莫普雷沃菌(prevotella timonensis)、空肠普雷沃菌(prevotella jejuni)、橙色普雷沃菌(prevotella aurantiaca)、保氏普雷沃菌(prevotella baroniae)、着色普雷沃菌(prevotella colorans)、人体普雷沃菌(prevotella corporis)、丹塔普雷沃菌(prevotella dentasini)、栖居普雷沃菌(prevotella enoeca)、斐氏普雷沃菌(prevotella falsenii)、深黑色普雷沃菌(prevotella fusca)、解肝素普雷沃菌(prevotella heparinolytica)、洛氏普雷沃菌(prevotella loescheii)、嗜糖普雷沃菌(prevotella multisaccharivorax)、南锡普雷沃菌(prevotella nanceiensis)、稻普雷沃菌(prevotella oryzae)、沼泽普雷沃菌(prevotella paludivivens)、胸膜炎普雷沃菌(prevotella pleuritidis)、栖瘤胃普雷沃菌(prevotella ruminicola)、解糖普雷沃菌(prevotella saccharolytica)、靶心普雷沃菌(prevotella scopos)、赛赫普雷沃菌(prevotella shahii)、动胶普雷沃菌(prevotella zoogleoformans)或真空腔普雷沃菌(prevotella veroralis)。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是不明显另枝菌、沙氏另枝菌、替莫另枝菌、凝结芽孢杆菌、产酸拟杆菌、解纤维拟杆菌、埃氏拟杆菌、肠拟杆菌、单形拟杆菌、产气柯林斯菌、cloacibacillus evryensis、尸毒梭菌、耳蜗形梭菌、痤疮丙酸杆菌、eisenbergiella属物种、韦荣球菌科物种、霍氏真杆菌/哈利氏厌氧菌(anaerobutyricum halii)、娇弱真杆菌、微核巨球形菌、狄氏副拟杆菌、泪腺嗜胨菌、rarimicrobium hominis、shuttleworthia satelles、或turicibacter sanguinis。
20.在一些实施例中，细菌属于栖组织普雷沃菌物种。在一些实施例中，栖组织普雷沃菌是栖组织普雷沃菌菌株b(nrrl登录号b 50329)或栖组织普雷沃菌菌株c(atcc保藏号pta-126140)。
21.在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是栖组织普雷沃菌物种的菌株。在一些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株b50329的核苷酸序列(例如，基因组序列、16s序列、crispr序列)包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株b 50329(nrrl登录号b 50329)的基因组序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少
99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株b 50329(nrrl登录号b 50329)的16s序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是普雷沃菌属菌株b 50329(nrrl登录号b50329)。
22.在一些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株c(atcc保藏号pta-126140，保藏于2019年9月10日)的核苷酸序列(例如，基因组序列、16s序列、crispr序列)包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株c(pta-126140)的基因组序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是与普雷沃菌属菌株c(pta-126140)的16s序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，栖组织普雷沃菌菌株是普雷沃菌属菌株c(pta-126140)。
23.在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于福涅拉氏菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是福涅拉氏菌属菌株a。
24.在一些实施例中，血红蛋白依赖性福涅拉氏菌属菌株与福涅拉氏菌属菌株b(atcc保藏号pta-126696，保藏于2020年3月5日)的核苷酸序列(例如，基因组序列、16s序列、crispr序列)包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，福涅拉氏菌属菌株是与福涅拉氏菌属菌株b(pta-126696)的基因组序列包含至少99％序列同一性(例如，至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，福涅拉氏菌属菌株是与福涅拉氏菌属菌株b(pta-126696)的16s序列包含至少99％序列同一性(例如至少99.1％序列同一性、至少99.2％序列同一性、至少99.3％序列同一性、至少99.4％序列同一性、至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％、或100％序列同一性)的菌株。在某些实施例中，福涅拉氏菌属菌株是福涅拉氏菌属菌株b(pta-126696)。
25.在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于副拟杆菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株a。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株b。
26.在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于拟杆菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是拟杆菌属菌株a。
27.在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于另枝菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是另枝菌属菌株a。
28.在某些方面，本文提供了一种固体剂型，该固体剂型包含：(a)本文所述的药剂(例如，包含至少一种螺旋藻组分的药剂)；和(b)至少一种稀释剂、至少一种润滑剂、至少一种助流剂、和/或至少一种崩解剂。
29.在某些实施例中，本文所述的固体剂型包含至少一种稀释剂，其具有的总质量为该固体剂型总质量的至少、约、或不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，该至少一种稀释剂具有的总质量为该固体剂型总质量的至少10％且不超过该固体剂型总质量的80％。在其他实施例中，该至少一种稀释剂具有的总质量为该固体剂型总质量的至少20％且不超过该固体剂型总质量的40％。在一些实施例中，该至少一种稀释剂包含甘露醇。
30.如本文所用，固体剂型的质量百分比是基于重量:重量百分比(％w:w)。
31.在某些实施例中，本文所述的固体剂型包含至少一种润滑剂，其具有的总质量为该固体剂型总质量的至少、约、或不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％。在一些实施例中，该至少一种润滑剂具有的总质量为该固体剂型总质量的至少0.1％且不超过该固体剂型总质量的5％。在一些实施例中，该至少一种润滑剂包含硬脂酸镁。
32.在某些实施例中，本文所述的固体剂型包含至少一种助流剂，其具有的总质量为该固体剂型总质量的至少、约、或不超过0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％。在一些实施例中，该至少一种助流剂具有的总质量为该固体剂型总质量的至少0.01％且不超过该固体剂型总质量的2％。在一些实施例中，该至少一种助流剂包含胶态二氧化硅。
33.在某些实施例中，本文所述的固体剂型包含至少一种崩解剂或崩解剂的某些组合和/或量，其导致组合物的崩解时间与常规的固体剂型(例如，包含常规量的崩解剂的固体剂型)相比减少(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍)。在某些实施例中，与具有常规
固体剂型的药物产品相比，本文提供的固体剂型导致治疗功效和/或生理作用的增加。
34.在某些实施例中，固体剂型包含药剂(例如细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)，包含细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)的粉剂)和一种或多种崩解剂(例如，一种、两种或三种崩解剂)。在某些实施例中，固体剂型包含药剂(例如细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)，包含细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)的粉剂)和三种崩解剂。
35.在一些实施例中，本文所述的固体剂型包含至少一种崩解剂，其具有的总质量为该固体剂型总质量的至少、约、或不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，该至少一种崩解剂具有的总质量为该固体剂型总质量的至少40％。
36.在某些实施例中，该至少一种崩解剂包含低取代的羟丙基纤维素(l-hpc，例如，lh-b1)、交联羧甲基纤维素钠(ac-di-sol，例如，ac-di-sol sd-711)、和/或交聚维酮(pvpp，例如，科利当(kollidon)，例如，科利当cl-f)。在某些实施例中，该至少一种崩解剂包含低取代的羟丙基纤维素(l-hpc，例如，lh-b1)、交联羧甲基纤维素钠(ac-di-sol，例如，ac-di-sol sd-711)、和交聚维酮(pvpp，例如，科利当，例如，科利当cl-f)。
37.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含l-hpc。在一些实施例中，l-hpc是lh-b1级。在某些实施例中，l-hpc总质量为固体剂型总质量的至少22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，l-hpc总质量不超过固体剂型总质量的22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，l-hpc总质量为固体剂型总质量的约22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在一些实施例中，l-hpc具有的l-hpc总质量为固体剂型总质量的至少22％且不超过42％。在某些实施例中，l-hpc总质量为固体剂型总质量的约29％至约35％。在某些实施例中，l-hpc总质量为固体剂型总质量的约32％。在一些实施例中，其中l-hpc是lh-b1级的l-hpc。
38.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含ac-di-sol。在一些实施例中，ac-di-sol是sd-711级。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为固体剂型总质量的至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量不超过固体剂型总质量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为固体剂型总质量的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol具有的ac-di-sol总质量为固体剂型总质量的至少0.01％且不超过16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为固体剂型总质量的约3％至约9％。在某些实施例中，ac-di-sol(例如，ac-di-sol sd-711)总质量为固体剂
型总质量的约6％。
39.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含pvpp(交聚维酮，例如，科利当，例如，科利当cl-f)。在某些实施例中，pvpp总质量为固体剂型总质量的至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp总质量不超过固体剂型总质量的5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp总质量为固体剂型总质量的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp具有的pvpp总质量为固体剂型总质量的至少5％且不超过固体剂型总质量的25％。在某些实施例中，pvpp总质量为固体剂型总质量的约12％至约18％。在某些实施例中，pvpp总质量为固体剂型总质量的约15％。
40.在某些实施例中，l-hpc总质量加上ac-di-sol总质量加上pvpp总质量为固体剂型总质量的至少35％、40％、45％或50％。在某些实施例中，l-hpc总质量加上ac-di-sol总质量加上pvpp总质量为固体剂型总质量的至少40％。
41.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)l-hpc(例如，lh-b1级的l-hpc)，其具有的l-hpc总质量为固体剂型总质量的至少22％(例如，至少22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、或42％)且不超过固体剂型总质量的42％(例如，不超过22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、或42％)；(ii)ac-di-sol(例如，sd-711级的ac-di-sol)，其具有的ac-di-sol总质量为固体剂型总质量的至少0.01％(例如，至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、或16％)且不超过固体剂型总质量的16％(例如，不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、或16％)；以及(iii)pvpp，其具有的pvpp总质量为固体剂型总质量的至少5％(例如，至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％)且不超过固体剂型总质量的25％(例如，不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％)。在一些实施例中，固体剂型包含：l-hpc总质量为固体剂型总质量的约32％；ac-di-sol总质量为固体剂型总质量的约6％；以及pvpp总质量为固体剂型总质量的约15％。
42.在一些实施例中，本文提供的固体剂型包含药剂(例如，细菌和/或mev)，其具有总质量为固体剂型总质量的至少、约、或不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。在一些实施例中，药剂具有的药剂总质量为固体剂型总质量的至少5％且不超过固体剂型
总质量的65％。在一些实施例中，药剂具有的药剂总质量为固体剂型总质量的至少5％且不超过固体剂型总质量的35％。在某些实施例中，药剂总质量为固体剂型总质量的约25％。在某些实施例中，本文所述的固体剂型包含片剂、胶囊和/或微型片剂(例如，在胶囊中的微型片剂)。
43.在一些实施例中，固体剂型包含片剂。在一些实施例中，片剂是5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、或18mm片剂。
44.在一些实施例中，固体剂型包含微型片剂。在一些实施例中，微型片剂是1mm微型片剂、1.5mm微型片剂、2mm微型片剂、3mm微型片剂或4mm微型片剂。在一些实施例中，在胶囊中含有多个微型片剂(例如0号胶囊可以含有约31至约35(例如33)个微型片剂，其中微型片剂的尺寸为3mm)。在一些实施例中，胶囊是00号、0号、1号、2号、3号、4号或5号胶囊。在一些实施例中，胶囊包含hpmc(羟丙基甲基纤维素)或明胶。
45.在一些实施例中，固体剂型被肠溶包衣(例如，包含肠溶包衣；例如，被肠溶包衣包被)。在一些实施例中，肠溶包衣是单一肠溶包衣或多于一个肠溶包衣。在一些实施例中，用一层肠溶包衣或两层肠溶包衣(例如，内部肠溶包衣和外部肠溶包衣)包被片剂或微型片剂。在一些实施例中，肠溶包衣包含内部肠溶包衣和外部肠溶包衣，并且内部和外部肠溶包衣不相同。
46.在一些实施例中，肠溶包衣包含甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(mae)共聚物(1:1)。
47.在一些实施例中，一层肠溶包衣包含甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(mae)共聚物(1:1)(例如kollicoat mae 100p)。
48.在一些实施例中，一层肠溶包衣包含尤特奇(eudragit)共聚物，例如，尤特奇l(例如，尤特奇l 100-55；尤特奇l 30d-55)、尤特奇s、尤特奇rl、尤特奇rs、尤特奇e、或尤特奇fs(例如，尤特奇fs 30d)。
49.在一些实施例中，肠溶包衣包含邻苯二甲酸乙酸纤维素(cap)、偏苯三酸乙酸纤维素(cat)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(pvap)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hpmcp)、脂肪酸、蜡、虫胶(紫胶桐酸的酯)、塑料、植物纤维、玉米醇溶蛋白、aqua-zein(不含醇的水性玉米醇溶蛋白配制品)、直链淀粉、淀粉衍生物、糊精、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基醋酸琥珀酸纤维素(醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、或海藻酸钠。
50.在一些实施例中，肠溶包衣包含阴离子聚合物材料。
51.在某些方面，本文提供了固体剂型，其包含：(a)本文所述的药剂(例如，包含至少一种螺旋藻组分的药剂)；和(b)至少一种稀释剂、至少一种润滑剂、和/或至少一种助流剂。
52.在某些方面，本文提供了固体剂型，其包含(a)本文所述的药剂(例如，包含至少一种螺旋藻组分的药剂)；和(b)稀释剂。在某些实施例中，药剂总质量为固体剂型总质量的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，药剂总质量不超过固体剂型总质量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
53.在一些实施例中，稀释剂总质量为固体剂型总质量的至少1％、5％、10％、15％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，稀释剂总质量不超过固体剂型总质量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％。在一些实施例中，稀释剂包含甘露醇。
54.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含润滑剂。在某些实施例中，润滑剂总质量为固体剂型总质量的至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量不超过固体剂型总质量的0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为固体剂型总质量的约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为固体剂型总质量的约0.5％至约1.5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为固体剂型总质量的约1％。在某些实施例中，润滑剂包含硬脂酸镁。
55.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含助流剂。在一些实施例中，助流剂为胶态二氧化硅。在某些实施例中，助流剂总质量为固体剂型总质量的至少0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量不超过固体剂型总质量的0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量为固体剂型总质量的约0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量为固体剂型总质量的约0.25％至约0.75％。在某些实施例中，助流剂总质量为固体剂型总质量的约0.5％。
56.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的至少20％且不超过该固体剂型总质量的55％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的至少45％且不超过该固体剂型总质量的80％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为固体剂型总质量的至少0.1％且不超过固体剂型总质量的5％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为固体剂型总质量的至少0.01％且不超过固体剂型总质量的2％。
57.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的约20％至约50％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约50％至80％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约0.5％。
58.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为固体剂型总质量的至少5％且不超过固体剂型总质量的95％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为固体剂型总质量的至少1％且不超过固体剂型总质量的95％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为固体剂型总质量的至少0.1％且不超过固体剂型总质量的5％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为固体剂型总质量的至少0.01％且不超过固体剂型总质量的2％。
59.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的约8％至约92％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约5％至90％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为该固体剂型总质
量的约0.5％。
60.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的约30％至约50％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约45％至70％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约0.5％。
61.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的约50％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约48.5％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约0.5％。在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的约13.51％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约84.99％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约0.5％。
62.在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为该固体剂型总质量的约90.22％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约8.28％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为该固体剂型总质量的约0.5％。
63.在某些实施例中，本文所述的药剂的固体剂型包含胶囊。在一些实施例中，胶囊是00号、0号、1号、2号、3号、4号或5号胶囊。在一些实施例中，胶囊是0号胶囊。在一些实施例中，胶囊包含hpmc(羟丙基甲基纤维素)或明胶。在一些实施例中，胶囊包含hpmc(羟丙基甲基纤维素)。在一些实施例中，胶囊是封口的。在一些实施例中，将该胶囊用基于hpmc的封口溶液(banding solution)封口。
64.在一些实施例中，固体剂型被肠溶包衣(例如，包含肠溶包衣；例如，被肠溶包衣包被)。
65.在一些实施例中，固体剂型被肠溶包衣以在ph 5.5溶解。
66.在一些实施例中，肠溶包衣包含基于聚甲基丙烯酸酯的共聚物。在一些实施例中，肠溶包衣包含聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)。
67.在一些实施例中，肠溶包衣包含甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(mae)共聚物(1:1)。
68.在一些实施例中，肠溶包衣包含甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(mae)共聚物(1:1)(例如kollicoat mae 100p)。
69.在一些实施例中，肠溶包衣包含尤特奇共聚物，例如尤特奇l(例如尤特奇l 100-55；尤特奇l 30d-55)、尤特奇s、尤特奇rl、尤特奇rs、尤特奇e、或尤特奇fs(例如尤特奇fs 30d)。
70.在一些实施例中，肠溶包衣包含邻苯二甲酸乙酸纤维素(cap)、偏苯三酸乙酸纤维素(cat)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(pvap)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hpmcp)、脂肪酸、蜡、虫胶(紫胶桐酸的酯)、塑料、植物纤维、玉米醇溶蛋白、aqua-zein(不含醇的水性玉
米醇溶蛋白配制品)、直链淀粉、淀粉衍生物、糊精、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基醋酸琥珀酸纤维素(醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、或海藻酸钠。
71.在一些实施例中，肠溶包衣包含阴离子聚合物材料。
72.药剂可以是粉剂，该粉剂包含细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分，并且可以包含另外的试剂，例如，如冷冻保护剂。例如，在一些实施例中，药剂是细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分的冻干粉剂，该螺旋藻属组分任选地，进一步包含另外的试剂，例如冷冻保护剂。
73.在一些实施例中，药剂包含细菌并且细菌的剂量为约1x 107至约2x 10
12
(例如，约3x 10
10
或约1.5x 10
11
)细胞(例如，其中通过coulter计数器确定的总细胞计数来确定细胞数)，其中剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
74.在一些实施例中，药剂包含细菌并且细菌的剂量为约1x 107至约1x 10
13
，其中剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。在一些实施例中，药剂包含细菌并且细菌的剂量为约1x 109、约3x 109、约5x 109、约1.5x 10
10
、或约5x 10
10
个细胞，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。在一些实施例中，药剂包含细菌并且细菌的剂量为约8x 10
10
个细胞，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。在一些实施例中，药剂包含细菌并且细菌的剂量为约1.6x 10
11
个细胞，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。在一些实施例中，药剂包含细菌并且细菌的剂量为约3.2x 10
11
个细胞，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
75.在一些实施例中，药剂包含mev并且mev的剂量为约1x 105至约2x 10
12
个颗粒(例如，其中通过nta(纳米颗粒跟踪分析)确定颗粒计数)，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
76.在一些实施例中，药剂包含粉剂，该粉剂包含细菌和/或mev，并且该药剂(例如包含细菌和/或mev的粉剂)的剂量为约10mg至约3500mg，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
77.在一些实施例中，药剂包含粉剂，该粉剂包含细菌和/或mev，并且该药剂(例如包含细菌和/或mev的粉剂)的剂量为约30mg至约1300mg(按细菌和/或mev粉剂的重量计)(约25、约30、约35、约50、约75、约100、约120、约150、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约700、约750、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1250、约1300、约2000、约2500、约3000、或约3500mg，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
78.在一些实施例中，药剂包含细菌和/或mev，并且该药剂(例如细菌和/或mev)的剂量为约2x106至约2x10
16
个颗粒(例如，其中通过nta(纳米颗粒跟踪分析)确定颗粒计数)，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
79.在一些实施例中，药剂包含细菌和/或mev，并且该药剂(例如细菌和/或mev)的剂量为约5mg至约900mg总蛋白(例如，其中总蛋白通过布拉德福德(bradford)测定或bca确定)，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中全部微型片剂的剂量。
80.在一些方面，本披露提供了预防或治疗受试者(例如人)(例如需要治疗的受试者)的方法，该方法包括向该受试者施用本文提供的药物组合物。在一些方面，本披露提供了预
防或治疗受试者(例如人)(例如需要治疗的受试者)的方法，该方法包括向该受试者施用本文提供的固体剂型。在一些方面，本披露提供了用于治疗或预防受试者疾病的药物组合物的用途。在一些方面，本披露提供了用于治疗或预防受试者疾病的固体剂型的用途。在一些方面，本披露提供了本文提供的药物组合物或固体剂型在制备用于治疗受试者(例如人)(例如需要治疗的受试者)的药物中的用途。
81.在一些实施例中，本文提供的药物组合物和/或固体剂型治疗癌症、炎症、自身免疫、代谢病症或菌群失调。
82.在一些实施例中，本文提供的药物组合物和/或固体剂型治疗细菌性败血症性休克、细胞因子风暴和/或病毒感染(例如冠状病毒感染、流感感染和/或呼吸道合胞病毒感染)。
83.在一些实施例中，本文提供的药物组合物和/或固体剂型降低炎性细胞因子表达(例如，降低il-8、il-6、il-1β、和/或tnfα表达水平)。
84.在某些方面，本文提供了制备固体剂型的方法，该方法包括(a)将以下组合：(i)本文提供的药剂(例如，本文披露的细菌和/或细菌来源的试剂，例如本文披露的mev)(例如，包含至少一种螺旋藻组分)和(ii)至少一种稀释剂、至少一种润滑剂、至少一种助流剂、和/或至少一种(例如，一种、两种或三种)崩解剂，和(b)将该药物组合物压制成固体剂型。在一些实施例中，该方法进一步包括将该固体剂型进行肠溶包衣以获得经肠溶包衣的固体剂型的步骤。在一些实施例中，固体剂型是片剂。在一些实施例中，固体剂型是微型片剂。
85.在某些方面，本文提供了制备固体剂型的方法，该方法包括将以下组合：(i)药剂(例如，本文披露的细菌和/或细菌来源的试剂，例如本文披露的mev)(例如，包含至少一种螺旋藻属组分)，和(ii)稀释剂、润滑剂、和/或助流剂，例如，组合为药物组合物。在一些实施例中，该方法包括混合。在一些实施例中，该方法进一步包括将药物组合物装载到胶囊中。在一些实施例中，胶囊包含hpmc。
86.在一些实施例中，该方法进一步包括对胶囊进行封口。在一些实施例中，将该胶囊用基于hpmc的封口溶液封口。
87.在一些实施例中，该方法进一步包括将该固体剂型进行肠溶包衣以获得经肠溶包衣的固体剂型的步骤。在一些实施例中，固体剂型是胶囊。
88.在某些方面，本文提供了测试包含细菌(例如，本文提供的细菌)和/或mev(例如，本文提供的mev)(例如，本文提供的药物组合物和/或本文提供的固体剂型)的药物组合物和/或固体剂型的方法，该方法包括进行测定以检测药物组合物和/或固体剂型中螺旋藻组分的存在。
89.在某些方面，本文提供了测试包含细菌(例如，本文提供的细菌)和/或mev(例如，本文提供的mev)(例如，本文提供的药剂)的药剂的方法，该方法包括进行测定以检测药剂中螺旋藻组分的存在。
90.在某些实施例中，螺旋藻组分包含螺旋藻核酸。在一些实施例中，螺旋藻核酸是螺旋藻dna。在一些实施例中，螺旋藻dna包含编码c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)的序列。在一些实施例中，螺旋藻dna包含编码叶绿素a合成酶(chig)的序列。在一些实施例中，检测螺旋藻组分存在的测定是核酸扩增测定、测序测定、和/或微阵列测定。在一些实施例中，检测螺旋藻组分存在的测定是聚合酶链反应(pcr)测定，例如定量聚合酶链反应(qpcr)测定或数字
pcr。
91.在某些实施例中，螺旋藻组分是螺旋藻蛋白。在一些实施例中，螺旋藻蛋白是藻蓝蛋白。在一些实施例中，使用对螺旋藻蛋白具有特异性的抗体、hplc或uplc来检测该螺旋藻蛋白。
92.在某些实施例中，螺旋藻组分包含螺旋藻小分子。在一些实施例中，螺旋藻小分子是螺旋藻色素。在一些实施例中，螺旋藻色素是螺旋藻是叶绿酸。在一些实施例中，螺旋藻色素是螺旋藻是β胡萝卜素。在一些实施例中，螺旋藻色素通过hplc或uplc来检测。
具体实施方式
93.在某些方面，本文提供了包含细菌(或其组分，例如mev)和至少一种螺旋藻组分(例如，核酸螺旋藻组分、蛋白螺旋藻组分、和/或小分子螺旋藻组分)的药物组合物和/或固体剂型。在某些方面，本文提供了制造和/或使用此类药物组合物和/或固体剂型的方法。在一些方面，本文提供了确定在这样的药物组合物或固体剂型中的至少一种螺旋藻组分的存在和/或量的方法。
94.在某些方面，本文提供了包含细菌(或其组分，例如mev)和至少一种螺旋藻组分(例如，核酸螺旋藻组分、蛋白螺旋藻组分、和/或小分子螺旋藻组分)的药剂。在某些方面，本文提供了制造和/或使用此类药剂的方法。在一些方面，本文提供了确定在此类药剂中的至少一种螺旋藻组分存在和/或量的方法。
95.定义
[0096]“佐剂”或“辅助疗法”在广义上是指影响受试者(例如人)中的免疫学或生理学反应的药剂。例如，佐剂可增加抗原随时间或在目的区域(如肿瘤)中的存在，帮助吸收抗原呈递细胞抗原，活化巨噬细胞及淋巴细胞并且支持细胞因子的产生。通过改变免疫应答，佐剂可允许使用较小剂量的免疫相互作用剂以增加特定剂量的免疫相互作用剂的有效性或安全性。例如，佐剂可预防t细胞耗竭且由此增加特定免疫相互作用剂的有效性或安全性。
[0097]“施用”广义上是指将组合物(例如，药物组合物，例如本文所述的药剂的固体剂型)施用给受试者的途径。施用途径的实例包含口服施用、直肠施用、局部施用、吸入(经鼻)或注射。注射施用包括静脉内(iv)、肌内(im)、肿瘤内(it)及皮下(sc)施用。本文所述的药物组合物可以任何形式通过任何有效途径施用，包括但不限于瘤内、口服、肠胃外、肠内、静脉内、腹膜内、局部、经皮(例如，使用任何标准贴剂)、皮内、经眼、经鼻(鼻内)、局部、非经口(诸如喷雾)、吸入、皮下、肌内、颊、舌下、(经)直肠、阴道、动脉内及鞘内、经黏膜(例如，舌下、经舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如，经阴道及阴道周围)、植入、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内及支气管内。在优选的实施例中，通过以下形式施用本文所述的药物组合物：口服、经直肠、经肿瘤内、经局部、经膀胱内、通过注射至引流淋巴结中或毗邻引流淋巴结处、经静脉内、通过吸入或气溶胶或经皮下。在另一个优选实施例中，本文所述的药物组合物口服、经肿瘤内或经静脉内施用。在另一个实施例中，本文所述的药物组合物经口服施用。
[0098]
如本文所使用的，“厌氧条件”是与正常大气条件相比具有降低的氧水平的条件。例如，在一些实施例中，厌氧条件是其中氧水平是氧分压(po2)不超过8％的条件。在一些情况下，厌氧条件是其中po2不超过2％的条件。在一些情况下，厌氧条件是其中po2不超过0.5％的条件。在某些实施例中，厌氧条件可以通过用除了氧以外的气体(例如，氮气和/或
二氧化碳(co2))吹扫生物反应器和/或培养瓶来实现。
[0099]“癌症”在广义上是指宿主自有细胞的不受控、异常生长，其会侵袭宿主中的环绕组织及潜在地远离异常细胞生长初始位点的组织。主要种类包含是上皮组织(例如皮肤、鳞状细胞)癌症的癌瘤；是结缔组织(例如骨、软骨、脂肪、肌肉、血管等)癌症的肉瘤；是血液形成组织(例如骨髓组织)癌症的白血病；是免疫细胞癌症的淋巴瘤及骨髓瘤；及包括脑及脊柱组织癌症的中枢神经系统癌症。“一种或多种癌症”和“一种或多种赘瘤”在本文中可互换使用。如本文中所使用，“癌症”是指所有类型的新或复发癌症或赘瘤或恶性肿瘤，包含白血病、上皮癌及肉瘤。癌症的具体实例是：上皮癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及混合型肿瘤。癌症的非限制性实例是以下新或复发癌症：脑癌、黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌及髓母细胞瘤。在一些实施例中，癌症包含实体瘤。在一些实施例中，癌症包含转移。
[0100]“碳水化合物”是指糖或糖聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”及“寡糖”可互换使用。大部分碳水化合物是具有许多羟基的醛或酮，通常在分子的每一碳原子上具有一个羟基。碳水化合物通常具有分子式c
nh2non
。碳水化合物可为单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。最基本的碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖及果糖。二糖是两个接合的单糖。示例性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖及乳糖。通常，寡糖包括三至六个单糖单元(例如棉子糖、水苏糖)，且多糖包含六个或更多个单糖单元。示例性多糖包含淀粉、糖原及纤维素。碳水化合物可含有经修饰糖单元，例如2
’‑
脱氧核糖，其中去除羟基，2
’‑
氟核糖，其中羟基经氟代替；或n-乙酰基葡萄糖胺，其为葡萄糖的含氮形式(例如2
’‑
氟核糖、脱氧核糖及己糖)。碳水化合物可以许多不同形式存在，例如构象异构体、环状形式、非环状形式、立体异构体、互变异构体、端基差向异构体及异构体。
[0101]“细胞增强”广泛地指细胞的流入或细胞在环境中的扩增，这些细胞在施用组合物之前大体上不存在于该环境中且不存在于该组合物本身中。增强环境的细胞包括免疫细胞、基质细胞、细菌及真菌细胞。特别受关注的环境是其中癌细胞驻留或定位的微环境。在一些实例中，该微环境是肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结。在其他实例中，该微环境是癌前组织位点或组合物的局部施用位点或其中该组合物在远程施用后将积聚的位点。
[0102]
来自两种或更多种菌株的细菌的“组合”包括细菌的物理共存(在相同材料或产品中或在物理连接的产品中)，及来自两种或更多种菌株的细菌的时间共施用或共定位。
[0103]
来自两个或更多个微生物(例如细菌)菌株的mev(例如smev和/或pmev)的“组合”包括从其获得mev(例如smev和/或pmev)的微生物在同一材料或产品中或在物理相连的产品中物理共存，以及来自两个或更多个菌株的mev(例如smev和/或pmev)在时间上共同施用或共同定位。
[0104]
术语“降低”或“消耗”意指变化，从而治疗后与治疗前状态相比的差异(视情况而定)为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1/100、1/1000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或不可检测。可降低的性质包含免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物的数量；细胞因子的水平；或另一物理参数(如耳厚度(例如，在dth动物模型中)或肿瘤的大小)。
[0105]“菌群失调”是指肠道或其他身体区域的微生物群或微生物组的状态，包括，例如，黏膜或皮肤表面(或任何其他微生物组生态位)，在该状态下宿主肠道微生物组生态网络“微生物组”的正常的多样性和/或功能被破坏。菌群失调可能导致疾病状态，或者仅在某些条件下或仅长期存在时可能是不健康的。菌群失调可能是由于多种因素引起的，包括环境因素、传染原、宿主基因型、宿主饮食和/或压力。菌群失调可能导致：一个或多个细菌类型(例如，厌氧菌)、物种和/或菌株的普遍度发生变化(例如，增加或减少)，宿主微生物组群体组成的多样性发生变化(例如，增加或减少)；导致一个或多个有益效应减少或丧失的一个或多个共生生物群体的变化(例如，增加或减少)；一个或多个病原体(例如，病原细菌)群体的过度生长；和/或仅在某些情况下引起疾病的共生生物的存在、和/或过度生长。
[0106]
如本文所用，“工程细菌”是通过人类活动已在遗传上自天然状态改变的任何细菌及任何这类细菌的子代。工程改造的细菌包括例如靶向遗传修饰的产物、随机诱变筛选的产物及定向演化的产物。
[0107]
术语“表位”意指可特异性结合至抗体或t细胞受体的蛋白质决定子。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面分组组成。某些表位可通过抗体能够结合的氨基酸的特定序列来定义。
[0108]
术语“基因”在广义上用于指与生物功能有关的任一核酸。术语“基因”适用于特定基因组序列以及由基因组序列编码的cdna或mrna。
[0109]
如本文所使用的，“血红蛋白依赖性细菌”是指当在缺乏血红蛋白、血红蛋白衍生物或螺旋藻属的生长培养基中培养时(与含有血红蛋白、血红蛋白衍生物或螺旋藻属的培养基相比)，其生长速率减慢和/或最大细胞密度降低的细菌。
[0110]
两种核酸分子的核酸序列间“同一性”可使用已知计算机算法(诸如“fasta”程序)使用(例如)如pearson等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444中的预设参数测定为同一性百分比(其他程序包含gcg程序包(devereux,j.等人,nucleic acids research[核酸研究]12(i):387(1984))、blastp、blastn、fasta atschul,s.f.等人,j molec biol[分子生物学杂志]215:403(1990)；guide to huge computers[巨型计算机指南],mrtin j.bishop编辑,academic press[学术出版社],san diego[圣地亚哥],1994及carillo等人(1988)siam j applied math[工业和应用数学学会应用数学杂志]48:1073)。例如，可使用国家生物技术信息中心数据库(national center for biotechnology information database)的blast功能来测定同一性。其他可商业或公开获得的程序包含dnastar“megalign”程序(威斯康星州麦迪逊市(madison,wis.))及威斯康星大学遗传学计算机集团(university of wisconsin genetics computer group)(uwg)“gap”程序(威斯康星州麦迪逊市(madison,wis.))。
[0111]
如本文中所使用，术语“免疫障碍”是指由免疫系统的活动引起的任何疾病、障碍或疾病症状，包括自身免疫性疾病、炎性疾病及过敏。免疫障碍包括(但不限于)自身免疫性疾病(例如，银屑病、特应性皮炎、狼疮、硬皮病、溶血性贫血、血管炎、一型糖尿病、格雷夫病(grave’s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化、古德帕斯雷综合征(goodpasture’s syndrome)、恶性贫血和/或肌病)、炎性疾病(例如，寻常型痤疮、哮喘、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、炎性肠病、盆腔炎、再灌注损伤、类风湿性关节炎、肉状瘤病、移植排斥、血管炎和/或间质性膀胱炎)，和/或过敏(例如，食物过敏、药物过敏和/或环境过敏)。
[0112]“免疫疗法”是使用受试者的免疫系统以治疗疾病(例如，免疫疾病、炎性疾病、代谢疾病、癌症)的治疗且包括例如检查点抑制剂、癌症疫苗、细胞因子、细胞疗法、car-t细胞
及树突细胞疗法。
[0113]
术语“增加”意指变化，从而治疗后与治疗前状态相比的差异(视情况而定)为至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、4倍、10倍、100倍、10^3倍、10^4倍、10^5倍、10^6倍和/或10^7倍。可增加的性质包括免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物的数量；细胞因子的水平；或另一物理参数(如耳厚度(例如，在dth动物模型中)或肿瘤的大小)。
[0114]“先天免疫激动剂”或“免疫佐剂”是特异性靶向先天免疫受体(包括toll样受体(tlr)、nod受体、rlr、c型凝集素受体、sting-cgas通路组分、发炎体复合物)的小分子、蛋白质或其他药剂。例如，lps是细菌源的或合成的tlr-4激动剂且可使用铝作为免疫刺激佐剂。免疫佐剂是特定种类的较宽泛佐剂或辅助疗法。sting激动剂的实例包括(但不限于)2'3'-cgamp、3'3'-cgamp、c-di-amp、c-di-gmp、2'2'-cgamp及2'3'-cgam(ps)2(rp/sp)(2'3'-cgamp的双硫代磷酸酯类似物的rp、sp异构物)。tlr激动剂的实例包括(但不限于)tlrl、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlrlo及tlri l。nod激动剂的实例包括(但不限于)：n-乙酰基胞壁酰基-l-丙胺酰基-d-异谷氨酰胺(胞壁酰二肽(mdp))、γ-d-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸(ie-dap)及去胞壁酰肽(desmuramylpeptide(dmp))。
[0115]“内转录间隔区”或“its”是位于通常用于识别真核物种(特别地，真菌)的共同前体转录本上的结构核糖体rna(rrna)之间的一段非功能性rna。形成核糖体的核的真菌的rrna经转录为信号基因且由8s、5.8s及28s区域及分别在8s与5.8s之间及5.8s与28s区域之间的its4及5组成。如先前描述，在18s与5.8s之间及5.8s与28s区域之间的这类两个双译基因嵌段(intercistronic segment)通过剪接移除且出于条形码的目的在物种之间含有显著变化(schoch等人,nuclear ribosomal internal transcribed spacer(its)region as auniversal dna barcode marker for fungi[核糖体内转录间隔区(its)是真菌的通用dna条形码标记].pnas 109:6241-6246.2012)。18srdna传统上用于系统发育重建，然而its可发挥此功能，因为其通常是高度保守的，但含有高变区，这些高变区具有足够的核苷酸多样性来区分大多数真菌的属及物种。
[0116]
术语“分离的”或“富集的”涵盖具有以下特征的微生物(例如细菌)、mev(例如smev和/或pmev)或其他实体或物质：(1)与在最初产生(不论在自然界中或在实验环境中)时与其缔合的至少一些组分分离，和/或(2)人工产生、制备、纯化和/或制造。分离的微生物或mev可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其最初关联的其他组分分离。在一些实施例中，分离的微生物或mev是大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯的。如本文所用，物质基本上不含其他组分时是“纯的”。术语“纯化(purify)”、“进行纯化(purifying)”及“纯化的(purified)”是指已与在最初产生或生成(例如不论在自然界中或在实验环境中)时或在其初始产生之后的任一时间期间与其缔合的至少一些组分分离的微生物或mev或其他材料。如果在产生时或在产生之后诸如自含有微生物或微生物群体的材料或环境分离，则所述微生物或微生物群体或mev可视为纯化的，且纯化的微生物或微生物群体或mev可含有高达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或高于约90％的其他材料且仍视为“分离的”。在一些实施例中，纯化的微生物或微生物群体或mev是大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约
93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯的。在本文所提供微生物组合物的情况下，存在于该组合物中的一种或多种微生物类型可与独立于一种或多种产生和/或存在于含有该微生物类型的材料或环境中的其他微生物来纯化。微生物组合物及其微生物组分(例如mev)通常纯化自残余生境产物。
[0117]
如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、三酸甘油酯、胆固醇、磷脂质、任何形式的脂肪酸(包括游离脂肪酸)。脂肪、油及脂肪酸可为饱和、不饱和(顺式或反式)或部分不饱和(顺式或反式)。
[0118]
术语“lps突变体或脂多糖突变体”广泛地是指包含lps损失的所选细菌。lps丧失可能是由于与脂质a生物合成相关的基因如lpxa、lpxc和lpxd的突变或破坏所致。包含lps突变体的细菌可能对氨基糖苷类和多粘菌素(多粘菌素b和粘菌素)具有抗性。
[0119]
如本文所用的“代谢物”是指在任何细胞或微生物代谢反应中用作底物或作为产物化合物、组合物、分子、离子、辅助因子、催化剂或营养素产生自任何细胞或微生物代谢反应的任何及所有分子化合物、组合物、分子、离子、辅助因子、催化剂或营养素。
[0120]“微生物”是指表征为古生物、寄生虫、细菌、真菌、微观藻类、原生动物及与该生物体相关的发育阶段或生命周期阶段(例如，植物、孢子(包括孢子形成、休眠及萌发)、潜伏、生物膜)的任何天然或经改造的生物体。肠道微生物的实例包括：葛氏放线菌(actinomyces graevenitzii)、龋齿放线菌(actinomyces odontolyticus)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)、粪拟杆菌(bacteroides caccae)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、腐败拟杆菌(bacteroides putredinis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、普通拟杆菌(bacteroides vultagus)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)、对沃氏嗜胆菌(bilophila wadsworthia)、布劳特氏菌属(blautia)、丁酸弧菌属(butyrivibrio)、纤细弯曲杆菌(campylobacter gracilis)、梭菌群iii(clostridia cluster iii)、梭菌群iv(clostridia cluster iv)、梭菌群ix(clostridia cluster ix)(氨基酸球菌科群(acidaminococcaceae group))、梭菌群xi(clostridia cluster xi)、梭菌群xiii(clostridia cluster xiii)(消化链球菌群(peptostreptococcus group))、梭菌群xiv(clostridia cluster xiv)、梭菌群xv(clostridia cluster xv)、产气柯林斯菌(collinsella aerofaciens)、粪球菌属(coprococcus)、桑氏棒状杆菌(corynebacterium sunsvallense)、猪脱硫单胞菌(desulfomonas pigra)、产甲酸多尔氏菌(dorea formicigenerans)、长链多尔氏菌(dorea longicatena)、大肠杆菌(escherichia coli)、庞大真杆菌(eubacterium hadrum)、直肠真杆菌(eubacterium rectale)、普拉梭菌(faecalibacteria prausnitzii)、孪生球菌属(gemella)、乳球菌属(lactococcus)、兰氏螺菌属(lanchnospira)、柔膜细菌群xvi(mollicutes cluster xvi)、柔膜细菌群xviii(mollicutes cluster xviii)、普雷沃菌属(prevotella)、黏滑罗氏菌(rothia mucilaginosa)、伶俐瘤胃球菌(ruminococcus callidus)、活泼瘤胃球菌(ruminococcus gnavus)、扭链瘤胃球菌(ruminococcus torques)及链球菌属(streptococcus)。
[0121]“微生物胞外囊泡”(mev)可从微生物如细菌、古生菌、真菌、微藻、原生动物和寄生虫获得。在一些实施例中，mev从细菌获得。mev包括分泌型微生物胞外囊泡(smev)和经加工的微生物胞外囊泡(pmev)。“分泌型微生物胞外囊泡”(smev)是来源于微生物的自然产生的
囊泡。smev由微生物脂质和/或微生物蛋白质和/或微生物核酸和/或微生物碳水化合物部分构成，并从培养上清液中分离。这些囊泡的自然产生可以通过操纵细菌细胞正在培养的环境(例如，通过培养基或温度改变)来人为地增强(例如，增加)或减少。此外，smev组合物可以被修饰以减少，增加，添加或去除微生物组分或外来物质，以改变功效、免疫刺激、稳定性、免疫刺激能力、稳定性、器官靶向性(例如，淋巴结)、吸收(例如，胃肠道)和/或产率(例如，由此改变功效)。如本文所用，术语“纯化的smev组合物”或“smev组合物”是指smev的制剂，其已经从源材料中发现的至少一种相关联物质(例如，从至少一种其他微生物组分分离)或用于制备该制剂的任何方法中与smev相关联的任何材料分离。也可指针对特定组分已显著富集的组合物。“经加工的微生物胞外囊泡”(pmev)是从人工裂解的微生物(例如，细菌)纯化的微生物膜组分(例如，已与其他胞内微生物细胞组分分离的微生物膜组分)的非天然存在的集合，并且其可包含根据纯化方法而具有变化的或选定的尺寸范围的颗粒。通过化学破坏(例如，通过溶菌酶和/或溶葡萄球菌素)和/或物理破坏(例如，通过机械力)微生物细胞并通过离心和/或超速离心或其他方法将微生物膜组分与胞内组分分离来获得pmev池。所得pmev混合物含有富集的微生物膜及其组分(例如，外周缔合的或完整的膜蛋白、脂质、聚糖、多糖、碳水化合物、其他聚合物)，使得相对于完整微生物，微生物膜组分的浓度增加，并且胞内内容物的浓度降低(例如，稀释)。对于革兰氏阳性细菌，pmev可以包括细胞膜或细胞质膜。对于革兰氏阴性细菌，pmev可以包括内膜和外膜。pmev可以被修饰以增加纯度，调节组合物中颗粒的尺寸，和/或被修饰以减少、增加、添加或去除微生物组分或外来物质，以改变功效、免疫刺激、稳定性、免疫刺激能力、稳定性、器官靶向性(例如淋巴结)、吸收(例如胃肠道)和/或产率(例如由此改变功效)。pmev可以通过添加、去除、富集或稀释特定组分(包括来自相同或其他微生物的细胞内组分)被修饰。如本文所用，术语“纯化的pmev组合物”或“pmev组合物”是指pmev的制剂，其已经从源材料中发现的至少一种相关联物质(例如，从至少一种其他微生物组分分离)或用于制备该制剂的任何方法中与pmev相关联的任何材料分离。也可指针对特定组分已显著富集的组合物。
[0122]“微生物组”广泛地指栖居于受试者或患者的身体部位上或中的微生物。微生物组中的微生物可包括细菌、病毒、真核微生物和/或病毒。微生物组中的个别微生物可以是代谢活性、休眠、潜伏或作为孢子存在，可以浮游形式存在或存在于生物膜中，或可以可持续或短暂的方式存在于该微生物组中。微生物组可以是共生或健康状态微生物组或疾病状态微生物组。微生物组对受试者或患者而言可以是天然的，或微生物组的组分可因健康状态(例如，癌前状态或癌状态)或处理条件(例如，抗生素治疗、暴露于不同微生物)的变化而经调整、引入或消耗。在一些方面中，微生物组出现于黏膜表面。在一些方面中，微生物组是肠道微生物组。在一些方面中，微生物组是肿瘤微生物组。
[0123]
关于细菌的“经修饰的”广泛地指自野生型形式已经变化的细菌。细菌修饰可以产生自工程菌。细菌修饰的实例包括遗传修饰、基因表达修饰、表型修饰、配制修饰、化学修饰及剂量或浓度。经改善的性质的实例描述于整个说明书中且包括例如减毒、营养缺陷、归巢或抗原性。表型修饰可包括(以实例说明的)细菌于修饰细菌的表型的培养基中生长使得其增加或降低毒力。经修饰的细菌的衍生物(例如mev)可视为经修饰的(例如，经修饰的mev)。
[0124]
如本文中所使用的“肿瘤生物群系(oncobiome)”包含致瘤和/或癌症相关微生物区，其中该微生物区包含病毒、细菌、真菌、原生生物、寄生虫或其他微生物中的一种或多
种。
[0125]“肿瘤营养性(oncotrophic)”或“嗜肿瘤(oncophilic)”微生物及细菌是与癌症微环境高度相关联的微生物或存在于癌症微环境中的微生物。它们可被优先选择用于该环境中，优先在癌症微环境中生长或适应该环境。
[0126]
如本文所用，如果基因在至少一些条件下在工程细菌中的表达水平高于相同物种的野生型细菌在相同条件下的表达水平，则该基因在细菌中“过度表达”。类似地，如果基因在至少一些条件下在工程改造的细菌中的表达水平低于相同物种的野生型细菌在相同条件下的表达水平，则该基因在细菌中“表达不足”。
[0127]
术语“多核苷酸”及“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，且可实施任何功能。多核苷酸的非限制性实例如下：基因或基因片段的编码或非编码区域、定义自连锁分析的多个基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、沉默rna(sirna)、转移rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离的dna、任何序列的经分离的rna、核酸探针及引子。多核苷酸可包括经修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。如果存在，则可在组装聚合物之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。多核苷酸可通过如与标记组分缀合而经进一步修饰。在本文提供的所有核酸序列中，u核苷酸可与t核苷酸互换。
[0128]
如本文所用，术语“预防”受试者中的疾病或病症是指对受试者施用药物治疗，例如，施用一种或多种试剂(例如，药剂)，使得疾病或病症的至少一个症状的发作被延迟或预防。
[0129]
如本文所用，物质基本上不含其他组分时是“纯的”。术语“纯化(purify)”或“进行纯化(purifying)”及“纯化的(purified)”是指mev(例如smev和/或pmev)制剂或其他材料已与最初产生或形成(例如，无论在自然中或在实验环境中)时或在初始产生后的任何时间期间与其相关联的至少一些组分分离。若如果mev(例如smev和/或pmev)制剂或组合物在产生时或产生后与(诸如)一种或多种其他细菌组分分离，则该mev(例如smev和/或pmev)制剂或组合物可被视为纯化的，并且纯化的微生物或微生物群体可含有其他材料多达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或超过约90％且仍被视为“纯化的”。在一些实施例中，纯化的mev(例如smev和/或pmev)是超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或超过约99％纯的。mev(例如smev和/或pmev)组合物(或制剂)例如从残余生境产物纯化。
[0130]
如本文中所使用，术语“纯化的mev组合物”或“mev组合物”是指如下的制剂：其包括已与源材料或在用以产生该制剂的任何方法中与mev(例如smev和/或pmev)相关联的任何材料中发现的至少一种相关联物质分离(例如，与至少一种其他细菌组分分离)的mev(例如smev和/或pmev)。它还指已经显著富集或浓缩的组合物。在一些实施例中，mev(例如smev和/或pmev)被浓缩2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或超过10,000倍。
[0131]
如本文所用，“特异性结合”是指抗体能够结合至预定抗原或多肽能够结合至其预定结合配偶体。通常，抗体或多肽以对应于约10-7
m或更小kd的亲和力特异性结合至其预定抗原或结合配偶体，且以相对于结合至非特异性及不相关抗原/结合配偶体(例如bsa、酪蛋白)小至少10倍、小至少100倍或不超过至少1000倍的其亲和力的亲和力(如通过kd所表示)
结合至预定抗原/结合配偶体。可替代地，特异性结合更广泛地适用于二组分系统，其中一种组分是蛋白质、脂质或碳水化合物或其组合且与是蛋白质、脂质、碳水化合物或其组合的第二组分以特定方式接合。
[0132]“菌株”是指具有基因签名的细菌物种的成员，从而其可与相同细菌物种的密切相关成员区分开来。基因签名可为不存在至少一种基因的全部或一部分、不存在至少一个调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)的全部或一部分、不存在(“消除”)至少一种天然质粒、存在至少一种重组基因、存在至少一种突变基因、存在至少一种外来基因(衍生自另一物种的基因)、存在至少一种突变调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)、存在至少一种非天然质粒、存在至少一种抗生素抗性盒或其组合。可通过pcr扩增且任选地随后进行一个或多个目的基因组区域或全基因组的dna测序来鉴别不同菌株之间的基因签名。如果一种菌株(与相同物种的另一种菌株相比)已获得或失去抗生素抗性或获得或失去生物合成能力(例如营养缺陷型菌株)，则可通过选择或反选择分别使用抗生素或营养物/代谢物来区分菌株。
[0133]
术语“受试者”或“患者”是指任何哺乳动物。描述为“有需要”的受试者或患者是指需要治疗(或预防)疾病的人。哺乳动物(即，哺乳类动物)包括人类、实验室动物(例如灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如牛、绵羊、山羊、猪)及家庭宠物(例如狗、猫、啮齿类动物)。受试者可以是人。受试者可为非人哺乳动物，包括但不限于：狗、猫、牛、马、猪、驴、山羊、骆驼、小鼠、大鼠、天竺鼠、绵羊、骆马、猴、大猩猩或黑猩猩。受试者可为健康的，或可患有任一发展阶段的癌症，其中任一阶段由癌症相关或致病病原体引起或伺机性地支持所述病原体，或受试者可处于发生癌症或向其他受试者传播癌症相关或癌症致病病原体的风险中。在一些实施例中，受试者患有肺癌、膀胱癌、前列腺癌、浆细胞瘤、结直肠癌、直肠癌、默克尔细胞癌、唾液腺癌、卵巢癌和/或黑色素瘤。受试者可以具有肿瘤。受试者可以具有展示增强的大型胞饮作用的肿瘤，其中此过程的潜在基因组学包含ras活化。在其他实施例中，受试者患有另一种癌症。在一些实施例中，受试者已经接受癌症疗法。
[0134]
如本文所用，在用包含本发明的细菌或mev的药剂(例如，包含细菌或mev的药剂)治疗的受试者中的“系统作用”是指在胃肠道外的一个或多个部位发生的生理作用。一种或多种系统性作用可以由免疫调节(例如，通过增加和/或减少一种或多种免疫细胞类型或亚型(例如，cd8 t细胞)和/或一种或多种细胞因子)产生。此类一种或多种系统性作用可能是由本发明的细菌或mev对胃肠道中的免疫细胞或其他细胞(例如上皮细胞)调节的结果，然后这直接地或间接地导致胃肠道外的一个或多个生物化学途径的活性改变(活化和/或失活)。全身性效应可包括治疗或预防受试者的疾病或病症。
[0135]
如本文中所使用，术语“治疗”受试者疾病或“治疗”患有或怀疑患有疾病的受试者是指对受试者施用医药治疗(例如施用一种或多种药剂)，从而降低至少一种疾病症状或预防其恶化。因此，在一个实施例中，“治疗”尤其是指延迟进展、促进缓解、诱导缓解、增大缓解、加速恢复、增加功效或降低替代治疗的抗性，或其组合。
[0136]
如本文所使用的，如果一个值高出任何数量，则该值“大于”另一个值(例如，100、50、20、12、11、10.6、10.1、10.01和10.001中的每一个是至少10)。类似地，如本文所使用的，如果一个值低出任何数量，则该值“小于”另一个值(例如，1、2、4、6、8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、9.9、9.99、9.999中的每一个是不超过10)。相反，如本文所使用的，当测试值四舍五入到锚
定值时，测试值“是”锚定值(例如，如果“成分质量是总质量的10％”(在这种情况下，锚定值是10％)，则测试值9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3和10.4也将满足“成分质量是总质量的10％”特征)。
[0137]
螺旋藻的组分
[0138]
螺旋藻和/或某些螺旋藻衍生组分(例如，可溶性螺旋藻组分)可用于在生长培养基中代替血红蛋白以促进其他血红蛋白依赖性细菌的体外培养。螺旋藻属是钝顶节旋藻和/或极大节旋藻蓝藻细菌的生物质，其在墨西哥和一些非洲国家已经被人食用了几个世纪。最近，螺旋藻属被认为是蛋白质和许多营养素的丰富来源，因此通常作为营养补品食用。由于螺旋藻属相对便宜、素的、按犹太教规供应的(kosher)且易于获得gmp级，因此它在细菌细胞培养应用中是血红蛋白的有吸引力的替代品。
[0139]
如本文所证明的，在包含螺旋藻的生长培养基中培养细菌产生包含所述细菌或来自其的试剂(例如mev)并且包含螺旋藻或其组分的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型。本披露提供此类试剂和组合物及其用途，以及测试所述试剂和组合物的方法以检测螺旋藻或其组分的存在。
[0140]
存在螺旋藻的各种组分，并且可以在本文所述的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型中检测到，这些组分包括螺旋藻核酸、螺旋藻蛋白和/或螺旋藻小分子，例如色素。
[0141]
在某些实施例中，本披露的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型包含螺旋藻核酸。
[0142]
在一些实施例中，螺旋藻组分是螺旋藻核酸。如本文所用，螺旋藻核酸旨在包括dna(例如，基因组dna、cdna)和rna(例如，mrna、trna、rrna、编码rna、非编码rna、小rna等)。核酸分子可以是单链的或双链的。在某些实施例中，螺旋藻核酸是螺旋藻基因组dna。螺旋藻核酸可以包含编码序列(例如，编码螺旋藻蛋白的序列)。在一些实施例中，螺旋藻核酸仅包含编码螺旋藻蛋白的序列的一部分。在一些实施例中，螺旋藻核酸包含非编码序列。
[0143]
在某些实施例中，核酸是螺旋藻dna。示例性螺旋藻基因组核酸序列可衍生自ncbi参照序列：nz_afxd00000000.1钝顶节旋藻c1，全基因组鸟枪法测序计划(万维网ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nz_afxd00000000.1)。基于光学作图，估计钝顶节旋藻的基因组结构是6.8mb的单个、环状染色体。该6.7mb序列的注释产生了6630个蛋白编码基因(参见fujisawa等人.(2010)dna res.[dna研究]17:85-103)。
[0144]
在一些实施例中，螺旋藻dna包含编码螺旋藻蛋白的序列。在一些实施例中，螺旋藻dna包含编码c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)、藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpce)、藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpcf)、或叶绿素a合成酶(chig)的序列。在一些实施例中，螺旋藻dna包含编码c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)或叶绿素a合成酶(chig)的序列。
[0145]
在某些实施例中，本披露的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型包含螺旋藻蛋白。在一些实施例中，螺旋藻蛋白是藻蓝蛋白。藻蓝蛋白是来自光捕获藻胆蛋白家族的色素-蛋白复合物。藻蓝蛋白是叶绿素的辅助色素、在螺旋藻中发现但未在血红蛋白依赖性细菌中发现。在一些实施例中，藻蓝蛋白是c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)、藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpce)、藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpcf)、或叶绿素a合成酶(chig)。在一些实施例中，藻蓝蛋白是c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)或叶绿素a合成酶(chig)。
[0146]
在某些实施例中，本披露的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型包含螺旋藻小分
子。在一些实施例中，螺旋藻小分子是螺旋藻色素。在一些实施例中，该螺旋藻色素是叶绿酸或β胡萝卜素。
[0147]
螺旋藻组分的示例性核酸序列示于下表a中。
[0148]
表a：螺旋藻示例性组分的序列
[0149]
seq id no:1钝顶节旋藻叶绿素合成酶chlg氨基酸序列(ncbi参照序列wp_006619293.1)
[0150][0151][0152]
seq id no:2钝顶节旋藻叶绿素合成酶(chlg)cdna序列(ncbi参照序列：nc_016640.1)
[0153][0154]
seq id no:3钝顶节旋藻c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)氨基酸序列(ncbi参照序列：yp_005068163)
[0155][0156]
seq id no:4钝顶节旋藻c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)核酸序列(ncbi参照序列：nc_016640.1)
[0157][0158]
seq id no:5钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpce)氨基酸序列(ncbi参照序列：yp_005068159)
[0159][0160][0161]
seq id no:6钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpce)核酸序列(ncbi参照序列：nc_016640.1)
[0162][0163]
seq id no:7钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpcf)氨基酸序列(ncbi参照序列：yp_005068158)
[0164][0165]
seq id no:8钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基藻蓝素裂解酶(cpcf)核酸序列(ncbi参照序列：nc_016640.1)
[0166][0167]
*表a中包括rna核酸分子(例如，经尿苷代替的胸苷)、以及dna或rna核酸序列，这些dna或rna核酸序列包含跨越核酸序列全长与表a中列出的任何seq id no的核酸序列或其部分具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性的序列。
[0168]
螺旋藻组分的检测
[0169]
在某些方面，本文提供的方法和组合物涉及测试药剂或药物组合物或固体剂型的方法，以检测(例如，测定)药剂或药物组合物或固体剂型中螺旋藻组分存在。本文所述的任何适合的方法或本领域已知的方法可用于检测螺旋藻组分。在某些实施例中，在测试之前通过将药剂或药物组合物或固体剂型溶解在合适的缓冲液/介质中，可以容易地制备用于检测的样品。
[0170]
在一些实施例中，螺旋藻的组分包含螺旋藻核酸。在一些实施例中，螺旋藻核酸是螺旋藻dna。在一些实施例中，螺旋藻dna包含编码c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)或叶绿素a合成酶(chig)的序列。在某些实施例中，使用核酸扩增测定、测序测定、和/或微阵列测定检测螺旋藻核酸(例如dna)。在优选的实施例中，使用聚合酶链反应(pcr)测定，例如定量聚合酶链反应(qpcr)测定或数字pcr检测螺旋藻组分(例如，核酸)的存在。
[0171]
在一些实施例中，螺旋藻的组分包含螺旋藻蛋白。在一些实施例中，螺旋藻蛋白是藻蓝蛋白。在一些实施例中，螺旋藻组分包含螺旋藻小分子(例如，色素)。在一些实施例中，螺旋藻色素是螺旋藻是叶绿酸或β胡萝卜素。在优选的实施例中，通过高效液相色谱(hplc)或超高效液相色谱(uplc)检测螺旋藻蛋白或螺旋藻小分子(例如，色素)。在一些实施例中，通过质谱(例如，串联质谱，maldi-tof)检测该螺旋藻蛋白或螺旋藻小分子(例如，色素)。
[0172]
核酸检测
[0173]
在某些方面，本文提供了涉及螺旋藻核酸检测的方法。
[0174]
在一些实施例中，可以分离螺旋藻核酸，然而，本领域的技术人员将理解许多检测测定(例如，pcr，例如，qpcr或数字pcr)可以检测样品中的核酸而无需分离核酸。可以使用标准分子生物学技术和在公共数据库记录(例如，ncbi、uniprot等)的序列信息分离核酸。使用所有或部分此类核酸序列，本发明的核酸分子可以使用标准杂交技术和克隆技术(例如，如在green和sambrook,编辑,molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],第四版,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),冷泉港(cold spring harbor),纽约,2014中所述)进行分离。
[0175]
在其他实施例中，基于扩增的测定可用于确定螺旋藻dna的量的存在。在此类基于
扩增的测定中，核酸序列在扩增反应中(例如，聚合酶链反应(pcr))充当模板。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样本中的模板的量成比例(参见例如，kralik和ricchi(2017)front.microbiol.[微生物学前沿]8:108)。与适当的对照(例如，细菌核酸序列的扩增)比较，提供了螺旋藻核酸的拷贝数或量的量度。
[0176]“定量”扩增的方法是本领域技术人员熟知的。例如，定量pcr涉及使用相同引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可用于校准pcr反应的内标物。在innis,等人.(1990)pcr protocols,a guide to methods and applications[pcr方案：方法和应用指南],纽约学术出版公司(academic press,inc.)提供了定量pcr的详细方案。使用在ginzonger,等人.(2000)cancer research[癌症研究]60:5405-5409中描述的定量pcr分析测量微卫星基因座处的dna拷贝数。基因的已知的核酸序列足以使本领域技术人员常规地选择引物以扩增基因的任何部分。荧光定量pcr也可用于本发明的方法中。在荧光定量pcr中，定量是基于荧光信号(例如，taqman和sybr green)的量。
[0177]
其他合适的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(lcr)(参见wu和wallace(1989)genomics[基因组]4:560，landegren,等人,(1988)science[科学]241:1077，和barringer等人.(1990)gene[基因]89:117)、转录扩增(kwoh,等人.(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:1173)、自动维持序列复制(guatelli,等人.(1990)proc.nat.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]87:1874)、点pcr、数字pcr和连接接头pcr等。
[0178]
可替代性扩增方法包括：自动维持序列复制(guatelli,j.c.等人.(1990)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]87:1874-1878)、转录扩增系统(kwoh,d.y.等人.(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:1173-1177)、q-β复制酶(lizardi,p.m.等人.(1988)bio-technology[生物技术]6:1197)，或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以极低的数目存在，这些检测方案尤其可用于检测此类分子。
[0179]
为通过扩增方法确定螺旋藻rna的存在或量，进行扩增方法前，rna分子可以首先通过逆转录酶转化为cdna(引物特异性cdna合成)。可使用各种扩增和检测方法。例如，在本发明范围内，将rna逆转录为cdna，随后进行聚合酶链反应(rt-pcr)；或者，如美国专利号5,322,770所述使用单一酶进行两个步骤，或将mrna逆转录为cdna，随后进行对称缺口连接酶链反应(rt-aglcr)，如r.l.marshall,等人.,pcr methods and applications[pcr方法和应用]4:80-84(1994)中所述。也可以使用实时pcr。
[0180]
可用于本文的其他已知的扩增方法包括但不限于所谓的“nasba”或“3sr”技术，描述于pnas usa[美国国家科学院院刊]87:1874-1878(1990)中，并且也描述于nature[自然]350(第6313号):91-92(1991)中；q-β扩增，如描述于公布的欧洲专利申请(epa)第4544610号；链置换扩增(如描述于g.t.walker等人.clin.chem.[临床化学]42:9-13(1996)和欧洲专利申请号684315；靶介导扩增，如由pct申请wo 9322461所述；pcr；连接酶链反应(lcr)(参见，例如，wu和wallace,genomics[基因组学]4,560(1989)，landegren等人.,science[科学]241,1077(1988))；自动维持序列复制(ssr)(参见，例如，guatelli等人.,proc.nat.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],87,1874(1990))；和转录扩增(参见，例如，kwoh等人.,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86,1173(1989))。
[0181]
在一些实施例中，可以通过对在药剂和/或药物组合物和/或药物产品存在的核酸进行测序来检测本文提供的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型中的螺旋藻核酸的存在。在一些实施例中，使用的测序测定是下一代测序(ngs)测定。核酸测序过程包括，但不限于链终止测序、通过连接测序、通过合成测序、焦磷酸测序、离子半导体测序、单分子实时测序、和/或454测序。在一些实施例中，ngs方式是以下任一种：swabseq、1扩增子、384孔板、96nextera条形码组、udi’s、nextseq；swabseq-1扩增子、384孔板、384truseq udi条形码组、使用nextseq；或swabseq-1扩增子、384孔板、4000udi truseq条形码组、novaseq。swabseq-多重、384孔板、cdi条形码组、novaseq。
[0182]
现有技术中已知的许多技术用于确定样品中核酸的绝对和相对水平。在一些实施例中，螺旋藻核酸的存在和量可以在dna阵列、芯片或微阵列上来检测。从受试者获得的测试样品的经标记的核酸(存在于药剂或药物组合物或固体剂型中的那些)可以与包含螺旋藻核酸(例如，dna或rna)的固体表面杂交。用含有螺旋藻核酸的样品获得阳性杂交信号。制备dna阵列的方法及其用途是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号：6,618,6796；6,379,897；6,664,377；6,451,536；548,257；u.s.20030157485和schena等人.(1995)science[科学]20,467-470；gerhold等人.(1999)trends in biochem.sci.[生物化学科学趋势]24,168-173；和lennon等人.(2000)drug discovery today[今日药物发现]5,59-65，将其内容通过援引以其全文并入本文)。
[0183]
检测螺旋藻核酸的方法包括，但不限于基于杂交的测定。基于杂交的测定包括传统的“直接探针”方法，例如dna印迹或斑点印迹。这些方法可以以多种形式使用，包括但不限于底物(例如，膜或玻璃)结合方法或基于阵列的方法。
[0184]
在一些实施例中，检测样品中的螺旋藻dna涉及dna印迹。在dna印迹中，基因组dna或其片段(通常在电泳凝胶上分离)与对靶区域特异的探针杂交。来自针对螺旋藻dna的探针的杂交信号强度与来自细菌dna分析的对照探针信号的比较提供了螺旋藻核酸的量的估计。为增加测定的特异性，探针在严格条件下与螺旋藻dna杂交。如本文所用，术语“在严格条件下杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件，在该条件下彼此至少60％(65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；优选地85％)相同的核苷酸序列通常保持彼此杂交。此类严格条件是本领域的技术人员已知的并且可以在以下发现：current protocols in molecular biology[当代分子生物学实验指南],约翰威利父子出版社(john wiley&sons),纽约(1989)的第6.3.1-6.3.6章中。严格杂交条件的优选的、非限制性的实例是在约45℃下、在6x氯化钠/柠檬酸(ssc)中杂交，随后在50℃-65℃下在0.2x ssc、0.1％ sds中洗涤一次或多次。探针的标记形式可以是任何适当的形式，例如使用放射性同位素，例如，
32
p和
35
s。无论探针是化学合成或生物合成，都可以通过使用合适的标记碱基实现放射性同位素的标记。
[0185]
可替代地，可以使用rna印迹评估在本披露的药物组合物或固体剂型中的rna的存在或量。在rna印迹中，rna与对螺旋藻rna特异的探针杂交。来自针对螺旋藻rna的探针的杂交信号强度与来自细菌rna分析的对照探针信号的比较提供了螺旋藻rna的相对量的估计。dna印迹和rna印迹的更简单的版本可以使用斑点印迹形式进行，其中包含螺旋藻dna的样品在平台上进行简单点样(不进行电泳分离)并进行杂交方法。
[0186]
蛋白质检测
[0187]
在某些方面，本文提供的方法和组合物涉及螺旋藻蛋白的检测。在本文所述的药剂和/或药物组合物或固体剂型中螺旋藻蛋白的存在或量可以通过本领域已知的各种方法检测。示例性方法包括，但不限于免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光测定、western印迹、结合物-配体测定、免疫组织化学技术、凝集、补体测定、高效液相色谱(hplc)、薄层色谱(tlc)、超扩散色谱等(例如，basic and clinical immunology[基础与临床免疫学],sites和terr编辑,阿普尔顿和兰格公司(appleton and lange),康涅狄格州诺沃克市,第217-262页,1991，将其通过援引并入)。优选的是结合物-配体免疫测定方法，包括使抗体与一个或多个表位反应且竞争性地置换经标记的多肽或其衍生物。
[0188]
例如，可以进行elisa和ria程序，从而标记(用放射性同位素例如
125
i或
35
s，或可测定的酶，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)所需的蛋白标准品(例如，已知的螺旋藻蛋白，在药剂和/或药物组合物或固体剂型中测试其存在)，并且使其与未标记的样品(例如，存在于药剂和/或药物组合物或固体剂型中的螺旋藻蛋白)一起与相应的抗体接触，其中使用第二抗体与第一抗体结合，并测定放射性或固定化酶(竞争性测定)。可替代地，允许在样品中的螺旋藻蛋白与相应的固定化抗体反应，允许放射性同位素标记的抗生物标记物蛋白抗体或酶标记的抗生物标记物蛋白抗体与系统反应，并测定放射性或酶(elisa-夹心法测定)。在合适的情况下，还可以采用其他常规的方法。
[0189]
以上技术基本上可以“一步”或“两步”测定的形式进行。“一步”测定涉及将抗原与固定化抗体接触，且未经洗涤将混合物与经标记的抗体接触。“两步”测定涉及在将混合物与经标记的抗体接触之前进行洗涤。在合适的情况下，还可以采用其他常规的方法。
[0190]
螺旋藻蛋白和/或抗体的酶标记和放射性标记可能受到常规方式的影响。此类方式将通常包括使酶与所讨论的抗原或抗体共价连接，例如通过戊二醛，特别是为了不对酶的活性产生不利影响，这意指酶必须仍然能够与其底物相互作用，尽管不一定所有的酶具有活性，但前提是保持足够的活性使测定受到影响。实际上，用于结合酶的一些技术是非特异性的(例如使用甲醛)，并且将仅产生一定比例的活性酶。
[0191]
通常需要将测定系统的一种组分固定在支持物上，从而允许该系统的其他组分与该组分接触并且容易除去，无需费力并且费时的劳动。可能将第二相固定在第一相之外，但是通常一相已足够。
[0192]
可能将酶本身固定在支持物上，但是如果需要固相酶，那么这通常最好通过与抗体结合并将抗体固定到本领域熟知的支持物、模型和系统上。简单的聚乙烯可以提供合适的支持物。
[0193]
可应用于标记的酶没有特别限制，但可以选自例如氧化酶组的成员。这些通过与它们的底物反应催化过氧化氢的产生，并且葡萄糖氧化酶因其良好的稳定性、易得性和廉价性，以及其底物(葡萄糖)的现成可用性而经常被使用。氧化酶的活性可以在本领域熟知的受控条件下通过测量酶标记的抗体与底物反应后形成的过氧化氢的浓度来测定。
[0194]
基于本披露，根据从业者的偏好，可以使用其他技术检测螺旋藻蛋白。一种这样的技术是western印迹(towbin等人.,proc.nat.acad.sci.[美国国家科学院院刊]76:4350(1979))，其中在转移到固体支持物(例如硝酸纤维素滤膜)之前将适当处理的样品在sds-page凝胶上运行。然后将抗螺旋藻蛋白抗体(未标记)与支持物接触并通过二级免疫试剂
(例如经标记的蛋白a或抗免疫球蛋白(合适的标记包括
125
i、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶))测定。还可以使用色谱检测。
[0195]
可以用于检测螺旋藻蛋白的抗体包括任何抗体，无论是天然的或合成的、全长或其片段、单克隆或多克隆，其与待检测的蛋白充分地且特异性结合。抗体可以具有至多约10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、或10-12
m的kd。短语“特异性结合”是指例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇结合，以这样的方式使得结合可以被相同的或相似的表位、抗原或抗原决定簇的第二制剂置换或竞争。相对于其他蛋白质，例如相关的蛋白质，抗体可以与目标螺旋藻蛋白优先结合。可以根据本领域已知的方法制备抗体。
[0196]
在一些实施例中，使用特异性结合除抗体之外的螺旋藻蛋白的试剂，例如肽或小分子。特异性结合生物标记物蛋白的肽或小分子可以通过本领域已知的任意方式进行鉴定。例如，可以使用肽噬菌体展示文库筛选目标螺旋藻蛋白的特异性肽结合物。
[0197]
螺旋藻蛋白或其片段也可以使用质谱和/或hplc和/或uplc来检测，如下所述用于检测小分子。
[0198]
小分子检测
[0199]
在某些实施例中，本文提供的方法和组合物涉及螺旋藻小分子的检测。
[0200]
在某些实施例中，色谱方法用于检测螺旋藻小分子(或蛋白质)。色谱可以基于某些分析物的差异吸收和洗脱，或基于在流动相和固定相之间分析物的分配。色谱的不同实例包括，但不限于，液相色谱(lc)、气相色谱(gc)、高效液相色谱(hplc)、超高效液相色谱(uplc)等。在某些实施例中，使用色谱方法检测的小分子为色素。在某些实施例中，使用色谱方法检测螺旋藻蛋白。
[0201]
本文所述方法的任一种或组合可用于检测(和定量)存在于本文提供的药物组合物或固体剂型中的螺旋藻的至少一种组分的量。在优选的实施例中，色谱是hplc或uplc。这些方法提供了允许分离和检测存在于药剂或药物组合物或固体剂型中的痕量的至少一种螺旋藻组分的敏感性。
[0202]
可以在伴随或不伴随分离技术下使用质谱，对螺旋藻的小分子、核酸、或蛋白质或其片段进行检测和定量。质谱(ms)是一种测量离子的质荷比的分析技术。这些结果通常表示为质谱，其是以质荷比函数的强度图。质谱用于许多不同领域且适用于纯样品以及复杂混合物。
[0203]
质谱是离子信号以质荷比为函数的图。这些光谱用于确定样品的元素或同位素特征、颗粒和分子的质量，并阐明分子和其他化学化合物的化学相同性或结构。
[0204]
各种基于质谱的方法可以用于检测螺旋藻的小分子、核酸、或蛋白质或其片段，其包括但不限于，串联质谱(ms/ms)、maldi-tof(基质辅助激光解吸/电离源与飞行时间质谱分析器的组合)、电感耦合等离子体-质谱(icp-ms)、加速器质谱(ams)、热电离-质谱(tims)、同位素比质谱(irms)、以及火花源质谱(ssms)。
[0205]
串联质谱仪是一种能够进行多轮质谱的质谱仪，通常通过一些形式的分子片段化进行分离。例如，一台质谱分析器可以从进入质谱仪的许多肽中分离一个肽。然后，第二台质谱分析器在肽离子与气体碰撞时稳定肽离子，通过碰撞诱导解离(cid)造成它们片段化。然后，第三台质谱分析器对肽产生的片段进行分类。串联ms也可以在单个质谱分析器中随时间推移，如在四级离子阱中进行。存在用于使串联ms的分子片段化的各种方法，包括碰撞
诱导解离(cid)、电子捕获解离(ecd)、电子转移解离(etd)、红外多光子解离(irmpd)、黑体红外辐射解离(bird)、电子脱离解离(edd)和表面诱导解离(sid)。使用串联质谱的一个重要的应用是在蛋白鉴定中。
[0206]
螺旋藻小分子、核酸、或蛋白质或其片段的基于质谱的检测，可以通过将其与色谱和/或其他分离技术偶联而增强。分离可以包括本领域已知的任何程序，例如毛细管电泳(例如，在毛细管或芯片中)或色谱(例如，在毛细管、柱或芯片、液相色谱、气相色谱中)。电泳是在电场的影响下可以用于分离离子分子的方法。电泳可以在凝胶、毛细管中、或在芯片微通道中进行。用于电泳得凝胶的实例包括淀粉、丙烯酰胺、聚氧化乙烯、琼脂糖、或其组合物。凝胶可以通过其交联、添加洗涤剂或变性剂、固定酶或抗体(亲和电泳)或底物(酶谱法)以及引入ph梯度进行修饰。用于电泳的毛细管的实例包括与电喷雾连接的毛细管。
[0207]
毛细管电泳(ce)优选用于分离复杂的亲水分子和高度电荷溶质。ce技术也可以在微流控芯片上实施。根据使用的毛细管和缓冲液的类型，ce可以进一步分为分离技术例如毛细管区带电泳(cze)、毛细管等电点聚焦(cief)、毛细管等速电泳(citp)和毛细管电色谱(cec)。将ce技术与电喷雾电离偶联的实施例涉及挥发性溶液的使用，例如，含有挥发性酸和/或碱以及有机(例如乙醇或乙腈)的水性混合物。
[0208]
毛细管等速电泳(citp)是其中分析物以恒定的速度通过毛细管，但仍通过其各自的迁移率分离的技术。毛细管区带电泳(cze)，也称为自由溶液ce(fsce)，是基于物种的电泳迁移率的差异，该电泳迁移率由分子上的电荷和迁移期间分子遇到的摩擦阻力(其通常与分子的大小成正比)决定。毛细管等电点聚焦(cief)允许在ph梯度中，通过电泳分离弱电离两性分子。cec是传统的高效液相色谱(hplc)和ce之间的混合技术。
[0209]
细菌
[0210]
本文披露的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型可以包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)(例如smev和/或pmev)。例如，本文披露的药物组合物和/或固体剂型可以包含含有细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)(例如smev和/或pmev)的粉剂(例如，药剂)。在含有细菌和mev的药剂和/或药物组合物和/或固体剂型中，mev可以来自与药剂的细菌相同的细菌来源(例如，相同菌株)。药剂可以含有来自一个或多个菌株的细菌和/或mev。
[0211]
在一些实施例中，药剂的细菌或药剂的mev自其获得的细菌是血红蛋白依赖性细菌。在一些实施例中，细菌是血红蛋白依赖性细菌。在一些实施例中，mev来自血红蛋白依赖性细菌。如本文所使用的，“血红蛋白依赖性细菌”是指当在缺乏血红蛋白、血红蛋白衍生物或螺旋藻属的生长培养基中培养时(与含有血红蛋白、血红蛋白衍生物或螺旋藻属的相同的生长培养基相比)，其生长速率减慢和/或最大细胞密度降低的细菌。
[0212]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌来自以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、anaerobutyricum属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、氯酸杆菌属、梭菌属、柯林斯菌属、丙酸杆菌属、eisenbergiella属、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、福涅拉氏菌属、梭杆菌属、巨型球菌属、副拟杆菌属、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、rarimicrobium属、沙特尔沃思氏菌属、苏黎世杆菌属、或韦荣氏球菌属。
[0213]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于福涅拉氏菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是福涅拉氏菌属菌株a。
[0214]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性福涅拉氏菌属菌株是福涅拉氏菌属菌株b(atcc
保藏号pta-126696)。在一些实施例中，血红蛋白依赖性福涅拉氏菌属菌株是与福涅拉氏菌属菌株b(pta-126696)的核苷酸序列(例如基因组序列、16s序列、crispr序列)包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
[0215]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于副拟杆菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株a。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是副拟杆菌属菌株b。
[0216]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于粪杆菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是粪杆菌属菌株a。
[0217]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于拟杆菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是拟杆菌属菌株a。
[0218]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于另枝菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是另枝菌属菌株a。
[0219]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于普雷沃菌属。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于以下物种：阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、产黑色素普雷沃菌(prevotella melanogenica)、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌或真空腔普雷沃菌。在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌属于栖组织普雷沃菌物种。
[0220]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性细菌是不明显另枝菌、沙氏另枝菌、替莫另枝菌、凝结芽孢杆菌、产酸拟杆菌、解纤维拟杆菌、埃氏拟杆菌、肠拟杆菌、单形拟杆菌、产气柯林斯菌、cloacibacillus evryensis、尸毒梭菌、耳蜗形梭菌、痤疮丙酸杆菌、eisenbergiella属物种、韦荣球菌科物种、霍氏真杆菌/哈利氏厌氧菌(anaerobutyricum halii)、娇弱真杆菌、微核巨球形菌、狄氏副拟杆菌、泪腺嗜胨菌、rarimicrobium hominis、shuttleworthia satelles、或turicibacter sanguinis。
[0221]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是普雷沃菌属菌株b 50329(nrrl登录号b 50329)。在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是与普雷沃菌属菌株b 50329的核苷酸序列(例如基因组序列、16s序列、crispr序列)包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
[0222]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是普雷沃菌属菌株c(atcc保藏
号pta-126140)。在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是与普雷沃菌属菌株c(pta-126140)的核苷酸序列(例如基因组序列、16s序列、crispr序列)包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
[0223]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多种)表1中所列的蛋白质和/或一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多种)编码表1中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属细菌包含表1中所列的所有蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的所有基因。
[0224]
表1：示例性普雷沃菌属蛋白
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237][0238]
在一些实施例中，普雷沃菌属细菌是不含或基本上不含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种)表2中所列的蛋白质和/或一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种)编码表2中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌不含表2中所列的所有蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的所有基因。
[0239]
表2：其他普雷沃菌属蛋白
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248][0249]
在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是包含表1中所列的蛋白质中的一种或多种且不含或基本上不含表2中所列的一种或多种蛋白质的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，血红蛋白依赖性普雷沃菌属菌株是包含表1中所列的所有蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的所有基因，且不含表2中所列的所有蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的所有基因的普雷沃菌属细菌的菌株。
[0250]
经修饰的细菌和mev
[0251]
在一些实施例中，对药剂的细菌或药剂的mev自其获得的细菌进行修饰以降低毒性或其他不利影响；提高递送(例如口服递送)(例如，通过改良耐酸性、黏液黏着性和/或渗透性和/或对胆汁酸的抗性、消化酶、对抗微生物肽的抗性和/或抗体中和)；靶向所需细胞类型(例如，m细胞、杯状细胞、肠上皮细胞、树突细胞、巨噬细胞)；增强细菌和/或mev的免疫调节和/或治疗效果(例如单独或与另一治疗剂组合)；和/或通过细菌和/或mev(如smev和/或pmev)(例如通过修饰地产生多糖、纤毛、伞毛、黏附素)增强免疫活化或抑制。在一些实施例中，本文描述的工程改造的细菌被修饰以改善细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)制造
(例如，更高的耐氧性、稳定性、改善的冻融耐受性、较短的产生时间)。例如，在一些实施例中，本文描述的工程改造的细菌包括具有一种或多种遗传改变的细菌，此改变包含于细菌染色体或内源性质粒和/或一或多个外源性质粒上的一或多个核苷酸的插入、删除、易位或取代，或其任何组合，其中该遗传改变可导致一或多个基因的过表达和/或低表达。工程改造的细菌可使用本领域中已知的任何技术产生，包括(但不限于)定点诱变、转座子诱变、敲除、敲入、聚合酶链反应诱变、化学诱变、紫外线诱变、转形(化学或通过电穿孔)、噬菌体转导、定向演化或其任何组合。
[0252]
在一些方面，本文描述的细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)经修饰，使得它们包含、连接至和/或结合治疗性部分。
[0253]
在一些实施例中，治疗性部分是癌症特异性部分。在一些实施例中，癌症特异性部分对癌细胞具有结合特异性(例如对癌症特异性抗原具有结合特异性)。在一些实施例中，癌症特异性部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，癌症特异性部分包含t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。在一些实施例中，癌症特异性部分包含表达于癌细胞表面上受体的配体或其受体结合片段。在一些实施例中，癌症特异性部分是二分(bipartite)融合蛋白，其具有两个部分：结合至和/或连接至细菌的第一部分及可结合至癌细胞(例如通过对癌症特异性抗原具有结合特异性)的第二部分。在一些实施例中，第一部分是全长肽聚糖识别蛋白(诸如pgrp)的片段或全长肽聚糖识别蛋白。在一些实施例中，第一部分对mev具有结合特异性(例如通过对细菌抗原具有结合特异性)。在一些实施例中，第一和/或第二部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一和/或第二部分包含t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。在一些实施例中，第一和/或第二部分包含表达于癌细胞表面上受体的配体或其受体结合片段。在某些实施例中，癌症特异性部分及药剂的共施用(组合施用或分开施用)增加药剂靶向癌细胞。
[0254]
在一些实施例中，本文描述的细菌和/或mev可以是经修饰的，使得它们包含、连接至和/或结合磁性和/或顺磁性部分(例如磁珠)。在一些实施例中，磁性和/或顺磁性部分包含细菌和/或直接连接至细菌。在一些实施例中，磁性和/或顺磁性部分连接至结合至细菌或mev的细菌或mev结合部分的一部分和/或为结合至细菌或mev的细菌或mev结合部分的一部分。在一些实施例中，细菌或mev结合部分是全长肽聚糖识别蛋白(诸如pgrp)的片段或全长肽聚糖识别蛋白。在一些实施例中，细菌或mev结合部分具有对细菌或mev的结合特异性(例如通过对细菌抗原具有结合特异性)。在一些实施例中，细菌或mev结合部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，细菌或mev结合部分包含t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。在一些实施例中，细菌或mev结合部分包含表达于癌细胞表面上受体的配体或其受体结合片段。在某些实施例中，磁性和/或顺磁性部分及细菌或mev的共施用(一起施用或分开施用)可用以增加mev靶向(例如靶向癌症细胞和/或受试者存在癌细胞的一部分)。
[0255]
经加工的微生物胞外囊泡(pmev)的产生
[0256]
在某些方面，本文所述的pmev可以使用本领域已知的任何方法制备。
[0257]
在一些实施例中，在没有pmev纯化步骤的情况下制备pmev。例如，在一些实施例中，本文描述的pmev自其释放的细菌通过使用让细菌pmev保持完整的方法被杀死且将所得的细菌组分(包括pmev)用于本文描述的方法及组合物中。在一些实施例中，细菌通过使用抗生素(例如，使用本文描述的抗生素)被杀死。在一些实施例中，细菌通过使用uv照射被杀
死。
[0258]
在一些实施例中，本文所述的pmev纯化自一种或多种其他细菌组分。从细菌(和任选的其他细菌组分)纯化pmev的方法是本领域已知的。在一些实施例中，pmev通过使用thein,等人.(j.proteome res.[蛋白质组学研究杂志]9(12):6135-6147(2010))或sandrini,等人.(bio-protocol[生物方案]4(21):e1287(2014))中描述的方法从细菌培养物制备，这些文献中的每一个通过援引以其全文特此并入。在一些实施例中，这些细菌经培养至高光密度及然后经离心以使细菌集结成粒(例如，在室温或4℃下10,000-15,000x g 10-15分钟)。在一些实施例中，丢弃上清液，并将细胞沉淀物在-80℃冷冻。在一些实施例中，将细胞沉淀物在冰上解冻，并重悬于补充有1mg/ml dna酶i的100mm tris-hcl(ph 7.5)中。在一些实施例中，在制造商建议的条件下使用emulsiflex c-3(奥维斯丁公司(avestin,inc.))裂解细胞。在一些实施例中，通过在4℃下以10,000x g离心15分钟来沉淀碎片和未裂解的细胞。在一些实施例中，然后将上清液在4℃下以120,000x g离心1小时。在一些实施例中，将沉淀物重悬于冰冷的ph11的100mm碳酸钠中，在4℃下搅拌孵育1小时，然后在4℃下以120,000x g离心1小时。在一些实施例中，将沉淀重悬于ph 7.5的100mm tris-hcl中，在4℃下以120,000x g再离心20分钟，然后重悬于0.1m tris-hcl(ph 7.5)中或于pbs中。在一些实施例中，样品被存储在-20℃。
[0259]
在某些方面，pmev是通过改编自sandrini等人(2014年)的方法获得的。在一些实施例中，细菌培养物在室温或4℃下以10,000-15,500x g离心10-15分钟。在一些实施例中，将细胞沉淀物在-80℃冷冻，并丢弃上清液。在一些实施例中，将细胞沉淀物在冰上解冻，并重悬于10mm tris-hcl(ph 8.0)、补充有0.1mg/ml溶菌酶的1mm edta中。在一些实施例中，将样品在室温或37℃下混合孵育30分钟。在一些实施例中，将样品在-80℃下重新冷冻，然后再次在冰上解冻。在一些实施例中，添加dna酶i至终浓度为1.6mg/ml，并添加mgcl2至终浓度为100mm。在一些实施例中，使用qsonica q500超声仪以30秒开启和30秒关闭的7个循环对样品进行超声处理。在一些实施例中，通过在4℃下以10,000x g离心15分钟来沉淀碎片和未裂解的细胞。在一些实施例中，然后将上清液在4℃下以110,000x g离心15分钟。在一些实施例中，将沉淀重悬于10mm tris-hcl(ph 8.0)、2％ triton x-100中，并在室温下混合孵育30-60min。在一些实施例中，将样品在4℃下以110,000x g离心15分钟。在一些实施例中，将沉淀物重悬于pbs中并储存在-20℃。
[0260]
在某些方面，本文所述的形成(例如，制备)分离的细菌pmev的方法包括以下步骤：(a)离心细菌培养物，从而形成第一沉淀物和第一上清液，其中该第一沉淀物包含细胞；(b)丢弃该第一上清液；(c)将该第一沉淀物重悬于溶液中；(d)裂解细胞；(e)离心裂解的细胞，从而形成第二沉淀物和第二上清液；(f)丢弃该第二沉淀物并离心该第二上清液，从而形成第三沉淀物和第三上清液；(g)丢弃该第三上清液并将该第三沉淀物重悬于第二溶液中，从而形成分离的细菌pmev。
[0261]
在一些实施例中，该方法还包括以下步骤：(h)离心步骤(g)的溶液，从而形成第四沉淀物和第四上清液；(i)丢弃该第四上清液，并将该第四沉淀物重悬于第三溶液中。在一些实施例中，该方法还包括以下步骤：(j)离心步骤(i)的溶液，从而形成第五沉淀物和第五上清液；和(k)丢弃该第五上清液，并将该第五沉淀物重悬于第四溶液中。
[0262]
在一些实施例中，步骤(a)的离心是以10,000x g进行的。在一些实施例中，步骤
(a)的离心进行10-15分钟。在一些实施例中，步骤(a)的离心是在4℃或室温下进行的。在一些实施例中，步骤(b)进一步包括将第一沉淀物在-80℃冷冻。在一些实施例中，步骤(c)中的溶液是补充有1mg/ml dna酶i的100mm tris-hcl(ph 7.5)。在一些实施例中，步骤(c)中的溶液是10mm tris-hcl(ph 8.0)、1mm edta，补充有0.1mg/ml溶菌酶。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括在37℃或室温下孵育30分钟。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括将第一沉淀物在-80℃冷冻。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括将dna酶i添加至1.6mg/ml的终浓度。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括添加mgcl2至100mm的终浓度。在一些实施例中，在步骤(d)中通过匀浆裂解细胞。在一些实施例中，在步骤(d)中通过emulsiflex c3裂解细胞。在一些实施例中，在步骤(d)中通过超声裂解细胞。在一些实施例中，将细胞超声处理7个循环，其中每个循环包括30秒的超声处理和30秒的不超声处理。在一些实施例中，步骤(e)的离心是以10,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(e)的离心进行15分钟。在一些实施例中，步骤(e)的离心是在4℃或室温下进行的。
[0263]
在一些实施例中，步骤(f)的离心是以120,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(f)的离心是以110,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(f)的离心进行1小时。在一些实施例中，步骤(f)的离心进行15分钟。在一些实施例中，步骤(f)的离心是在4℃或室温下进行的。在一些实施例中，步骤(g)中的第二溶液是ph 11的100mm碳酸钠。在一些实施例中，步骤(g)中的第二溶液是10mm tris-hcl ph 8.0、2％triton x-100。在一些实施例中，步骤(g)进一步包括将溶液在4℃下孵育1小时。在一些实施例中，步骤(g)进一步包括将溶液在室温下孵育30-60分钟。在一些实施例中，步骤(h)的离心是以120,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(h)的离心是以110,000xg进行的。在一些实施例中，步骤(h)的离心进行1小时。在一些实施例中，步骤(h)的离心进行15分钟。在一些实施例中，步骤(h)的离心是在4℃或室温下进行的。在一些实施例中，步骤(i)中的第三溶液是100mm tris-hcl(ph 7.5)。在一些实施例中，步骤(i)中的第三溶液是pbs。在一些实施例中，步骤(j)的离心是以120,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(j)的离心进行20分钟。在一些实施例中，步骤(j)的离心是在4℃或室温下进行的。在一些实施例中，步骤(k)中的第四溶液是100mm tris-hcl(ph 7.5)或pbs。
[0264]
通过本文提供的方法获得的pmev可通过基于尺寸的柱色谱法、通过亲和色谱法及通过梯度超离心，使用可包括但不限于使用蔗糖梯度或optiprep梯度的方法加以进一步纯化。简言之，在使用蔗糖梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，将沉淀物重新悬浮于60％蔗糖、30mm ph 8.0tris中。如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用amicon ultra柱将浓缩物缓冲液交换至60％蔗糖、30mm ph 8.0tris中。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。简言之，在使用optiprep梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，则将集结粒重悬于pbs中的35％ optiprep中。在一些实施例中，如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用60％ optiprep将浓缩物稀释至最终浓度为35％ optiprep。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。
[0265]
在一些实施例中，为证实pmev制剂的无菌性及分离，将pmev连续稀释至琼脂培养基(其用于测试中的细菌的例行培养)上，并使用例行条件进行培养。使未经灭菌的制剂通过0.22um过滤器以去除完整细胞。为进一步增加纯度，分离的pmev可用dna酶或蛋白酶k处
理。
[0266]
在一些实施例中，pmev制剂的无菌性可通过将一部分pmev接种至琼脂培养基(其用于用以产生pmev的细菌的标准培养)上及使用标准条件进行培养加以证实。
[0267]
在一些实施例中，通过色谱法及pmev上的结合表面部分来分离所选pmev并富集。在其他实施例中，所选pmev通过荧光细胞分选通过使用亲和试剂、化学染料、重组蛋白的方法或本领域技术人员已知的其他方法分离和/或富集。
[0268]
可以对pmev进行分析，例如，如jeppesen等人cell[细胞]177:428(2019)所述。
[0269]
在一些实施例中，冻干pmev。
[0270]
在一些实施例中，pmev经γ照射(例如，以17.5或25kgy)。
[0271]
在一些实施例中，pmev经uv照射。
[0272]
在一些实施例中，pmev经热灭活(例如，在50℃下两小时或在90℃下两小时)。
[0273]
在一些实施例中，pmev经酸处理。
[0274]
在一些实施例中，pmev经氧喷射(例如，以0.1vvm持续两小时)。
[0275]
生长阶段可影响细菌的数量或性质。例如，在本文提供的pmev制备方法中，可以例如在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时从培养物中分离pmev。
[0276]
分泌型微生物胞外囊泡(smev)的产生
[0277]
在某些方面，本文所述的smev可以使用本领域已知的任何方法制备。
[0278]
在一些实施例中，在没有smev纯化步骤的情况下制备smev。例如，在一些实施例中，本文描述的细菌通过使用让smev保持完整的方法被杀死且将所得的细菌组分(包括smev)用于本文描述的方法及组合物中。在一些实施例中，细菌通过使用抗生素(例如，使用本文描述的抗生素)被杀死。在一些实施例中，细菌通过使用uv照射被杀死。在一些实施例中，细菌被热杀死。
[0279]
在一些实施例中，本文所述的smev纯化自一种或多种其他细菌组分。用于自细菌纯化smev的方法为本领域中已知。在一些实施例中，smev通过使用s.bin park等人.plos one[公共科学图书馆
·
综合].6(3):e17629(2011)或g.norheim,等人.plos one[公共科学图书馆
·
综合].10(9):e0134353(2015)或jeppesen,等人.cell[细胞]177:428(2019)中所述的方法从细菌培养物制备，这些文献中的每一个通过援引以其全文特此并入。在一些实施例中，细菌经培养至高光密度及然后经离心以使细菌集结成粒(例如，在4℃下以10,000x g离心30min，在4℃下以15,500x g离心15min)。在一些实施例中，然后使培养上清液通过过滤器以排除完整细菌细胞(例如，0.22μm过滤器)。在一些实施例中，然后对上清液进行切向流过滤，在此过程中，将上清液浓缩，除去小于100kda的物质，并用pbs对培养基进行部分交换。在一些实施例中，经过滤的上清液经离心以使细菌smev沉淀(例如，在4℃下以100,000至150,000x g离心1至3小时，在4℃下以200,000x g离心1至3小时)。在一些实施例中，smev通过重悬所得smev沉淀物(例如，于pbs中)，并将重悬的smev施用至optiprep(碘克沙醇)梯度或梯度(例如30％至60％不连续的梯度、0-45％不连续的梯度)，接着离心(例如，在4℃下以200,000x g离心4-20小时)加以进一步纯化。可以收集smev带，用pbs稀释并离心以使smev沉淀(例如，在4℃下以150,000x g离心3小时，在4℃下以200,000x g离心1小时)。纯化的smev可经储存(例如，在-80℃或-20℃下)直至使用。在一些实施例中，smev通过用dna酶
和/或蛋白酶k处理加以进一步纯化。
[0280]
例如，在一些实施例中，细菌的培养物可在4℃下以11,000x g离心20-40分钟以使细菌沉淀。可使培养上清液通过0.22μm过滤器以排除完整细菌细胞。然后可使用可包括但不限于硫酸铵沉淀、超离心或过滤的方法浓缩经过滤的上清液。例如，就硫酸铵沉淀而言，可将1.5-3m硫酸铵缓慢添加至经过滤的上清液，同时在4℃下搅拌。可在4℃下将沉淀培养8至48小时及然后在4℃下以11,000x g离心20-40分钟。所得沉淀物含有细菌smev及其他碎片。可使用超离心，经过滤的上清液在4℃下以100,000至200,000x g离心1-16小时。此离心的沉淀物含有细菌smev和其他碎片(例如大蛋白复合物)。在一些实施例中，使用过滤技术，如通过使用amicon超自旋过滤器或通过切向流过滤，上清液可经过滤以便于保留分子量》50或100kda的物质。
[0281]
可替代地，例如通过将生物反应器连接至细胞培养交替切向流(atf)系统(例如来自repligen的xcell atf)，可在生长期间或在生长期间的选定时间点，从细菌培养物连续获得smev。该atf系统保留完整细胞(》0.22um)于生物反应器中，及容许较小组分(例如，smev、游离蛋白质)通过过滤器以供收集。例如，该系统可经结构设计使得《0.22um滤液然后通过100kda的第二过滤器，容许收集如在0.22μm与100kda之间的smev的物质，并将小于100kda的种类泵送回生物反应器中。可替代地，该系统可以经结构设计以容许生物反应器中的培养基在培养物的生长期间得到补充和/或修饰。通过此方法收集的smev可以通过如上文描述用于经过滤的上清液的超离心或过滤进行进一步纯化和/或浓缩。
[0282]
通过本文提供的方法获得的smev可通过基于尺寸的柱色谱法、通过亲和色谱法、通过离子交换色谱法及通过梯度超离心，使用可包括但不限于使用蔗糖梯度或optiprep梯度的方法加以进一步纯化。简言之，在使用蔗糖梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，将沉淀物重新悬浮于60％蔗糖、30mm ph 8.0tris中。如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用amicon ultra柱将浓缩物缓冲液交换至60％蔗糖、30mm ph 8.0tris中。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。简而言之，在使用optiprep梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，则将沉淀物重悬于pbs中并向样品中添加3体积的60％ optiprep。在一些实施例中，如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用60％ optiprep将浓缩物稀释至最终浓度为35％ optiprep。将样品施加至0-45％不连续的optiprep梯度，并在4℃下以200,000xg离心3-24小时，例如，在4℃下离心4-24小时。
[0283]
在一些实施例中，为证实smev制剂的无菌性及分离，将smev连续稀释至琼脂培养基(其用于测试中的细菌的例行培养)上，并使用例行条件进行培养。使未经灭菌的制剂通过0.22um过滤器以去除完整细胞。为进一步增加纯度，分离的smev可用dna酶或蛋白酶k处理。
[0284]
在一些实施例中，为制备用于体内注射的smev，纯化的smev如先前描述进行处理(g.norheim,等人.plos one[公共科学图书馆
·
综合].10(9):e0134353(2015))。简而言之，在蔗糖梯度离心后，将含有smev的带于含有3％蔗糖的溶液中或本领域技术人员已知的适用于体内注射的其他溶液中重新悬浮至50μg/ml的终浓度。此溶液还可含有浓度为0-0.5％(w/v)的佐剂(例如氢氧化铝)。在一些实施例中，为了制备用于体内注射的smev，将pbs中的smev无菌过滤至《0.22um。
[0285]
在某些实施例中，为制备与其他测试(例如用以在tem成像或活体外分析之前去除蔗糖)兼容的样本，使用过滤(例如amicon ultra柱)将样本缓冲液交换至pbs或30mm ph 8.0tris中，透析，或超离心(200,000
×
g，≥3小时，4℃)并再悬浮。
[0286]
在一些实施例中，smev制剂的无菌性可通过将一部分smev接种至琼脂培养基(其用于用以产生smev的细菌的标准培养)上及使用标准条件进行培养加以证实。
[0287]
在一些实施例中，通过色谱法及smev上的结合表面部分来分离所选smev并富集。在其他实施例中，所选smev通过荧光细胞分选通过使用亲和试剂、化学染料、重组蛋白的方法或本领域技术人员已知的其他方法分离和/或富集。
[0288]
可以对smev进行分析，例如，如jeppesen,等人.cell[细胞]177:428(2019)所述。
[0289]
在一些实施例中，smev被冻干。
[0290]
在一些实施例中，smev经γ照射(例如，在17.5kgy或25kgy下)。
[0291]
在一些实施例中，smev经uv照射。
[0292]
在一些实施例中，smev经热灭活(例如，在50℃下两小时或在90℃下两小时)。
[0293]
在一些实施例中，smev经酸处理。
[0294]
在一些实施例中，smev经氧喷射(例如，以0.1vvm持续两小时)。
[0295]
生长阶段可影响细菌和/或细菌产生的smev的数量或性质。例如，在本文提供的smev制备方法中，可以例如在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时从培养物中分离smev。
[0296]
生长环境(如培养条件)可影响细菌产生smev的数量。例如，smev诱导因子可以增加smev的产率，如表3所示。
[0297]
表3：增加smev产率的培养技术
[0298]
[0299][0300]
在本文提供的制备smev的方法中，该方法可任选地包括在从细菌培养物中分离smev之前，将细菌培养物暴露于smev诱导因子。细菌培养物可以在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时暴露于smev诱导因子。
[0301]
固体剂型
[0302]
在某些实施例中，本文提供了包含药剂的固体剂型(例如，具有固体剂型的药物组合物)，该药剂含有细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分。在一些实施例中，药剂可以任选地含有一种或多种另外的组分，例如冷冻保护剂。可以将药剂冻干(例如，产生
粉剂)。药剂可以与固体剂型中的一种或多种赋形剂(例如药学上可接受的赋形剂)组合。
[0303]
在某些方面，本文提供了药物组合物的固体剂型。在某些实施例中，固体剂型包含药剂(例如细菌和/或细菌起源(例如mev)的试剂(例如组分)，包含细菌和/或细菌起源(例如mev)的试剂(例如组分)的粉剂)和一种或多种崩解剂。在某些实施例中，药剂总质量为药物组合物总质量的至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施例中，药剂总质量不超过药物组合物总质量的45％、40％、35％、30％或25％。在一些实施例中，一种或多种崩解剂的总质量为药物组合物总质量的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施例中，一种或多种崩解剂的总质量不超过药物组合物总质量的70％、65％、60％或55％。在一些实施例中，一种或多种崩解剂包含低取代的羟丙基纤维素(l-hpc)、交联羧甲基纤维素钠(ac-di-sol)、和/或交聚维酮(pvpp)。
[0304]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含l-hpc。在一些实施例中，l-hpc是lh-b1级(或包含lh-b1级的l-hpc)。在某些实施例中，l-hpc总质量为药物组合物总质量的至少22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，l-hpc总质量不超过药物组合物总质量的22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，l-hpc总质量为药物组合物总质量的约22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。
[0305]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含ac-do-sol。在一些实施例中，ac-do-sol是sd-711级(或包含ac-di-sol)。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为药物组合物总质量的至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量不超过药物组合物总质量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为药物组合物总质量的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。
[0306]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含pvpp。在某些实施例中，pvpp总质量为药物组合物总质量的至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp总质量不超过药物组合物总质量的5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp总质量为药物组合物总质量的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。
[0307]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的至少5％且不超过的35％，(ii)l-hpc(例如，lh-b1级的l-hpc)，其具有的l-hpc总质量为药物组合物总质量的至少22％(例如，至少22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、或42％)且不超过药物组合物总质量的42％(例如，不超过22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、或42％)；(iii)ac-di-sol(例如，sd-711级的ac-di-sol)，其具有的ac-di-sol总质量为药物
组合物总质量的至少0.01％(例如，至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、或16％)且不超过药物组合物总质量的16％(例如，不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、或16％)；以及(iv)pvpp，其具有的pvpp总质量为药物组合物总质量的至少5％(例如，至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％)且不超过药物组合物总质量的25％(例如，不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％)。在某些实施例中，l-hpc总质量加上ac-di-sol总质量加上pvpp总质量为药物组合物总质量的至少35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，固体剂型包含：l-hpc总质量为药物组合物总质量的约32％；ac-di-sol总质量为药物组合物总质量的约6％；以及pvpp总质量为药物组合物总质量的约15％。
[0308]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型进一步包含甘露醇。在某些实施例中，甘露醇是(或包含)甘露醇sd200。在某些实施例中，甘露醇总质量为药物组合物总质量的至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在某些实施例中，甘露醇总质量不超过药物组合物总质量的10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％。在某些实施例中，甘露醇总质量为药物组合物总质量的约10％、11％、12％、13％、14％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％、27％、27.5％、28％、28.5％、29％、29.5％、30％、30.5％、31％、31.5％、32％、32.5％、33％、33.5％、34％、34.5％、35％、35.5％、36％、36.5％、37％、37.5％、38％、38.5％、39％、39.5％或40％。
[0309]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含硬脂酸镁。在某些实施例中，硬脂酸镁总质量为药物组合物总质量的至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。在某些实施例中，硬脂酸镁总质量不超过药物组合物总质量的0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。在某些实施例中，硬脂酸镁总质量为药物组合物总质量的约0.01％、0.1％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％或11％。
[0310]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含胶态二氧化硅。在某些实施例中，胶态二氧化硅是(或包含)aerosil 200。在某些实施例中，胶态二氧化硅总质量为药物组合物总质量的至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。在某些实施例中，胶态二氧化硅总质量不超过药物组合物总质量的0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。在某些实施例中，胶态二氧化硅总质量为药物组合物总质量的约0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。
[0311]
在某些方面，本文提供了药物组合物的固体剂型。在某些实施例中，固体剂型包含药剂，其中该药剂包含细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分以及稀释剂。在某些实施例中，药剂总质量为药物组合物总质量的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在某些实
施例中，药剂总质量不超过药物组合物总质量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
[0312]
在某些实施例中，稀释剂总质量为药物组合物总质量的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在某些实施例中，稀释剂总质量不超过药物组合物总质量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％。在一些实施例中，稀释剂包含甘露醇。
[0313]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含润滑剂。在某些实施例中，润滑剂总质量为药物组合物总质量的至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量不超过药物组合物总质量的0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂质量为药物组合物总质量的约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为药物组合物总质量的约0.5％至约1.5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为药物组合物总质量的约1％。在某些实施例中，润滑剂包含硬脂酸镁。
[0314]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含助流剂。在一些实施例中，助流剂为胶态二氧化硅。在某些实施例中，助流剂总质量为药物组合物总质量的至少0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量不超过药物组合物总质量的0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂质量为药物组合物总质量的约0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量为药物组合物总质量的约0.25％至约0.75％。在某些实施例中，助流剂总质量为药物组合物总质量的约0.5％。
[0315]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的约20％至约50％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约50％至约80％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。
[0316]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的至少5％且不超过药物组合物总质量的95％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的至少1％且不超过药物组合物总质量的95％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的至少0.1％且不超过药物组合物总质量的5％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量的至少0.01％且不超过药物组合物总质量的2％。
[0317]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的约8％至约92％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约5％至约90％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。
[0318]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的约30％至约50％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组
合物总质量的约45％至约70％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。
[0319]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的约50％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约48.5％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的约13.51％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约84.99％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。
[0320]
在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的约90.22％；(ii)稀释剂(例如，甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约8.28％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。
[0321]
因此，在某些实施例中，本文提供了包含含有细菌的药剂的固体剂型。细菌可以是活细菌(例如，其粉剂或生物质)；非活(经杀灭)细菌(例如，其粉剂或生物质)；非复制型细菌(例如，其粉剂或生物质)；经γ照射的细菌(例如，其粉剂或其生物质)；和/或冻干细菌(例如，其粉剂或生物质)。
[0322]
在某些实施例中，本文提供了包含含有mev的药剂的固体剂型。mev可来自培养基(例如，培养上清液)。mev可来自活细菌(例如，其粉剂或生物质)；mev可来自非活(经杀灭)细菌(例如，其粉剂或生物质)；mev可来自非复制型细菌(例如其粉剂或生物质)；mev可来自经γ照射的细菌(例如，其粉剂或生物质)；和/或mev可来自冻干细菌(例如，其粉剂或生物质)。
[0323]
在一些实施例中，药剂包含基本上或完全不含细菌(例如，整个细菌)、细菌(例如，活细菌、死(例如，被杀死的)细菌、非复制型细菌、减毒细菌)的mev。在一些实施例中，药物组合物包含mev及细菌(例如，完整细菌)(例如，活细菌、被杀死的细菌、减毒细菌)两者。在一些实施例中，药剂包含来自一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)血红蛋白依赖性细菌菌株的细菌和/或mev。在一些实施例中，药剂包含来自本文所述的细菌菌株或物种之一的细菌和/或mev，例如，来自以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、anaerobutyricum属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、氯酸杆菌属、梭菌属、柯林斯菌属、丙酸杆菌属、eisenbergiella属、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、福涅拉氏菌属、梭杆菌属、巨型球菌属、副拟杆菌属、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、rarimicrobium属、沙特尔沃思氏菌属、苏黎世杆菌属、或韦荣氏球菌属。
[0324]
在一些实施例中，药剂包含冻干的细菌和/或mev。在一些实施例中，药剂包含经γ照射的细菌和/或mev。mev(如smev和/或pmev)可以在mev被分离(如制备)之后进行γ照射。
[0325]
在一些实施例中，为定量样品中存在的mev(例如smev和/或pmev)和/或细菌的数量，可使用电子显微术(例如，超薄冷冻切片的em)以观测mev(例如smev和/或pmev)和/或细
菌并计数它们的相对数量。可替代地，可使用纳米颗粒跟踪分析(nta)、库尔特计数或动态光散射(dls)或这些技术的组合。nta及库尔特计数器计数颗粒并显示它们的尺寸。dls给出颗粒的粒度分布，而非浓度。细菌通常具有1-2um(微米)的直径。完整范围是0.2-20um。来自库尔特计数及nta的组合结果可揭示给定样品中的细菌和/或mev(如smev和/或pmev)数量。库尔特计数揭示具有0.7-10um的直径的颗粒的数量。对于大多数细菌和/或mev(如smev和/或pmev)样品，仅库尔特计数器就可以显示样品中细菌和/或mev(如smev和/或pmev)的数量。pmev的直径是20-600nm。对于nta，可以从马尔文泛分析公司(malvern pananlytical)获得nanosight仪器。例如，ns300可以在10-2000nm范围内可视化和测量悬浮液中的颗粒。nta允许对例如直径为50-1000nm的颗粒的数量进行计数。dls揭示具有于1nm-3um的近似范围内的不同直径的颗粒的分布。
[0326]
mev可以通过本领域已知的分析方法(例如jeppesen,等人.cell[细胞]177:428(2019))来表征。
[0327]
在一些实施例中，可以基于颗粒计数来定量细菌和/或mev。例如，可以使用nta测量细菌和/或mev制剂的总蛋白含量。
[0328]
在一些实施例中，可以基于蛋白质、脂质或碳水化合物的量来定量细菌和/或mev。例如，可以使用布拉德福德测定或bca来测量细菌和/或制剂的总蛋白含量。
[0329]
在一些实施例中，mev与源细菌或细菌培养物的一种或多种其他细菌组分分离。在一些实施例中，细菌与源细菌培养物的一种或多种其他细菌组分分离。在一些实施例中，药剂进一步包含其他细菌组分。
[0330]
在某些实施例中，从源细菌获得的mev制剂可基于亚群的物理特性(例如，大小、密度、蛋白含量、结合亲和力)被分级成亚群。然后可以将mev亚群中的一个或多个并入到本发明的药剂中。
[0331]
在某些方面，本文提供了包含用于治疗和/或预防疾病(例如癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢性疾病、或菌群失调)的药剂(包含细菌和/或mev)(例如smev和/或pmev)的药物组合物和/或固体剂型，以及制造和/或鉴定此类细菌和/或mev的方法，和使用药剂及其药物组合物和/或固体剂型的方法(例如，单独或与其他治疗剂组合用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、或代谢性疾病)。在一些实施例中，药剂包含mev(如smev和/或pmev)及细菌(例如，整个细菌)(例如，活细菌、死(例如，被杀死的)细菌、非复制型细菌、减毒细菌)。在一些实施例中，药剂包含在不存在mev(例如smev和/或pmev)的情况下的细菌。在一些实施例中，药剂包含在不存在细菌的情况下的mev(例如smev和/或pmev)。在一些实施例中，药剂包含mev(例如smev和/或pmev)和/或来自血红蛋白依赖性细菌的细菌。在一些实施例中，药剂包含来自本文所述的细菌菌株或物种之一的细菌和/或mev，例如，来自以下属的细菌：放线菌属、另枝菌属、anaerobutyricum属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、氯酸杆菌属、梭菌属、柯林斯菌属、丙酸杆菌属、eisenbergiella属、韦荣球菌科、真杆菌属/艰难杆菌属、粪杆菌属、福涅拉氏菌属、梭杆菌属、巨型球菌属、副拟杆菌属、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸菌属、rarimicrobium属、沙特尔沃思氏菌属、苏黎世杆菌属、或韦荣氏球菌属。
[0332]
在某些方面，本文提供了用于向受试者(例如，人受试者)施用的药剂、和/或药物组合物和/或其固体剂型。在一些实施例中，药剂与另外的活性和/或非活性材料组合以产
生最终产品，其可呈单剂量单位或呈多剂量形式。在一些实施例中，药剂与佐剂如免疫佐剂(例如sting激动剂、tlr激动剂或nod激动剂)组合。
[0333]
在一些实施例中，药物组合物和/或固体剂型包含至少一种碳水化合物。
[0334]
在一些实施例中，药物组合物和/或固体剂型包含至少一种脂质。在一些实施例中，脂质包含至少一种选自以下的脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、珍珠酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(epa)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(dha)及二十四烷酸(24:0)。
[0335]
在一些实施例中，药物组合物和/或固体剂型包含至少一种矿物质或矿物质源。矿物质的实例包括但不限于：氯化物、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾及硒。任一前述矿物质的合适形式包含可溶性矿物质盐、微溶性矿物质盐、不溶性矿物质盐、螯合矿物质、矿物质复合物、非反应性矿物质(例如羰基矿物质及经还原矿物质)及其组合。
[0336]
在一些实施例中，药物组合物和/或固体剂型包含至少一种维生素。至少一种维生素可为脂肪可溶性或水可溶性维生素。合适维生素包括但不限于维生素c、维生素a、维生素e、维生素b12、维生素k、核黄素、烟酸(niacin)、维生素d、维生素b6、叶酸、吡哆醇(pyridoxine)、硫胺素、泛酸及生物素。任一前述物质的合适形式是维生素盐、维生素衍生物、与维生素具有相同或类似活性的化合物及维生素代谢物。
[0337]
在一些实施例中，药物组合物和/或固体剂型包含赋形剂。合适赋形剂的非限制性实例包含缓冲剂、防腐剂、稳定剂、黏合剂、压实剂、润滑剂、助流剂、稀释剂、分散增强剂、崩解剂、矫味剂、甜味剂及着色剂。
[0338]
可以包含在固体剂型中的合适赋形剂可以是本领域已知的一种或多种药学上可接受的赋形剂。例如，参见rowe,sheskey,和quinn编辑,handbook of pharmaceutical excipients[药物赋形剂手册],第六版2009；pharmaceutical press and american pharmacists association[制药出版社和美国药剂师协会]。
[0339]
在一些实施例中，药剂可制备为粉剂(例如，用于再悬浮)。
[0340]
在一些实施例中，药物组合物可制备为粉剂(例如，用于再悬浮)。
[0341]
片剂和微片剂
[0342]
本文所述的固体剂型可以是，例如片剂或微型片剂。此外，多个微型片剂可以处于(例如，装入)胶囊中。
[0343]
在一些实施例中，固体剂型包含片剂(》4mm)(例如5mm-17mm)。例如，片剂是5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm或18mm片剂。如本领域中已知的，尺寸是指片剂的直径。如本文所用，片剂的尺寸是指在应用肠溶包衣之前的片剂的尺寸。
[0344]
在一些实施例中，固体剂型包含微型片剂。微型片剂的尺寸范围可以为1mm-4mm。例如，微型片剂可以是1mm微型片剂、1.5mm微型片剂、2mm微型片剂、3mm微型片剂或4mm微型片剂。如本领域中已知的，尺寸是指微型片剂的直径。如本文所用，微型片剂的尺寸是指在应用肠溶包衣之前的微型片剂的尺寸。
[0345]
微型片剂可以是在胶囊中。胶囊可以是00号、0号、1号、2号、3号、4号或5号胶囊。含有微型片剂的胶囊可以包含hpmc(羟丙基甲基纤维素)或明胶。微型片剂可以放在胶囊内：胶囊内的微型片剂的数量将取决于胶囊的尺寸和微型片剂的尺寸。例如，0号胶囊可容纳31-35(平均33)个3mm的微型片剂。
[0346]
在一些实施例中，固体剂型(例如，片剂或微片剂)被肠溶包衣(例如，包含肠溶包衣；例如，被肠溶包衣包被)。
[0347]
胶囊
[0348]
本文所述的固体剂型可以是胶囊。
[0349]
固体剂型可以包括胶囊。在一些实施例中，胶囊是00号、0号、1号、2号、3号、4号或5号胶囊。在一些实施例中，胶囊包含hpmc(羟丙基甲基纤维素)或明胶。在一些实施例中，胶囊包含hpmc(羟丙基甲基纤维素)。在一些实施例中，胶囊是封口的。
[0350]
在一些实施例中，固体剂型(例如，胶囊)被肠溶包衣(例如，包含肠溶包衣；例如，被肠溶包衣包被)。
[0351]
示例性包衣
[0352]
本文描述的固体剂型(例如片剂或微型片剂或胶囊)可以用例如一层肠溶包衣或两层肠溶包衣(例如，内部肠溶包衣和外部肠溶包衣)进行肠溶包衣。内部肠溶包衣和外部肠溶包衣不相同(例如，内部肠溶包衣和外部肠溶包衣不包含相同量的相同组分)。肠溶包衣可允许药剂在例如小肠中(例如上小肠上部，例如十二指肠和/或空肠)释放。
[0353]
药剂在小肠例中(例如小肠上部，例如十二指肠或空肠中)的释放可允许药剂靶向并影响在这些特定的位置处定位的细胞(例如上皮细胞和/或免疫细胞)，例如，这可以在小肠中引起局部作用和/或引起系统性作用(例如，胃肠道外的作用)。
[0354]
尤特奇是各种各样聚甲基丙烯酸酯基共聚物的品牌名称。它包括基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸/丙烯酸酯或其衍生物的阴离子、阳离子和中性共聚物。
[0355]
可用于肠溶包衣(例如，一层肠溶包衣或内部肠溶包衣和/或外部肠溶包衣)的其他材料的实例包括邻苯二甲酸乙酸纤维素(cap)、偏苯三酸乙酸纤维素(cat)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(pvap)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hpmcp)、脂肪酸、蜡、虫胶(紫胶桐酸的酯)、塑料、植物纤维、玉米醇溶蛋白、(不含醇的水性玉米醇溶蛋白配制品)、直链淀粉、淀粉衍生物、糊精、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基醋酸琥珀酸纤维素(醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、和/或海藻酸钠。
[0356]
肠溶包衣(例如，一层肠溶包衣或内部肠溶包衣和/或外部肠溶包衣)可以包括甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(mae)共聚物(1:1)。
[0357]
一层肠溶包衣可以包含甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(mae)共聚物(1:1)(例如kollicoat mae 100p)。
[0358]
一层肠溶包衣包括尤特奇共聚物，例如，尤特奇l(例如，尤特奇l 100-55；尤特奇l 30d-55)、尤特奇s、尤特奇rl、尤特奇rs、尤特奇e、或尤特奇fs(例如，尤特奇fs 30d)。
[0359]
可以在肠溶包衣中使用的材料的其他实例(例如，一层肠溶包衣或内部肠溶包衣和/或外部肠溶包衣)包括在如下中描述的那些，例如u.s.6312728；u.s.6623759；u.s.4775536；u.s.5047258；u.s.5292522；u.s.6555124；u.s.6638534；u.s.2006/0210631；
u.s.2008/200482；u.s.2005/0271778；u.s.2004/0028737；wo 2005/044240。
[0360]
也参加，例如，u.s.9233074，其提供了可与本文提供的固体剂型一起使用的ph依赖性肠溶聚合物，包括甲基丙烯酸共聚物、乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸乙酸纤维素；合适的甲基丙烯酸共聚物包括：聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1:1固体，例如以尤特奇l100商品名出售；聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1:1固体，例如以尤特奇l100-55商品名出售；部分中和的聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1:1固体，例如以kollicoat mae-100p商品名出售；以及聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1:2固体，例如以尤特奇s100商品名出售。
[0361]
在某些方面，本文描述的固体剂型(例如片剂或微型片剂或胶囊)进一步包含底衣。在一些实施例中，固体剂型例如除了肠溶包衣之外还包含底衣，例如，底衣在肠溶包衣下面(例如，在固体剂型和肠溶包衣之间)。在一些实施例中，底衣包含欧巴代qx，例如欧巴代qx蓝。
[0362]
示例性剂量
[0363]
药剂(例如，在药物组合物和/或固体剂型中)的剂量(例如，对于人受试者)是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中使用的全部微型片剂的剂量。
[0364]
在通过总细胞计数确定剂量的实施例中，可以通过coulter计数器确定的总细胞计数。
[0365]
在其中药剂包含细菌的一些实施例中，剂量为每胶囊或片剂或胶囊中使用的全部微型片剂中约1x 107至约1x 10
13
个细胞(例如，其中通过coulter计数器确定的总细胞计数来确定细胞数)。
[0366]
在其中该药剂包含细菌的一些实施例中，剂量为每胶囊或片剂或胶囊中使用的全部微型片剂中约3x 10
10
至约1.5x 10
11
个细胞(例如，其中通过coulter计数器确定的总细胞计数来确定细胞数)。在其中药剂包含细菌一些实施例中，剂量为每胶囊或片剂或胶囊中使用的全部微型片剂中约8x 10
10
或约1.6x 10
11
个细胞或约3.2x 10
11
个细胞(例如，其中通过coulter计数器确定的总细胞计数来确定细胞数)。
[0367]
在其中药剂包含mev的一些实施例中，mev的剂量为约1x 105至约2x 10
12
个颗粒(例如，其中通过nta(纳米颗粒跟踪分析)确定颗粒计数)，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中使用的全部微型片剂的剂量。
[0368]
在其中药剂包含mev的一些实施例中，mev的剂量为约2x106至约2x10
16
个颗粒(例如，其中通过nta(纳米颗粒跟踪分析)确定颗粒计数)，其中该剂量是每胶囊或片剂的剂量或是胶囊中使用的全部微型片剂的剂量。
[0369]
在一些实施例中，药剂剂量可以是按药剂(例如，包含细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)的粉剂)的重量确定的毫克(mg)剂量。药剂的剂量是每胶囊或片剂的剂量或是例如胶囊中全部微型片剂的剂量。
[0370]
例如，为了施用约400mg的1x剂量的药剂，每个胶囊存在约200mg的药剂并且施用两个胶囊，从而产生约400mg的剂量。这两个胶囊可以例如每天1次或2次施用。
[0371]
例如，对于微型片剂：每个微型片剂可以包含约0.1至约3.5mg(0.1、0.35、1.0、3.5mg)的药剂。微型片剂可以放在胶囊内：胶囊内的微型片剂的数量将取决于胶囊的尺寸和微型片剂的尺寸。例如，平均33(范围为31-35)个3mm微型片剂装于0号胶囊内。作为实例，
每微型片剂0.1-3.5mg药剂，剂量范围为每胶囊3.3mg-115.5mg(0号胶囊中33个微型片剂)(3.1mg-108.5mg，0号胶囊中31个微型片剂)(3.5mg-122.5mg，0号胶囊中35个微型片剂)。可以施用多个胶囊和/或更大的胶囊以增加施用的剂量和/或可以每天施用一次或多次以增加施用的剂量。
[0372]
在一些实施例中，药剂的每胶囊或片剂的剂量或例如胶囊中全部微型片剂的剂量可以是约3mg至约125mg。
[0373]
在一些实施例中，药剂的剂量可以是约35mg至约1200mg(例如，约35mg、约125mg、约350mg或约1200mg)。
[0374]
在一些实施例中，药剂的剂量可以是约30mg至约3500mg(约25、约50、约75、约100、约150、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约750、约1000、约1250、约1300、约2000、约2500、约3000或约3500mg)。
[0375]
可以基于对模型生物(例如，小鼠)施用的剂量的异速比例(allometric scaling)来适当地计算人剂量。
[0376]
在一些实施例中，一个或两个片剂胶囊可以一天施用一次或两次。
[0377]
药剂包含细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)，或包含含有细菌和/或细菌来源的试剂(例如mev)的粉剂，并且还可以包含一种或多种另外组分，例如冷冻保护剂等。
[0378]
在一些实施例中，药剂的mg(按重量计)剂量为例如每胶囊或每片剂或是例如胶囊中使用的全部微型片剂约1mg至约500mg。
[0379]
使用药物组合物和/或固体剂型的示例性方法
[0380]
例如，本文所述的药物组合物和/或固体剂型允许口服施用其中包含的药剂。
[0381]
具有披露的崩解剂的组合和/或量的固体剂型提供了崩解时间的减少(例如2倍、4倍、6倍、8倍)，这可以进一步导致与不具有所披露的崩解剂组合的相同固体剂型相比具有增加的治疗功效和/或生理效果。
[0382]
本文所述的药物组合物和/或固体剂型可用于治疗和/或预防癌症、炎症、自身免疫、代谢病症或菌群失调。
[0383]
本文所述的固体剂型可用于治疗和/或预防细菌性败血症性休克、细胞因子风暴和/或病毒感染(例如冠状病毒感染、流感感染和/或呼吸道合胞病毒感染)。
[0384]
本文所述的固体剂型可用于降低炎性细胞因子表达(例如降低il-8、il-6、il-1β和/或tnfα表达水平)。
[0385]
本文描述了使用包含药剂(例如其治疗有效量)的药物组合物和/或固体剂型(例如用于口服施用)(例如用于制药用途)的方法，其中该药剂包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)和螺旋藻组分，并且其中该固体剂型进一步包含披露的崩解剂。
[0386]
例如，本文所述的方法和施用的药物组合物和/或固体剂型允许口服施用其中包含的药剂。药物组合物和/或固体剂型可施用给处于进食或禁食状态的受试者。药物组合物和/或固体剂型可以例如空腹(例如，进食前一小时或进食后两小时)施用。药物组合物和/或固体剂型可在进食前一小时施用。药物组合物和/或固体剂型可在进食后两小时施用。
[0387]
本文提供了用于治疗和/或预防癌症、炎症、自身免疫、代谢病症或菌群失调的药物组合物和/或固体剂型。
[0388]
本文提供了药物组合物和/或固体剂型在制备用于治疗和/或预防癌症、炎症、自
身免疫、代谢病症或菌群失调的药物中的用途。
[0389]
本文提供了固体剂型在制备用于治疗和/或预防细菌性败血症性休克、细胞因子风暴和/或病毒感染(例如冠状病毒感染、流感感染和/或呼吸道合胞病毒感染)的药物中的用途。
[0390]
本文提供了固体剂型在制备用于降低炎性细胞因子表达(例如降低il-8、il-6、il-1β和/或tnfα表达水平)的药物的用途。
[0391]
制造固体剂型的方法
[0392]
在某些方面，本文提供了制备药物组合物的固体剂型的方法，该方法包括(a)将以下组合成药物组合物：(i)药剂(例如，包含本文披露的细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分或粉剂(包含细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)并且包含至少一种螺旋藻组分))，和(ii)至少一种稀释剂、至少一种润滑剂、至少一种助流剂和/或至少一种(例如，一种、两张或三种)崩解剂。在一些实施例中，该至少一种稀释剂包含甘露醇。在一些实施例中，该至少一种润滑剂包含硬脂酸镁。在一些实施例中，该至少一种助流剂包含胶态二氧化硅。在一些实施例中，该至少一种崩解剂包含低取代的羟丙基纤维素(l-hpc)、交联羧甲基纤维素钠(ac-di-sol)、和/或交聚维酮(pvpp)。
[0393]
在某些实施例中，药剂总质量为药物组合物总质量的至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施例中，药剂总质量不超过药物组合物总质量的45％、40％、35％、30％或25％。在一些实施例中，一种或多种崩解剂的总质量为药物组合物总质量的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施例中，一种或多种崩解剂的总质量不超过药物组合物总质量的70％、65％、60％或55％。
[0394]
在一些实施例中，一种或多种崩解剂包含低取代的羟丙基纤维素(l-hpc)、交联羧甲基纤维素钠(ac-di-sol)、和/或交聚维酮(pvpp)。在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含l-hpc。在一些实施例中，l-hpc是lh-b1级。在某些实施例中，l-hpc总质量为药物组合物总质量的至少22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，l-hpc总质量不超过药物组合物总质量的22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，l-hpc总质量为药物组合物总质量的约22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％或42％。在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含ac-do-sol。在一些实施例中，ac-di-sol是sd-711级。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为药物组合物总质量的至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量不超过药物组合物总质量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，ac-di-sol总质量为药物组合物总质量的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％。在某些实施例中，本文提供的固体剂型包含pvpp。在某些实施例中，pvpp总质量为药物组合物总质量的至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp总质量不超过药物组合物总质量的5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、
20％、21％、22％、23％、24％或25％。在某些实施例中，pvpp总质量为药物组合物总质量的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。
[0395]
在某些实施例中，该方法进一步包括压制药物组合物，从而形成片剂或微型片剂。在一些实施例中，该方法进一步包括对片剂或微型片剂进行肠溶包衣，从而制备经肠溶包衣的片剂。在某些实施例中，该方法进一步包括将微型片剂装载到胶囊中。
[0396]
制备药物组合物的固体剂型的方法可以包括胶囊的混合、包封、封口和包衣。
[0397]
在某些方面，本文提供了制备药物组合物的固体剂型的方法，该方法包括将药剂(例如包含本文披露的细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分或粉剂(包含本文披露的细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分))和本文所述的一种或多种另外的组分组合(例如混合)成药物组合物。在某些方面，本文提供了制备药物组合物的固体剂型的方法，该方法包括将药剂(例如包含本文披露的细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分或粉剂(包含本文披露的细菌和/或mev(例如smev和/或pmev)和螺旋藻组分))和稀释剂组合成药物组合物。在某些实施例中，药剂总质量为药物组合物总质量的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％。在一些实施例中，药剂总质量不超过药物组合物总质量的55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％。
[0398]
在一些实施例中，稀释剂总质量为药物组合物总质量的至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施例中，稀释剂总质量不超过药物组合物总质量的至少80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％或45％。在一些实施例中，稀释剂包含甘露醇。
[0399]
在某些实施例中，该方法进一步包括组合润滑剂。在某些实施例中，润滑剂总质量为药物组合物总质量的至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量不超过药物组合物总质量的0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂质量为药物组合物总质量的约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为药物组合物总质量的约0.5％至约1.5％。在某些实施例中，润滑剂总质量为药物组合物总质量的约1％。在某些实施例中，润滑剂包含硬脂酸镁。
[0400]
在某些实施例中，该方法进一步包括组合助流剂。在一些实施例中，助流剂为胶态二氧化硅。在某些实施例中，助流剂总质量为药物组合物总质量的至少0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量不超过药物组合物总质量的0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂质量为药物组合物总质量的约0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％。在某些实施例中，助流剂总质量为药物组合物总质量的约0.25％至约0.75％。在某些实施例中，助流剂总质量为药物组合物总质量的约0.5％。
[0401]
在某些实施例中，该方法还包括将以下组合：(i)药剂，其具有的药剂总质量为药物组合物总质量的至少20％且不超过药物组合物总质量的55％，(ii)稀释剂(例如甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的至少45％且不超过药物组合物总质量的80％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的至少0.1％且不超过药物组合物总质量的5％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量的至少0.01％且不超过药物组合物总质量的2％。
[0402]
在某些实施例中，该方法还包括将以下组合：(i)药剂，其具有药剂总质量为药物组合物总质量的约20％至约50％，(ii)稀释剂(例如甘露醇)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约50％至80％；(iii)润滑剂(例如，硬脂酸镁)，其具有的总质量为药物组合物总质量的约1％；和(iv)助流剂(例如，胶态二氧化硅)，其具有的总质量为药物组合物总质量约0.5％。
[0403]
在一些实施例中，该方法进一步包括将药物组合物装载到胶囊中(例如，包封)。
[0404]
在一些实施例中，该方法进一步包括在装载之后对胶囊进行封口。
[0405]
在一些实施例中，该方法进一步包括对胶囊进行肠溶包衣。
[0406]
固体剂型的另外方面
[0407]
例如，如本文描述的包含药剂(例如，其治疗有效量)的固体剂型(其中药剂包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)并且包含至少一种螺旋藻的组分(例如，螺旋藻组分)，并且其中固体剂型进一步包含所描述的崩解剂)可以向受试者(例如人)提供治疗有效量的药剂。
[0408]
例如，如本文描述的包含药剂(例如，其治疗有效量)的固体剂型(其中药剂包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)并且包含至少一种螺旋藻的组分，并且其中固体剂型进一步包含所描述的崩解剂)可以向受试者(例如人)提供非天然量的治疗有效组分(例如，存在于药剂中)。
[0409]
例如，如本文描述的包含药剂(例如，其治疗有效量)的固体剂型(其中药剂包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)并且包含至少一种螺旋藻的组分，并且其中固体剂型还包含所描述的崩解剂)可以向受试者(例如人)提供非天然数量的治疗有效组分(例如，存在于药剂中)。
[0410]
例如，如本文描述的包含药剂(例如，其治疗有效量)的固体剂型(其中药剂包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)并且包含至少一种螺旋藻的组分，并且其中固体剂型还包含所描述的崩解剂)可以给受试者(例如人)带来一个或多个变化，例如治疗或预防疾病或健康失调。
[0411]
例如，如本文描述的包含药剂(例如，其治疗有效量)的固体剂型(其中药剂包含细菌和/或微生物胞外囊泡(mev)并且包含至少一种螺旋藻的组分，并且其中固体剂型还包含所描述的崩解剂)具有潜在的重大效用，例如影响受试者(例如人)，例如治疗或预防疾病或健康失调。
[0412]
施用
[0413]
在某些方面中，本文提供向受试者递送本文所述的药物组合物和/或固体剂型的方法。
[0414]
剂量方案可为各种方法及量中的任一者，且可通过本领域技术人员根据已知临床因素来确定。如医学技术中已知，任一患者的剂量可取决于许多因素，包含受试者物种、大小、体表面积、年龄、性别、免疫活性及总体健康状况、有待施用的特定微生物、持续时间及施用途径、疾病种类及阶段(例如肿瘤大小)及其他化合物(例如同时或近乎同时施用的药物)。除上述因素外，这些水平可受微生物感染性及微生物性质影响，如可由本领域技术人员所测定。在本发明的方法中，微生物的适当最小剂量程度可为足够使微生物存活、生长及复制的程度。可根据剂型、施用途径、靶疾病的程度或阶段等来适当地设定或调节本文描述
的药剂(例如，呈固体剂型和/或药物组合物)的剂量。
[0415]
在一些实施例中，向受试者施用的剂量足以预防疾病(例如，自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢性疾病或癌症)、延迟其发作或减缓或停止其进展，或减轻疾病的一个或多个症状。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包含所采用特定试剂(例如药剂)的强度以及受试者的年龄、物种、病症及体重。还根据以下因素来确定剂量大小：施用途径、时机及频率以及可伴随施用特定药剂的任何不良副作用的存在、性质及程度及期望的生理学效果。
[0416]
根据上文，在治疗应用中，与影响所选剂量的其他因素相比，用于本发明的药剂的剂量尤其取决于以下因素有所变化：活性剂、年龄、体重及接受患者的临床状况及施用疗法的临床医师或从业人员的经历及判断。例如，对于癌症治疗，剂量应足以导致减缓肿瘤的生长，优选地使肿瘤的生长消退，并且最优选地导致癌症的完全消退，或者转移的大小或数目的减小。作为另一个实例，剂量应足以导致减缓受试者正在治疗的疾病的进展，优选地改善受试者正在治疗的疾病的一个或多个症状。
[0417]
分开施用可包括任何数量的两次或更多次施用，包括二、三、四、五或六次施用。本领域技术人员可容易地根据本领域中已知的用于监测治疗方法的方法及本文提供的其他监测方法确定进行施用的次数或进行一或多次另外的施用的期望。因此，本文提供的方法包括向受试者提供固体剂型的一或多次施用的方法，其中施用次数可通过监测受试者确定，且基于监测的结果，判定是否需提供一或多次另外施用。可基于各种监测结果决定是否需提供一或多次另外施用。
[0418]
施用间的时间段可为各个时间段中的任一者。施用间的时间段可随各种因素中的任一者而变化，包括监测步骤(如关于施用数量所描述)、受试者建立免疫应答的时间段。在一个实例中，时间段可随受试者建立免疫应答的时间段而变化；例如，时间段可大于受试者建立免疫应答的时间段，例如大于约一周、大于约十天、大于约两周或大于约一个月；在另一个实例中，时间段可不大于受试者建立免疫应答的时间段，例如不大于约一周、不大于约十天、不大于约两周或不大于约一个月。
[0419]
免疫障碍
[0420]
在一些实施例中，本文所述的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及治疗或预防与病理学免疫应答相关的疾病或障碍(如自身免疫性疾病、过敏反应和/或炎性疾病)。在一些实施例中，疾病或障碍是炎性肠病(例如，克罗恩病或溃疡性结肠炎)。在一些实施例中，疾病或障碍是银屑病。在一些实施例中，疾病或障碍是银屑病关节炎。在一些实施例中，疾病或障碍是特应性皮炎。在一些实施例中，疾病或障碍是哮喘。
[0421]
本文所述的方法和药物组合物和/或固体剂型可用以治疗有需要的任何受试者。如本文中所使用，“有需要的受试者”包括患有与病理学免疫应答相关的疾病或障碍(例如，炎性肠病)的任何受试者，及具有增加获得此疾病或障碍的可能性的任何受试者。
[0422]
本文所述的药物组合物和/或固体剂型可例如用作预防或治疗(部分或完全减少以下疾病的不利影响)自身免疫性疾病，如慢性炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、穆-韦二氏综合征、类风湿性关节炎、多发性硬化或桥本病(hashimoto's disease)；过敏性疾病，如食物过敏、花粉热或哮喘；传染性疾病，如艰难梭菌感染；炎性疾病，如tnf介导的炎性疾病(例如，胃肠道炎性疾病，如结肠袋炎(pouchitis)；心血管炎性病症，如动脉粥样硬化；或
syndrome)、多发性硬化、重症肌无力、眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、天疱疮、结节性多动脉炎、多肌痛、类风湿性关节炎、莱特尔氏综合征(reiter's syndrome)、休格伦氏综合征(sjogren's syndrome)、颞动脉炎、韦格纳肉芽肿病(wegener's granulomatosis)、温热自身免疫性溶血性贫血、间质性膀胱炎、莱姆病(lyme disease)、局限性硬皮病、银屑病、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎及白癜风。
[0430]
本文描述的方法和药物组合物和/或固体剂型可用以治疗具有炎性组分的t细胞介导的超敏性疾病。此类病症包括但不限于接触性超敏反应、接触性皮炎(包括由于毒葛引起的接触性皮炎)、荨麻疹、皮肤过敏、呼吸道过敏(花粉热、过敏性鼻炎、屋尘螨过敏)及麸胶敏感性肠病(乳糜泻)。
[0431]
可用本发明的方法及固体剂型治疗的其他免疫障碍包括例如阑尾炎、皮炎、皮肌炎、心内膜炎、纤维组织炎、齿龈炎、舌炎、肝炎、化脓性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、肾炎、耳炎、胰脏炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎(peritonoitis)、咽炎、胸膜炎、局限性肺炎、前列腺增生症(prostatistis)、肾盂肾炎及口炎(stomatisi)、移植排斥(涉及如肾、肝、心脏、肺、胰脏(例如，胰岛细胞)、骨髓、角膜、小肠的器官，同种异体皮肤移植、皮肤同种移植物及心脏瓣膜异种移植、血清病及移植物抗宿主病)、急性胰脏炎、慢性胰脏炎、急性呼吸窘迫综合征、西扎利氏综合征(sexary's syndrome)、先天性肾上腺增生、非化脓性甲状腺炎、高钙血症相关癌症、天疱疮、大疱性疱疹样皮炎、重度多形红斑、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、季节性或常年性过敏性鼻炎、支气管哮喘、接触性皮炎、特应性皮炎、药物超敏反应、过敏性结膜炎、角膜炎、眼带状疱疹、虹膜炎及虹膜睫状体炎、脉络膜视网膜炎、视神经炎、结节病性结节病、暴发性或散播性肺结核化学疗法、成人特发性血小板减少性紫癜、成人继发性血小板减少症、获得性(自身免疫性)溶血性贫血症、成人白血病及淋巴瘤、儿童急性白血病、局限性肠炎、自身免疫性血管炎、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病、实体器官移植排斥反应、败血症。优选治疗包括以下的治疗：移植排斥、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、哮喘、炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、慢性阻塞性肺疾病及伴随感染病症的炎症(例如，败血症)。
[0432]
代谢障碍
[0433]
在一些实施例中，本文描述的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及治疗或预防代谢性疾病或障碍，例如ii型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、高胆固醇血症、高血压、高脂蛋白血症、高脂血症、高甘油三酯血症、酮酸中毒、低血糖、血栓性疾病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)或相关疾病。在一些实施例中，相关疾病是心血管疾病、动脉粥样硬化、肾脏疾病、肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病变、性功能障碍、皮肤病、消化不良或水肿。在一些实施例中，本文所述的方法和药物组合物涉及非酒精性脂肪性肝病(nafld)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)的治疗。
[0434]
本文所述的方法和药物组合物和/或固体剂型可用以治疗有需要的任何受试者。如本文所使用的，“有需要的受试者”包括具有代谢疾病或障碍的任何受试者，以及具有获得这种疾病或障碍的增加的可能性的任何受试者。
[0435]
本文所述的药物组合物和/或固体剂型可用于例如预防或治疗代谢性疾病(部分或完全地减少代谢性疾病的不利影响)，该代谢性疾病是例如ii型糖尿病、糖耐量受损、胰
岛素抵抗、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、高胆固醇血症、高血压、高脂蛋白血症、高脂血症、高甘油三酯血症、酮酸中毒、低血糖、血栓性疾病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)或相关疾病。在一些实施例中，相关疾病是心血管疾病、动脉粥样硬化、肾脏疾病、肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病变、性功能障碍、皮肤病、消化不良或水肿。
[0436]
癌症
[0437]
在一些实施例中，本文所述的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及癌症治疗。在一些实施例中，任何癌症可使用本文所述的方法治疗。可通过本文描述的方法及固体剂型治疗的癌症的实例包括但不限于来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨头、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睪丸、舌头或子宫。另外，该癌症可特定地是下列组织学类型，但其不限于这类类型：赘瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨大及梭细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌(basal cell carcinoma)；毛发基质(pilomatrix)癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡(branchiolo-alveolar)腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状及滤泡性腺癌；非包膜性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附器癌；顶浆(apocrine)腺癌；皮脂腺癌；耵聍(ceruminous)腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒环细胞癌；浸润性管状癌；髓样癌；小叶癌；发炎癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌与鳞状转移瘤(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤(thecoma)，恶性；粒层细胞瘤，恶性；及成釉细胞瘤，恶性；赛特利氏(sertoli)细胞癌；睾丸间质细胞(leydig cell)瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肉瘤(liposarcoma)；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤(brenner tumor)，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨胚细胞瘤，恶性；间叶细胞软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing's sarcoma)；齿源性肿瘤，恶性；釉质母细胞齿源性瘤；釉质母细胞瘤，恶性；釉质母细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚叶肿瘤；小脑肉瘤；节细胞母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；何杰金氏病(hodgkin’s disease)；何杰金氏淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡型恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他指定非何杰金氏淋巴
瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞性白血病；髓样肉瘤；及毛细胞白血病。
[0438]
在一些实施例中，癌症包含实体瘤。
[0439]
在一些实施例中，癌症包含乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)。
[0440]
在一些实施例中，癌症包含结直肠癌(例如，微卫星稳定(mss)结直肠癌)。
[0441]
在一些实施例中，癌症包含肾细胞癌。
[0442]
在一些实施例中，癌症包含肺癌(例如，非小细胞肺癌)。
[0443]
在一些实施例中，癌症包含膀胱癌。
[0444]
在一些实施例中，癌症包含胃食管癌。
[0445]
在一些实施例中，本文提供的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及白血病的治疗。术语“白血病”在广义上包括造血器官/系统的进展性、恶性疾病且其特征通常在于白血球及其前体在血液及骨髓中的异常增殖及发育。白血病疾病的非限制性实例包含急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人t细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病(gross'leukemia)、里德尔细胞白血病(rieder cell leukemia)、希林氏白血病(schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血胚细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(naegeli leukemia)、浆细胞白血病、浆细胞性白血病及前骨髓细胞性白血病。
[0446]
在一些实施例中，本文提供的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及癌治疗。术语“癌”是指上皮细胞的恶性生长，这些上皮细胞往往浸润环绕组织和/或抑制生理学及非生理学细胞死亡信号并产生转移。癌的非限制性示例性类型包含腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶状癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、块状癌、
结节性皮癌、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺体癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、毛基质细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌(hurthle cell carcinoma)、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤(krompecher's carcinoma)、库尔契茨基氏细胞癌(kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆样癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏液性癌(mucinous carcinoma)、黏液癌(carcinoma muciparum)、黏液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、黏液表皮样癌、黏膜癌(carcinoma mucosum)、黏膜性癌(mucous carcinoma)、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌(schneiderian carcinoma)、硬性癌(scirrhous carcinoma)及阴囊癌(carcinoma scroti)。
[0447]
在一些实施例中，本文提供的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及肉瘤的治疗。术语“肉瘤”通常是指如胚胎结缔组织等物质组成的肿瘤且通常由包埋于原纤维、异质或均质物质中的紧密堆积细胞构成。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤(abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤(wilms'tumor sarcoma)、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤(hodgkin's sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、b细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、t细胞免疫母细胞肉瘤、晏森氏肉瘤(jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤(rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤及毛细血管扩张性肉瘤。
[0448]
可使用本文所述的方法和药物组合物和/或固体剂型治疗的另外的示例性肿瘤包括何杰金氏病(hodgkin’s disease)、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病变、睪丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、结直肠癌、直肠癌及肾上腺皮质癌。
[0449]
在一些实施例中，所治疗的癌症是黑色素瘤。术语“黑色素瘤”意指源自皮肤及其他器官的黑色素细胞系统的肿瘤。黑色素瘤的非限制性实例是哈-巴二氏黑色素瘤(harding-passey melanoma)、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤(cloudman's melanoma)、s91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤及浅表扩展性黑色素瘤。
[0450]
可使用本文所述的方法和药物组合物和/或固体剂型治疗的肿瘤的特定类别包括淋巴组织增生性疾病、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、骨癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、中枢神经系统的癌症、外周神经系统的癌症、皮肤癌、肾
癌、及所有上述的转移。特定类型的肿瘤包含肝细胞癌、肝细胞瘤、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、恶性神经节瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌内皮肉瘤、侵袭性导管癌、乳头状腺癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(充分分化、中等分化、分化不良或未分化)、支气管肺泡癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肾上腺样腺癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、睾丸肿瘤、肺癌(包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌及大细胞肺癌)、膀胱癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、血液系统恶性肿瘤(包含所有类型的白血病及淋巴瘤，包含：急性髓性白血病、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、多发性骨髓瘤、髓样淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、浆细胞瘤、结直肠癌及直肠癌。
[0451]
某些实施例中，所治疗的癌症还包含癌症前期病灶，例如光化性角化病(日旋光性角化病)、莫耳痣(发育异常痣)、光化性唇炎(农夫唇)、皮角、巴瑞特氏食管症(barrett's esophagus)、萎缩性胃炎、先天性角化不良、缺铁性咽下困难、扁平苔藓、口腔黏膜下纤维化、光化性(日旋光性)弹性组织变性及子宫颈发育不良。
[0452]
一些实施例中所治疗的癌症包含非癌性或良性肿瘤，例如内胚层、外胚层或间质起源的肿瘤，包括但不限于胆管瘤、结肠息肉、腺瘤、乳头瘤、囊腺瘤、肝细胞腺瘤、葡萄胎、肾小管腺瘤、鳞状细胞乳头瘤、胃息肉、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、脂肪瘤、纤维瘤、淋巴管瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、星形细胞瘤、痣、脑膜瘤及神经节瘤。
[0453]
其他疾病及障碍
[0454]
在一些实施例中，本文描述的方法和药物组合物和/或固体剂型涉及肝疾病的治疗。此疾病包括(但不限于)阿拉吉尔综合征(alagille syndrome)、酒精相关肝病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自体免疫性肝炎、良性肝肿瘤、胆管闭锁、肝硬化、半乳糖血症、吉尔伯特综合征、血色素沉着病、a型肝炎、b型肝炎、c型肝炎、肝性脑病、妊娠期肝内胆汁淤积症(icp)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症(lal-d)、肝囊肿、肝癌、新生儿黄疸、原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、雷氏综合征(reye syndrome)、i型糖原贮积病及威尔森病(wilson disease)。
[0455]
本文描述的方法和药物组合物和/或固体剂型可用以治疗神经退化性及神经性疾病。在某些实施例中，神经退化性和/或神经性疾病是帕金森病、阿尔兹海默症、普里昂疾病、亨廷顿病、运动神经元疾病(mnd)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、肌张力障碍、特发性颅内高压、癫痫、神经系统疾病、中枢神经系统疾病、运动障碍、多发性硬化、脑病、周围神经病变或术后认知功能障碍。
[0456]
菌群失调
[0457]
近年来，越来越清楚的是，肠道微生物组(也称为“肠道微生物群”)可通过微生物对宿主的免疫细胞和其他细胞的活性以及影响(局部和/或远端)对个体健康产生显著影响(walker,w.a.,dysbiosis[菌群失调].the microbiota in gastrointestinal pathophysiology[胃肠道病理生理学中的微生物].第25章.2017；weiss和thierry,mechanisms and consequences of intestinal dysbiosis[肠道菌群失调的机制和后果].cellular and molecular life sciences[细胞与分子生命科学].(2017)74(16):
2959-2977.zurich open repository and archive[苏黎世开放存储库和档案馆],doi:https://doi.org/10.1007/s00018-017-2509-x))。
[0458]
健康的宿主肠道微生物组稳态有时被称为“生态平衡”或“正常微生物”，而宿主微生物组的组成和/或其多样性的有害变化可能导致微生物组的不健康失衡，或“菌群失调”(hooks和o'malley.dysbiosis and its discontents[菌群失调及其不满].american society for microbiology[美国微生物学会].2017年10月.第8卷.第5期.mbio8:e01492-17.https://doi.org/10.1128/mbio.01492-17)。当微生物组稳态丧失或减弱时，可能会发生菌群失调以及相关的局部或远端宿主发炎或免疫效应，从而导致：对病原体的敏感性增加；宿主细菌代谢活性改变；诱导宿主促炎活性和/或降低宿主抗炎活性。此类效应部分地由宿主免疫细胞(例如,t细胞、树突细胞、肥大细胞、nk细胞、肠上皮淋巴细胞(iec)、巨噬细胞和吞噬细胞)和细胞因子，以及由此类细胞和其他宿主细胞释放的其他物质之间的相互作用介导。
[0459]
菌群失调可能发生在胃肠道内(“胃肠道菌群失调”或“肠道菌群失调”)，或者可能发生在胃肠道内腔外(“远端菌群失调”)。胃肠菌群失调通常与肠上皮屏障完整性降低、紧密连接完整性降低和肠通透性增加有关。citi,s.intestinal barriers protect against disease[肠屏障可预防疾病],science[科学]359:1098-99(2018)；srinivasan等人,teer measurement techniques for in vitro barrier model systems[用于体外屏障模型系统的teer测量技术].j.lab.autom[实验室自动化杂志].20:107-126(2015)。胃肠道菌群失调可以在胃肠道内外产生生理和免疫作用。
[0460]
菌群失调的存在已与多种疾病和病症相关，包括：感染，癌症，自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮(sle))或炎性疾病(例如功能性胃肠疾病如炎症性肠病(ibd)，溃疡性结肠炎和克罗恩病)，神经炎性疾病(例如多发性硬化症)，移植性疾病(例如移植物抗宿主病)，脂肪性肝病，i型糖尿病，类风湿性关节炎，干燥综合征，乳糜泻，囊性纤维化，慢性阻塞性肺疾病(copd)和其他与免疫功能障碍相关的疾病和病症。lynch等人,the human microbiome in health and disease[健康与疾病中的人类微生物组],n.engl.j.med.[新英格兰医学杂志]375:2369-79(2016)，carding等人,dysbiosis of the gut microbiota in disease[疾病中肠道微生物的菌群失调].microb.ecol.health dis[微生物生态与健康疾病].(2015)；26:10:3402/mehd.v26.2619；levy等人,dysbiosis and the immune system[菌群失调和免疫系统],nature reviews immunology[自然评论免疫学]17:219(2017年4月)。
[0461]
本文所披露的示例性药物组合物和/或固体剂型可以通过修饰存在于菌群失调部位的免疫活性来治疗菌群失调及其影响。如本文所述，此类组合物可通过对宿主免疫细胞的作用(导致例如抗炎细胞因子的分泌增加和/或促炎细胞因子的分泌减少，从而减轻受试接受者的炎症)或通过代谢产物生产的变化来修饰菌群失调。
[0462]
本文披露的可用于治疗与菌群失调相关的障碍的示例性药物组合物和/或固体剂型包含一种或多种类型的免疫调节细菌(例如抗炎细菌)和/或由此类细菌产生的mev(微生物胞外囊泡)。此类组合物能够影响接受者宿主在胃肠道中的免疫功能，和/或在受试者胃肠道外的远端部位产生系统性作用。
[0463]
本文披露的可用于治疗与菌群失调相关的障碍的示例性药物组合物和/或固体剂
型包含单一细菌物种(例如，单一菌株)的免疫调节细菌(例如，抗炎细菌)的群体和/或由此类细菌产生的mev。此类组合物能够影响接受者宿主在胃肠道中的免疫功能，和/或在受试者胃肠道外的远端部位产生系统性作用。
[0464]
在一个实施例中，将含有经分离的免疫调节细菌(例如抗炎细菌细胞)群体或由此类细菌产生的mev的药物组合物和/或固体剂型以有效治疗哺乳动物接受者的菌群失调和其一种或多种影响的量施用(例如口服)给该接受者。该菌群失调可以是胃肠道菌群失调或远端菌群失调。
[0465]
在另一个实施例中，本发明的药物组合物和/或固体剂型可以治疗胃肠道菌群失调及其对宿主免疫细胞的一种或多种影响，导致抗炎细胞因子的分泌增加和/或促炎细胞因子的分泌减少，从而减轻受试接受者的炎症。
[0466]
在另一个实施例中，药物组合物和/或固体剂型可以通过以下来治疗胃肠道菌群失调及其一种或多种影响：经由细胞和细胞因子调节来调节接受者的免疫应答，以通过增加肠上皮屏障的完整性来降低肠道通透性。
[0467]
在另一个实施例中，药物组合物和/或固体剂型可以通过以下来治疗远端菌群失调及其一种或多种影响：经由调节宿主免疫细胞来调节菌群失调部位的接受者免疫应答。
[0468]
其他示例性药物组合物和/或固体剂型可用于治疗与菌群失调有关的障碍，这些组合物含有一种或多种类型的细菌或mev，这些细菌或mev能够改变接受者中的宿主免疫细胞亚群(例如t细胞、免疫淋巴样细胞、树突细胞、nk细胞和其他免疫细胞的亚群)相对比例或其功能。
[0469]
其他示例性药物组合物和/或固体剂型可用于治疗与菌群失调有关的障碍，组合物含有单一细菌物种(例如，单一菌株)的免疫调节细菌或mev的群体，其能够改变接受者中免疫细胞亚群(例如t细胞亚群、免疫淋巴样细胞、nk细胞和其他免疫细胞)的相对比例或其功能。
[0470]
在一个实施例中，本发明提供了通过以下来治疗胃肠道菌群失调及其一种或多种影响的方法：向有需要的受试者口服施用药物组合物和/或固体剂型，该药物组合物和/或固体剂型改变存在于菌群失调部位的微生物组群体。药物组合物和/或固体剂型可以含有一种或多种类型的免疫调节细菌或mev或单一细菌物种(例如，单一菌株)的免疫调节细菌或mev的群体。
[0471]
在一个实施例中，本发明提供了通过以下来治疗远端菌群失调及其一种或多种影响的方法：向有需要的受试者口服施用药物组合物和/或固体剂型，该药物组合物和/或固体剂型改变受试者的胃肠道外的免疫应答。药物组合物和/或固体剂型可以含有一种或多种类型的免疫调节细菌或mev或单一细菌物种(例如，单一菌株)的免疫调节细菌或mev的群体。
[0472]
在示例性实施例中，可用于治疗与菌群失调有关的障碍的药物组合物和/或固体剂型刺激宿主免疫细胞分泌一种或多种抗炎细胞因子。抗炎细胞因子包括但不限于il-10、il-13、il-9、il-4、il-5、tgfβ及其组合。在其他示例性实施例中，可用于治疗与菌群失调有关的障碍的药物组合物和/或固体剂型减少(例如抑制)宿主免疫细胞分泌一种或多种促炎细胞因子。促炎细胞因子包括但不限于ifnγ、il-12p70、il-1α、il-6、il-8、mcp1、mip1α、mip1β、tnfα及其组合。其他示例性细胞因子是本领域已知的并且在本文中描述。
[0473]
在另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗或预防与菌群失调有关的障碍的方法，该方法包括向受试者施用(例如口服施用)益生菌食品或医疗食品形式的治疗组合物，该治疗组合物包含的细菌或mev的数量足以改变菌群失调部位的微生物组，从而治疗与菌群失调有关的障碍。
[0474]
在另一个实施例中，益生菌食品或医疗食品形式的本发明的药物组合物和/或固体剂型可用于预防或延迟处于发展为菌群失调风险的受试者中菌群失调的发作。
[0475]
实例
[0476]
实例1：血红蛋白依赖性细菌的示例性制造方法
[0477]
本文示出了用于制备血红蛋白依赖性细菌(例如，栖组织普雷沃菌)的示例性制造方法。在此示例性方法中，该血红蛋白依赖性细菌在例如包含表4或5中所列的组分、包含螺旋藻的生长培养基中生长。在使用之前将培养基进行过滤灭菌。
[0478]
通过粉末化螺旋藻属片剂并在水中或0.01m naoh中溶解粉末制备螺旋藻属。将溶液通过高压蒸汽灭菌进行灭菌，并在不同工作浓度(例如，0.02g/l、0.2g/l、或2g/l)下添加至生长培养基。
[0479]
表4：示例性生长培养基
[0480]
组分g/l酵母提取物1951210大豆蛋白胨a2sc 1964912.5大豆蛋白胨e110 1988512.5磷酸氢二钾k2hpo41.59磷酸二氢钾0.91l-半胱氨酸-hcl0.5氯化铵0.5glucidex 21d(麦芽糖糊精)25葡萄糖10螺旋藻属1
[0481]
表5：另一种示例性生长培养基(spyg1培养基)
[0482]
mae100p进行用于肠溶释放的顶包衣。参见表7-9。
[0493]
表7：栖组织普雷沃菌片剂组成
[0494][0495]
上面提到的栖组织普雷沃菌菌株已被保藏为栖组织普雷沃菌菌株b(nrrl登录号b 50329)。
[0496]
表7的剂量组合物以17.4mm x 7.1mm的片剂提供。
[0497]
表7中的栖组织普雷沃菌菌株b(nrrl登录号b 50329)粉剂进一步包括至少一种螺旋藻组分。
[0498]
表8：底包衣组合物
[0499]
材料(％w/w)欧巴代qx蓝15.00wfi85.00总计100.00
[0500]
表9：顶包衣组合物
[0501]
材料(％w/w)kollicoat mae 100p15.00tec2.25滑石粉3.00水79.75总计100
[0502]
每片剂的目标重量为650mg(剂量强度为162.5mg)。
[0503]
实例3：包含栖组织普雷沃菌的胶囊的制备
[0504]
制备表10中的以下配方。
[0505]
表10：栖组织普雷沃菌胶囊组成
[0506][0507]
#根据原料药的效力进行调整以确保目标强度。
[0508]
该胶囊是肠溶包衣的，用于ph 5.5释放。
[0509]
表10中的栖组织普雷沃菌(冻干)粉剂进一步包括至少一种螺旋藻组分。
[0510]
上面提到的栖组织普雷沃菌菌株已被保藏为栖组织普雷沃菌菌株b(nrrl登录号b 50329)。
[0511]
实例4：包含栖组织普雷沃菌的胶囊的制备
[0512]
制备表11中的以下配方。
[0513]
表11：栖组织普雷沃菌胶囊组成
[0514][0515]
#根据原料药的效力进行调整以确保目标强度。
[0516]
该胶囊是肠溶包衣的，用于ph 5.5释放。
[0517]
表11中的栖组织普雷沃菌(冻干)粉剂进一步包括至少一种螺旋藻组分。
[0518]
上面提到的栖组织普雷沃菌菌株已被保藏为栖组织普雷沃菌菌株b(nrrl登录号b 50329)。
[0519]
已经根据该配方制备了一批经肠溶包衣的胶囊。
[0520]
实例5：包含栖组织普雷沃菌的胶囊的制备
[0521]
制备根据以下表12中的配方的胶囊：
50329)。
[0539]
已经根据该配方制备了一批经肠溶包衣的胶囊。
[0540]
实例7：包含栖组织普雷沃菌的胶囊的制备
[0541]
制备根据以下表14中的配方的胶囊：
[0542]
表14：栖组织普雷沃菌胶囊组成
[0543][0544]a由羟丙基甲基纤维素和二氧化钛组成。
[0545]b根据原料药的效力进行调整以确保目标强度。
[0546]
表14中的栖组织普雷沃菌(冻干)粉剂进一步包括至少一种螺旋藻组分。
[0547]
将胶囊用基于hpmc的封口溶液封口。
[0548]
将封口的胶囊用聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)共聚物进行肠溶包衣。
[0549]
实例8：螺旋藻组分的检测
[0550]
在螺旋藻制剂中检测到螺旋藻的两种示例性组分。通过qpcr检测制剂中螺旋藻的以下两种组分：
[0551]
·
叶绿素a合成酶(chlg)
[0552]
·
c-藻蓝蛋白α亚基(cpca)
[0553]
螺旋藻的基因组序列来源于ncbi参照序列：nz_afxd00000000.1钝顶节旋藻c1，全基因组鸟枪法测序计划(万维网ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nz_afxd00000000.1)。基于光学作图，估计钝顶节旋藻的基因组结构是6.8mb的单个、环状染色体。该6.7mb序列的注释产生了6630个蛋白编码基因(参见fujisawa等人.(2010)dna res.[dna研究]17:85-103)。
[0554]
螺旋藻特异性qpcr测定旨在靶向高度保守基因组序列(例如chlg＝在叶绿酸生物合成中的最终酶；cpca＝c-藻蓝蛋白亚基a)，该高度保守基因组序列在螺旋藻菌株之间应该差异最小。
[0555]
使用以下taqman引物/探针组检测螺旋藻特异性chlg和cpca基因的存在：
[0556]
chlg组
[0557]
fwd：gccctattcggagaactcaac
[0558]
rev：gatcgccttcgacactcttaaa
[0559]
探针：caccctattctacagcttggcggg
[0560]
cpca组
[0561]
fwd：gctcgaaagtccggttgatt
[0562]
rev：acctgcggatggtaacttattg
[0563]
探针：accggcaatcaggtactcatccat
[0564]
表15：qpcr循环条件
[0565]
阶段重复温度时间1195.0℃10:0024095.0℃0:10
ꢀꢀ
60.0℃0:30
[0566]
用1.0e 06、1.0e 04和1.0e 02拷贝的螺旋藻dna(螺旋藻为商业来源)进行qpcr。结果表示，两种qpcr测定(chlg和cpca)的扩增效率和灵敏度几乎相同。数据未示出
[0567]
实例9：在不同工艺中制造的药剂中，螺旋藻组分的检测和定量
[0568]
在(i)使用四种工艺之一制造的普雷沃菌属菌株b药剂批次，(ii)普雷沃菌属菌株b药剂参照批次，和(iii)作为阴性对照的非血红蛋白依赖性菌株(未在含有螺旋藻的生长培养基生长的非普雷沃菌属菌株)中，使用qpcr检测并定量螺旋藻组分。工艺1和2中的生长培养基不含螺旋藻；工艺3和4中的生长培养基含有螺旋藻；用于制造普雷沃菌属菌株b参照批次的工艺的生长培养基不含螺旋藻。
[0569]
qpcr结果显示在表15中。通过从普雷沃菌属菌株b参照批次ct值中减去chlg和cpca ct值来计算δct值。使用公式2^-δct计算百分比值。如表15中所示，使用工艺1和工艺2制造的普雷沃菌属菌株b样品显示出不可检测水平的螺旋藻dna，其与非血红蛋白依赖性菌株样品相似。然而，相对于普雷沃菌属菌株b基因组dna，使用工艺3和工艺4制造的普雷沃菌属菌株b样品，以及普雷沃菌属菌株b参照批次显示出不同水平的残余螺旋藻dna。
[0570]
实例10：粉剂制备样品方案
[0571]
在达到所需水平的细菌培养物生长后，离心培养物，弃去上清液，使沉淀尽可能干燥。将沉淀重悬于所需的冷冻保护剂溶液中，制成配制的细胞糊。冷冻保护剂可包含例如麦芽糊精、抗坏血酸钠、谷氨酸钠和/或氯化钙。将配制的细胞糊装载到不锈钢托盘上，然后装载到冷冻干燥机中，例如以定义的循环参数以自动模式运行。将冷冻干燥的产品送入铣床中，并收集所得的粉剂(例如，药剂)。
[0572]
将粉剂在2-8摄氏度(例如在4摄氏度)下，储存于例如干燥器中(例如真空密封袋中)。
[0573]
实例11：γ-照射：样品方案：
[0574]
粉剂在环境温度下以17.5kgy辐射单位进行γ照射。冷冻生物量在干冰存在下以25kgy辐射单位进行γ照射。
[0575]
实例12：包含栖组织普雷沃菌的片剂
[0576]
用下表16中的配方制备片剂。
[0577]
表16：栖组织普雷沃菌片剂组成
50329)。
[0591]
在表17中，栖组织普雷沃菌(冻干)粉剂进一步包括至少一种螺旋藻组分。
[0592]
将胶囊用基于hpmc的封口溶液封口。
[0593]
将封口的胶囊用尤特奇l30-d55(一种聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)共聚物)进行肠溶包衣。
[0594]
[0595]
通过援引并入
[0596]
在本文中提及的所有出版物、专利申请都通过援引以其全文特此并入，如同各个单独的出版物或专利申请被确切地并且单独地指明为通过援引并入。如果出现冲突，则以本技术(包含本文的任何定义)为准。
[0597]
等效形式
[0598]
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能确定本文所述本发明的具体实例的许多等效形式。此类等效形式旨在为下列权利要求所涵盖。