一种长期保存兰科天麻属植物种子的方法

本技术涉及生物，尤其涉及一种长期保存兰科天麻属植物种子的方法及应用。

背景技术：

1、天麻属（学名： gastrodiar. br.）是被子植物门兰科下的一个属，全属超过20种，分布于东亚、东南亚至大洋洲等，中国有超过15种分布。该属的天麻（ gastrodia elatabl.）及原天麻（ gastrodia angustas. chow&s. c. chen）的根状茎可以入药，具有较高的药用价值。两种植物的野生种质资源都面临较大威胁，在《中国国家重点保护野生植物名录（2021）》中天麻及原天麻都是国家二级保护植物，亟需采取包括种子保存在内的多种方法对其种质资源进行保护。

2、种子作为兰科天麻属植物重要的有性繁殖材料，其种子极其细小且很容易失去活力。种子长期保存效果差，制约着天麻属植物种质资源的保护与保存，严重影响着优良资源的筛选与新品种创制。因此，如何对兰科天麻属植物种子进行长期有效保存，对于优良品种选育及种质资源保护具有重要的意义。

3、现有技术中，关于兰科天麻属植物种子的保存，非专利文献中：黄万兵.不同处理对天麻种子保存时活力的影响[j].中药材，2018，41（10）:2261-2265中明确记载到对于含水率为28.80%的新鲜天麻种子4℃保存1年活力低于25%、含水率为3.70%的真空冻干天麻种子4℃保存1年活力低于37%、含水率为5.40%的真空冻干天麻种子-20℃保存1年后活力不足5%，含水率为6.40%的真空冻干天麻种子-70℃保存一年后活力不足21%；需要注意的是该研究仅报道了氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，ttc）染色后的活力，但未报道萌发率，而本领域众所周知种子的萌发率通常低于ttc染色活力。该研究认为：与降低贮藏温度相比，降低天麻种子的含水量对于天麻种子活力的保持更有效，天麻种子贮藏的安全含水量远小于 5%，对天麻种子进行低温及超低温长期保存需要利用非穿透防冻保护剂。

4、王苗苗等.“乌天麻种子低温保存研究”中国植物园（第十五期）2011. 86-89.中记载了：在一定程度上，干燥时间的延长可以减缓染色率和萌发率降低的趋势。乌天麻种子利用过饱和氯化钙溶液干燥72h低温保存效果较好。-20℃低温保存120天后乌天麻种子ttc染色率为43%，萌发率为14%。

5、此外，现有技术中公开号为cn116584252a中公开了《一种天麻种子的保存及活力检测方法》，该方法中将采摘当天的天麻蒴果进行真空冻干处理至含水量为1.5~2.5％，再将干燥后的天麻蒴果冷藏保存；该方法保存的天麻种子保存2年后的天麻种子活力可达37.64％。但该检测方法中并未记载冷藏保存一年后种子活力的相应数据。此外，该方法中活力由ttc染色获得，但未报道保存后种子的萌发率，仅提到播种100mg种子，萌发最多的培养基上有234粒种子萌发，考虑到天麻属种子极为细小，千粒重小于10mg，因此100mg种子保守估计也超过1万粒，按10000粒种子计算，萌发率仅为2.34%。

6、显然，现有技术中对于兰科天麻属植物种子的中长期保存研究取得了一定的成果。但是，从上面也可以看出，上述现有技术中公开的一年后的种子活力及萌发率仍然处于一个较低的水平。对于本领域技术人员来说，基于现有的研究成果继续探索兰科天麻属植物种子的中长期更加有效的保存方法仍是面临的技术难题。

技术实现思路

1、为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本技术提供一种长期保存兰科天麻属植物种子的方法，利用本技术中的方法，能够有效延长兰科天麻属植物种子的保存时间，在经过较长时间的保存以后，种子仍然具有较高的活力和萌发率。

2、本技术中的一种长期保存兰科天麻属植物种子的方法，包括将待保存的兰科天麻属植物种子置于环境温度为15-25℃且环境相对湿度为15-75%的条件下，进行种子与种子所处环境的相对湿度平衡处理；

3、待种子与种子所处环境两者之间的相对湿度平衡后，将种子置于可密闭的存储容器中、密闭后然后置于4℃、-20℃或液氮条件下进行保存。

4、可选的，在一些实施方式中，将待保存的兰科天麻属植物种子置于环境温度为15-25℃且环境相对湿度为15-75%的条件下5-30h，进行种子与种子所处环境的湿度平衡处理。种子相对湿度与环境相对湿度达到平衡所需时间受到种子数量、种子初始含水量及所营造相对湿度密闭空间的大小及营造相对湿度的试剂或设备在此密闭空间中保持一定相对湿度的能力等因素影响。判断种子是否达到与环境相对湿度的平衡可以利用湿度计检测种子的相对湿度（本技术实施过程中采用rotronic ltd.（crawley，uk）所生产的rotronichygrolab c1湿度计连接hc2-aw 探头对种子的相对湿度进行测量）。通常情况下，对于一定量的天麻属植物种子，采用较多的试剂或较强的设备在合适的空间中制造相对湿度，可以在5-30小时内使种子的相对湿度与环境相对湿度平衡。

5、可选的，在一些实施方式中，所述环境相对湿度为15-75%是在干燥器内通过注入饱和食盐水溶液（或其他饱和盐溶液）或者是特定浓度的氯化锂溶液营造得到。常用饱和盐溶液及其相对湿度可以通过查阅国际建议的‘饱和盐溶液标准相对湿度表’获得（参考文献：易洪等.饱和盐溶液标准相对湿度表（国际建议）介绍[a].李玉忠.第七届全国湿度与水分学术交流会论文集[c].呼和浩特:内蒙古大学出版社，1998.70.），比如氯化钠的饱和盐溶液在15-30°c 下可以营造75.61-75.09%的相对湿度，氯化镁的饱和溶液在15-30°c下可以营造33.30-32.44%的相对湿度。20°c下氯化锂溶液浓度与所能营造的相对湿度（rh）可以根据以下公式计算： rh×100=107.93-2.11×（氯化锂溶液浓度×100），相应的:所需氯化锂溶液浓度=（107.93-目标rh×100）÷211×100%），因为饱和氯化锂溶液的浓度约为45.8%，因此氯化锂溶液浓度范围为0%到45.8%之间。具体地操作时，先根据计算结果配制某个浓度的氯化锂溶液，然后用湿度计检测相对湿度（本技术实施过程中采用rotronic ltd.（crawley，uk）所生产的rotronic hygrolab c1湿度计连接hc2-aw 探头对溶液产生的相对湿度进行测量），根据实际测得的相对湿度，通过适量添加氯化锂或水进一步调配，最终得到需要的相对湿度（需要说明的是，该种相对湿度营造方式为现有技术，本领域技术人员完全能够理解）。同时在进行种子与种子所处环境的湿度平衡处理时，种子置于位于干燥器内的铝盘中且种子不与溶液接触。

6、可选的，在一些实施方式中，所述环境温度为15-25℃且环境相对湿度为15-75%的条件通过具有控温和控湿功能的装置来实现。需要注意的是，无论是采用何种方法，所营造的相对湿度及温度都会在某一范围内波动，如氯化钠饱和盐溶液在15°c下的密闭容器中营造的相对湿度为75.6%±0.2%（均值±标准误，下同）；一定浓度的氯化锂溶液所营造的相对湿度也会随着环境温度变化而波动；控温控湿的装置所营造的温湿度也会有一定的波动范围，在本技术中实施例中，这些波动及误差未对结果产生实质性的影响。

7、可选的，在一些实施方式中，所述兰科天麻属植物蒴果来源于人工授粉后成熟的蒴果或者是自然结实成熟的蒴果。

8、可选的，在一些实施方式中，所述兰科天麻属植物蒴果呈现略微开裂或者是即将开裂状态。

9、可选的，在一些实施方式中，所述兰科天麻属植物为天麻（ gastrodia elatabl.）或者是原天麻（ gastrodia angustas. chow&s. c. chen）。

10、可选的，在一些实施方式中，所述可密闭的存储容器为冻存管。

11、需要说明的是，本技术中涉及到对种子进行种子活力检测时，采用的是本领域公知的氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，ttc）染色法，本领域技术人员完全能够理解和实施。

12、进一步地，本技术中涉及到的对于种子萌发率的检测，采用的是如下方法：

13、具体地，包括以下步骤：

14、1）将用于进行萌发率检测的种子消毒处理；

15、2）扩繁萌发菌：萌发菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上暗培养；所述萌发菌为如紫萁小菇（ mycena purpureofusca）；具体地，本技术中不同条件保存不同时期后的种子萌发采用的紫萁小菇为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号cgmcc no. 5.894的菌种；扩繁萌发菌暗培养条件具体为：黑暗条件，培养温度为23°c，培养时间为3周。

16、3）萌发培养基配置：配置1%琼脂/水培养基；

17、4）天麻种子萌发：取步骤2）中预定尺寸扩繁后长有萌发菌菌丝的菌块放置于萌发培养基中，取消毒后的种子播种于距离萌发培养基中萌发菌菌块5mm距离处，将萌发培养基放置于培养箱中暗培养。该步骤中所述预定尺寸萌发菌菌块直径为8mm。培养箱中培养中暗培养条件为：黑暗条件，培养温度为23°c，培养时间为6-8周。

18、当然，除了上述记载的萌发率检测方法，本领域技术人员也可以采用现有技术中公开的一些其他检测方法对种子萌发率进行检测。

19、与现有技术相比较，本技术提供的技术方案具有以下有益效果：

20、（1）本技术通过营造15-75%的相对湿度对种子进行湿度平衡处理，并在湿度平衡处理后将种子放入密闭容器中置于4℃、-20℃或液氮条件下进行保存；结果显示：对于从农户购买的乌天麻种子，50%的相对湿度下进行湿度平衡处理、液氮保存1年后萌发率大于60%；对于从农户购买的红天麻种子，75%的相对湿度下进行湿度平衡处理然后放入液氮保存13个月后活力为79.6%±1.3%（均值±标准误，下同），萌发率为73.1%±3.0%；对于果实未成熟的植株，整株移栽人工气候室，待果实开裂后采集的乌天麻种子，种子初始活力为93.6%±1.0%，-20℃保存13个月后，种子活力为92.1%±2.0%，液氮保存13个月后种子活力为92.8%±1.1%；-20℃保存20个月后的种子活力为88.7%±2.7%，萌发率为85.8%±1.4%；液氮保存20个月后的活力为86.7%±3.3%，萌发率为70.8%±1.4%；对于自行授粉采收的红天麻、绿天麻及乌天麻种子，不同相对湿度下达到种子与所处环境相对湿度平衡后，液氮保存1年后活力超过90%，萌发率为75.0%-90.6%；-20℃保存一年的种子，活力均超过90%，萌发率为59.4%-93.8%，4℃保存1年后活力均超过80%，萌发率为44.4%-83.1%。

21、（2）利用本技术中的方法对种子进行处理和保存，实验数据表明，在经过保存一年甚至长达20个月的保存期限以后，保存后的种子活力和萌发率远超现有保存技术的保存效果。虽然现有技术中公开号为cn116584252a中公开了《一种天麻种子的保存及活力检测方法》，有保存了2年（24个月）的数据，但其活力仅为37.64%，萌发率更低（据其提供的结果估算应该低于2.34%），本技术中对初始活力为93.6%±1.0%种子进行保存，-20℃保存13个月后，种子活力为92.1%±2.0%，液氮保存13个月后种子活力为92.8%±1.1%；而进一步延长保存时间，-20℃保存20个月后的种子活力为88.7%±2.7%，萌发率为85.8%±1.4%；液氮保存20个月后的活力为86.7%±3.3%，萌发率为70.8%±1.4%；利用spss软件对初始种子活力、-20℃及液氮保存13个月及20个月的种子活力以及保存20个月的萌发率进行one-way anova方差分析，并用student-newman-keuls（s-n-k）法进行多重比较，结果表明，除液氮保存20个月后的萌发率显著低于初始活力外，保存13及20个月后的种子活力以及-20℃保存20个月后的种子萌发率与初始活力没有显著差异。按照种子老化趋势及低温（超低温）保存一般理论推断，4个月的时间不会对活力及萌发率造成显著影响，因此本方法的效果远超现有技术。

22、（3）本技术中的方法具有较强的普适性，对于天麻属不同种类如天麻及原天麻，以及天麻的多个不同变型（乌天麻、红天麻及绿天麻）及不同来源的种子（农户购买、移栽采种、自行授粉采种）均适用，同时本技术中的方法也较为简单易行，实施人可根据自身设备条件选择相应的温度及相对湿度营造条件及保存温度（例如可以利用食盐配制饱和食盐水营造约75%的相对湿度，利用冰箱实现4到20℃的低温）。

23、（4）基于本技术中的多个实施例中的数据结果，本领域技术人员完全有理由推断，本技术中的方法对兰科天麻属下的除了原天麻和天麻种以外的其他种也同样适用，甚至不排除对其他一些属的种子也适用。

24、（5）现有技术中提到：低温或超低温保存时，5%的肌醇能有效避免低温对种子的伤害，同时与降低贮藏温度相比，可能降低天麻种子的含水量对于天麻种子活力的保持更有效，天麻种子贮藏的安全含水量远小于 5%（黄万兵等，2018）；或者采用真空冻干的方法使种子含水量降至1.5-2.5%然后再3-6°c保存（cn116584252a）；然而，本技术中的数据表明，一方面在低温和超低温状态下进行种子的保存，并不需要任何低温保护剂；另一方面当种子的湿度平衡至75%时，种子含水量并未远低于5%且没有低温保护剂的情况下，种子经过较长时间的保存后，仍然具有较高地种子活力和萌发率，也不需要使用真空冻干的方法进行干燥；而且我们的数据表明，使用15%相对湿度干燥种子往往使种子含水量低于3%，在一些情况下会降低种子的保存效果。另外现有技术也认为干燥时间的延长可以减缓染色率和萌发率降低的趋势，乌天麻种子利用过饱和氯化钙溶液干燥72小时后保存效果较好（王苗苗等，2011）；但本技术的数据说明，不需要延长干燥时间，只要达到种子与种子所处环境相对湿度的平衡，干燥5-30小时后低温保存种子即可使种子保存较高的活力及萌发率。