一种角豆黄酮类组合物的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种角豆黄酮类化合物组合物的制备方法及应用。


背景技术：

2.黄酮类化合物是水果和蔬菜中种类最丰富的次级代谢物，主要以色素的形式存在。天然存在的黄酮类化合物具有很高的药用价值，包括抗菌、抗炎、抗癌等。但由于其低含量、低溶解性、低稳定性等局限性，天然黄酮类化合物的利用受到限制。因此天然角豆化合物的协同增效方面的研究至关重要。
3.角豆(ceratonia siliqua l.)，原产于地中海东部，目前在国内已由人工引种栽培。制取的角豆胶广泛用于造纸、纺织、化妆绘画油料和胶糖剂等，角豆子制成角豆粉广泛用于食品加工领域。角豆具有非常高的营养价值，富含矿物质及微量元素，含有的单宁、多酚类物质具有药用价值。本发明角豆果荚提取物提取方法简便易行，成本低廉，无污染，多靶点作用安全有效。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种角豆黄酮类化合物组合物的制备方法。
5.本发明另一目的在于角豆黄酮类化合物组合物的应用，具体具有有助于抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫力等功效，可用于治疗心血管疾病等领域。
6.上述角豆黄酮类化合物制备方法包括以下步骤：
7.将角豆果荚粉碎过筛，优选地采用40-80目药筛；
8.将角豆荚粗粉用醇提法提取，优选地先采用80-100％乙醇提取2-5次，再采用60-80％乙醇溶液提取1-3次。合并浓缩液得到浸膏；
9.将上述浸膏用蒸馏水分散过大孔吸附树脂d101进行吸附，蒸馏水洗脱除去糖类等杂质，再用90-100％乙醇洗脱，得到非糖类小分子部位；
10.将上述非糖类小分子部位用200-300目硅胶柱色谱梯度洗脱，优选地，洗脱系统采用石油醚-乙酸乙酯和二氯甲烷-甲醇，洗脱溶液体积比为石油醚-甲醇1:1-0:1、二氯甲烷-甲醇7:1-0:1，tlc检识合并相似流份；
11.将上述流份经200-300目硅胶柱色谱或ods柱色谱梯度洗脱，优选地，硅胶柱色谱洗脱溶液为石油醚-乙酸乙酯(3:1-0:1体积比)，ods柱色谱洗脱溶液为甲醇-水(15:85-100:0体积比)，tlc检识合并相似流份；
12.将上述流份用sephadex lh-20色谱柱分离，优选地，流动相采用二氯甲烷-甲醇(40-60:40-60体积比)洗脱；
13.再将流份采用半制备液相分离纯化，优选地，采用ymc-pack ods-a色谱柱柱ⅰ或/和柱ⅱ，柱ⅰ内径为20mm，柱ⅱ为内径为10mm。优选地流动相采用甲醇-水(35-60:40-65体积比)；
14.本发明所述角豆黄酮类化合物提取方法可以得到一种或多种黄酮类化合物。
15.本发明所述角豆黄酮类化合物组合物包含3-o-甲基槲皮素、7，4
’‑
二羟基黄酮、槲皮苷、杨梅苷、杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷2种或多种。
16.本发明所述角豆黄酮类化合物组合物中化合物3-o-甲基槲皮素、7，4
’‑
二羟基黄酮、槲皮苷、杨梅苷、杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷比例为10-35:15-35：10-35:5-20:10-25。
17.本发明所述角豆黄酮类化合物组合物作为食品、保健品、医药领域的生物活性筛选结果表明：
18.上述组合物具有良好的dpph自由基清除能力，具有良好的抗氧化功效。
19.上述组合物能够显著降低lps溶液诱导的raw264.7小鼠巨噬细胞的炎性因子no含量及肿瘤坏死因子tnf-α、il-1β表达量，具有显著的抗炎、抗肿瘤功效。
20.上述组合物能够良好的提高斑马鱼t细胞荧光强度，具有有助于提高免疫力的功效。
21.上述组合物用于食品、保健品、医药领域，至少一种或多种。
22.上述应用所述产品至少具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫力的功效一种或多种。
附图说明
23.图1为raw264.7细胞表达的dpph自由基清除率示意图。
24.图2为raw264.7细胞表达的炎性因子no的含量示意图。
25.图3为raw264.7细胞表达的肿瘤坏死因子(tnf-α)的含量示意图。
26.图4为raw264.7细胞表达的白介素-1(il-1β)的含量示意图。
27.图5为斑马鱼t细胞荧光强度影响示意图。
具体实施方式
28.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
29.实施例1各组分提取方法
30.取干燥的角豆树去种子果荚10份重量份，粉碎得到≥60目粗粉，加入粗粉7倍重量份的95％乙醇回流提取2次(每次1.5小时)，再用70％乙醇回流提取1次(1.5小时)，合并提取液浓缩得到浸膏5份重量份。用5份重量份的水将浸膏分散，经大孔吸附树脂d101进行吸附，用蒸馏水洗脱3个柱体积除去糖类等杂质，再用95％乙醇洗脱3个柱体积，回收溶剂后得到非糖类小分子部位。将得到的非糖类小分子部位用1份重量份的50％甲醇分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯分别萃取5次，回收溶剂后分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。
31.获得乙酸乙酯部位物质后，优选地，采用200目硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯和二氯甲烷-甲醇两个洗脱系统梯度洗脱，洗脱液石油醚-乙酸乙酯体积比为1:1、3:1、0:1，洗脱液二氯甲烷-甲醇体积比为7:1,、5:1、3:1、1:1、0:1，tlc薄层检识，合并相似流份。重复上述操作1-3次。得到流份a-j(极性由小到大)。
32.a.将流份c经300目硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯体积比为3:1、2:1、1:1、0:1梯度洗脱。将得到的流份经tlc薄层检识，合并相似流份，得到5个流份c1-c5。将流份c4经sephadex lh-20色谱柱，二氯甲烷-甲醇(1:1)洗脱，得到6个流份c4a-c4f。将流份c4d
经半制备液相(柱ⅰ，甲醇：水＝56:44，吸收波长210nm)得到3-o-甲基槲皮素(tr＝26.50min)。
33.b.将流份d经300目硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯体积比为3:1、2:1、1:1、0:1梯度洗脱。将得到的流份经tlc薄层检识，合并相似流份，得到4个流份d1-d4。将流份d3经sephadex lh-20色谱柱，二氯甲烷-甲醇(1:1)洗脱，得到5个流份d3a-d3e。将流份d3c经半制备液相(柱ⅰ，甲醇：水＝54:46，吸收波长330nm)，洗脱流分再经半制备液相(柱ⅱ，甲醇：水＝43:57，吸收波长300nm)纯化，得到7，4
’‑
二羟基黄酮(tr＝76.86min)。
34.c.合并流份f和g，经ods色谱柱，甲醇-水(体积比为15:85-100:0)梯度洗脱，将得到的流份经tlc薄层检识，合并相似流份，得到6个流份f1-f6。将流份f5经sephadex lh-20色谱柱，二氯甲烷-甲醇(1:1)洗脱，得到5个流份f5a-f5e。将流份f5c经制备液相(柱ⅰ，甲醇：水＝50:50，吸收波长210nm)分离，流分再经半制备液相(柱ⅱ，甲醇：水＝48:52，吸收波长210nm)纯化，得到化合物槲皮苷(tr＝25.00min)。
35.d.合并流份f和g，经ods色谱柱，甲醇-水(体积比为15:85-100:0)梯度洗脱，将得到的流份经tlc薄层检识，合并相似流份，得到6个流份f1-f6。将流份f4经sephadex lh-20色谱柱，二氯甲烷-甲醇(1:1)洗脱，得到5个流份f4a-f4e。将f4c经制备液相(柱ⅰ，甲醇：水＝40:60，吸收波长217nm)分离，流分再经半制备液相(柱ⅱ，甲醇：水＝36:64，吸收波长217nm)纯化，得到化合物杨梅苷(tr＝46.47min)。
36.e.将流份i经ods色谱柱，甲醇-水(体积比为15:85-100:0)梯度洗脱，将得到的流份经tlc薄层检识，合并相似流份，得到5个流份i1-i5。将流份i3经sephadex lh-20色谱柱，二氯甲烷-甲醇(1:1)洗脱，得到5个流份i3a-i3e。将流份i3e经半制备液相(柱ⅰ，甲醇:水＝50:50，吸收波长230nm)分离，流分再经半制备液相(柱ⅱ，甲醇:水＝56:54，吸收波长210nm)纯化，得到化合物杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷(tr＝16.14min)。
37.实施例2组合物的制备方法
38.组合物1：
39.3-o-甲基槲皮素(实施例1制备)28g
40.7，4
’‑
二羟基黄酮(实施例1制备)31g
41.槲皮苷(实施例1制备)15g
42.杨梅苷(实施例1制备)11g
43.杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷(实施例1制备)15g
44.组合物2
45.3-o-甲基槲皮素(实施例1制备)13g
46.7，4
’‑
二羟基黄酮(实施例1制备)17g
47.槲皮苷(实施例1制备)32g
48.杨梅苷(实施例1制备)15g
49.杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷(实施例1制备)23g
50.组合物3：
51.3-o-甲基槲皮素(实施例1制备)32g
52.7，4
’‑
二羟基黄酮(实施例1制备)28g
53.槲皮苷(实施例1制备)15g
54.杨梅苷(实施例1制备)8g
55.杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷(实施例1制备)17g
56.对比例1
57.与实施例2区别在于，组合物1中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷(实施例1制备)含量为0g。
58.对比例2
59.与实施例2区别在于，组合物1中杨梅苷(实施例1制备)含量为0g。
60.对比例3
61.与实施例2区别在于，组合物1中槲皮苷(实施例1制备)含量为0g。
62.对比例4
63.与实施例2区别在于，组合物1中7，4
’‑
二羟基黄酮(实施例1制备)含量为0g。
64.对比例5
65.与实施例2区别在于，组合物1中3-o-甲基槲皮素(实施例1制备)含量为0g。
66.对比例6
67.与实施例2区别在于，组合物1中杨梅苷和槲皮苷(实施例1制备)含量为0g。
68.实验例1组合物的抗氧化功效检测
69.将实施例2中组合物1-3及对比例1-6加蒸馏水至浓度为0.1mmol/l。取5支试管分别加入2ml浓度为0.15mmol/l的dpph溶液(溶剂为无水乙醇)及2ml样品溶液，均匀避光37℃下静置30min。后于517nm处测吸光度as，平行5次。相同条件下测2ml无水乙醇及2ml样品溶液混合溶液的吸光度ab，相同条件下测2mldpph溶液及2ml蒸馏水混合溶液的吸光度ac，计算dpph自由基清除率。结果如图1所示。
70.自由基清除率(％)＝(1-(as-ab)/ac)
×
100％
71.根据实验结果，组合物1、2、3具有良好的dpph自由基清除能力，说明角豆黄酮类化合物组合物具有有助于抗氧化的功效。
72.实验例2组合物抗炎、抗肿瘤功效检测
73.(1)对炎性因子no含量影响
74.角豆黄酮类化合物组合物对raw264.7细胞表达的炎性因子no及肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-1(il-1β)影响实验。实验包括以下步骤过程：
75.实验分组如下：
76.空白对照组：未加入药物和脂多糖(lps)的raw264.7细胞；
77.lps模型组：加入浓度为0.1μg/ml的lps处理的raw264.7细胞；
78.药物组：脂多糖(lps)处理的raw264.7细胞 药物。其中加入的药物为组合物1-3或对比例1-6，浓度设置为100μg/ml。
79.raw264.7小鼠巨噬细胞株购自中国上海中科院细胞培养中心。raw264.7细胞复苏后，用含体积分数为10％的胎牛血清、质量浓度为100mg/l青霉素和100mg/l链霉素的dmem完全培养基培养，并置于37℃、5％co2饱和湿度的细胞培养箱中。
80.药物组(组合物1-3和对比例1-6)加入100μg/ml药物培养1h后，lps模型组和药物组分别加入lps溶液，使最终浓度为1μg/ml。培养24h后收集上清液，griess法测定炎性因子no含量。结果如图2所示。
81.(2)对肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-1(il-1β)影响
82.将1ml浓度为5
×
105个/ml raw264.7细胞接种于6孔培养板中培养，并置于37℃、5％co2饱和湿度的细胞培养箱中。药物组(组合物1-3和对比例1-6)加入100μg/ml药物培养1h后，每孔加入lps溶液，使最终浓度为1μg/ml。继续培养至24h后收集上清液,重复3次。elisa法检测tnf-α和il-1β含量。
83.角豆黄酮类化合物组合物影响raw264.7细胞no含量如图2所示，tnf-α、il-1β表达量的结果如图3、图4所示。结果表明，角豆黄酮类化合物组合物能够显著减少raw264.7炎症细胞no含量，tnf-α、il-1β表达量，说明角豆黄酮类化合物组合物具有良好的改善抗炎、抗肿瘤功效。
84.实验例3组合物提高免疫力功效检测
85.随机选取3dpf转基因t细胞红色荧光斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。水溶给予15μg/ml实施例2组合物1-3，同浓度阳性对照百令胶囊，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液，建立斑马鱼免疫低下模型。28℃处理至5dpf，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼t细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价t细胞减少改善功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。
86.结果如图5所示，角豆黄酮类化合物组合物能够明显提高t细胞荧光强度，说明角豆黄酮类化合物组合物具有有助于改善免疫能力功效。
87.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。