一种诱导构属植物茎生根尖的方法及其在染色体制片上的应用

本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及一种诱导构属植物茎生根尖的方法；还涉及该方法在构属植物染色体制片上的用途。

背景技术：

1、构树(broussonetia papyrifera)属于桑科构属(broussonetia)。构树在造纸、饲料、药用、绿化和生态修复等方面具有广泛的用途，因而近年来构树的进化研究和育种也受到越来越多的重视。

2、经过长期的自然选择和进化，构属植物形成了丰富的遗传类型，如构属植物的染色体数目类型有4种(2n＝24、26、39和52)，这些丰富的遗传类型构成了构树育种的种质资源基础。构属植物的进化研究和育种都需要对构属植物进行细胞遗传学研究和鉴定，而染色体制片是进行染色体数目分析、倍性鉴定、带型分析和染色体原位杂交等细胞遗传学研究的基础。作为重点利用营养体特性的构树，倍性育种是提高构树生物量和品质的有效途径，也需要通过染色体制片对其倍性进行鉴定。

3、目前，用于构树染色体制片的材料来源主要是茎尖分生组织或种子萌发产生的根尖分生组织。其中采集茎尖生长点具有材料充足、取材方便等优点，但是茎尖分生组织受到不同非分生组织细胞、细胞贮藏物或细胞分泌物的影响较大，难以获得背景清晰的染色体制片。而利用种子萌发的根尖进行染色体制片获得背景清晰的染色体几率更高，且对染色体制片技术的要求较茎尖生长点低，但利用种子萌发的根尖进行染色体制片，很容易对植株的正常生长发育造成严重影响，可能造成珍贵的遗传材料或育种材料的丢失；此外，构树属于雌雄异株植物，雄株不产生种子，也无法利用种子萌发根对雄株进行染色体鉴定。综上所述，目前采用茎尖分生组织和种子萌发根尖作为构属植物染色体制片的材料都存在较大的缺点，亟需寻找一种既能获得大量根尖、又不影响构属植物正常发育的染色体制片方法。

技术实现思路

1、针对当前构属植物染色体制片时利用茎尖分生组织作为材料时存在的染色体制片背景污染严重、染色体分散不好、不清晰的问题，以及利用种子萌发根尖作为材料时存在的严重影响植株的正常生长发育，有可能导致珍贵材料丢失的问题，本发明目的在于提供一种诱导构属植物茎生根尖的方法。

2、本发明另一目的在于提供上述方法在构属植物染色体制片上的应用。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明提供一种诱导构属植物茎生根尖的方法，包括如下步骤：

5、(1)枝条环剥：在5～8月的任一晴天，于待鉴定的构属植物枝条的半木栓化处，用锋利刀片横向将韧皮部呈双环状切开，勿伤木质部，双环间距2～3cm，剥离掉完整的一圈韧皮后，刮净切口形成层；

6、(2)茎生根尖诱导：①在距离步骤(1)所述的切口上、下8～12cm枝条处涂抹薄荷油；②用棉签在步骤(1)所述的切口处均匀地涂抹复合生根剂；③用高压繁殖盒包裹切口并使切口位于高压繁殖盒几何中心；④用基质填满高压繁殖盒并用线绳缠绕固定；⑤用黑色塑料薄膜包裹高压繁殖盒；⑥最外层用铝箔纸包裹高压繁殖盒；⑦高压繁殖进行20～30天；

7、(3)根尖获取：在晴天上午的9:00～11:00，依次打开铝箔纸和黑色塑料薄膜，查看不定根生长情况；若见不定根生成，打开高压繁殖盒，立即用镊子于距离不定根尖端1～2cm处夹取根尖，将该根尖洗净后立即装入带有双蒸水的ep管中，获得构属植物的茎生根尖。

8、上述方法步骤(3)中，若仍需收集根尖，则按步骤(2)所述方法重新安装高压繁殖盒，每隔5～10天夹取根尖，直至取够根尖或压条不再长根。

9、上述方法步骤(1)中所述的构属植物是指构属(broussonetia)内的构树(broussonetia papyrifera)、小构树(broussonetia kazinoki)或藤钩(broussonetiakaempferi sieb.var.australis suzuki)等，以及它们之间的杂交种，或多倍体材料。

10、上述方法步骤(1)中所述的枝条是指叶片繁茂、韧皮部无缺损、直径0.8～2.0cm、无病虫危害的1～2年生健康枝条。

11、上述方法步骤(1)中所述的半木栓化处位于所选1～2年生枝条的下部。

12、上述方法步骤(2)中所述的复合生根剂的组成成分及其重量比为：芦荟凝胶100g、蜂蜜10g和萘乙酸(naa)0.2g。

13、所述复合生根剂的制备方法为：按照重量比为芦荟凝胶100g、蜂蜜10g和萘乙酸(naa)0.2g的比例将芦荟凝胶、蜂蜜和萘乙酸混合均匀即可。

14、上述方法步骤(2)中所述的基质可由市场上直接购买，如来自丹麦的品氏泥炭土(型号0-6，粒径0-6mm)等。其使用方法为：按照重量比为1.3～1.4:1的比例向品式泥炭土中加入水。

15、上述方法步骤(2)或(3)中所述的高压繁殖盒的材质为透明塑料；高压繁殖盒可由市场上购买，也可用透明的塑料瓶自制，如用透明的饮料瓶、矿泉水瓶自制等，用矿泉水瓶制作高压繁殖盒的方法可参照互联网(如：《高压繁殖方法详解-耕田网(qugt.com)》、《扦插月季、桂花、茶花，不易成活怎么办？一个矿泉水瓶就能解决(baidu.com)》)上公开的方法制作。

16、以农夫山泉矿泉水瓶为例，高压繁殖盒的具体制作方法可以为：沿着矿泉水瓶瓶口锥体与瓶体圆柱体交界线剪开，再用枝剪垂直于瓶底剪开瓶体，随后切口连着瓶底剪至瓶底中心处，并在瓶底中心处制作与切口处枝条直径大小一致的小孔。

17、上述方法步骤(3)中所述的根尖是指色白且根冠区直径大于1.0mm的幼嫩根尖。

18、上述方法在构属植物染色体制片上的应用。

19、上述方法在构属植物染色体鉴定上的应用。

20、本发明还提供了茎生根尖在构属植物染色体制片上的应用；其中所述的茎生根尖按照上述方法制备。

21、本发明还提供了茎生根尖在构属植物染色体鉴定上的应用；其中所述的茎生根尖按照上述方法制备。

22、本发明还提供了利用茎生根尖进行构属植物染色体制片的方法，包括如下步骤：

23、(1)根尖预处理：在4℃下，将上述方法所得的茎生根尖用预处理混合液处理5～6h；

24、(2)固定：在4℃下，将经预处理后的茎生根尖在3:1乙醇/冰醋酸中固定12～24h；

25、(3)保存：将固定后的茎生根尖依次通过95％、80％和70％乙醇梯度置换，每次置换停留20～30min，将固定液中的乙酸从根尖分生组织中置换掉，然后在-20℃下储存于70％乙醇中；

26、(4)酶解：用蒸馏水将存储的茎生根尖洗涤3次，然后用锋利刀片切掉茎生根尖分生组织前端的根冠区和后端的伸长区，将茎生根尖分生组织放入0.2ml pcr管中；在37℃下，按每个根尖加入混合酶液20μl的比例加入混合酶液，酶解2-3h；

27、(5)染色体制片：将酶解后的茎尖分生组织通过压片、涂片、滴片或蒸片(kirov等.molecular cytogenetics.2014.7.21.)等方法完成染色体制片；还包括后续通过荧光原位杂交或基因组原位杂交完成的染色体制片；

28、(6)镜检是指：在光学显微镜下，先用低倍镜(20×)寻找良好的中期染色体分裂相，然后用高倍油镜(100×)观察染色体；选择染色体分散良好、形态清晰的细胞进行摄像。

29、上述方法步骤(1)中所述的预处理混合液的组成成分及其体积比为：0.002mol/l8-羟基喹啉：0.1％秋水仙碱＝1：1。

30、所述的预处理混合液的制备方法：按照体积比为1：1的比例将0.002mol/l 8-羟基喹啉和0.1％秋水仙碱混合均匀即可。

31、上述方法步骤(4)中所述混合酶液的组成成分及其体积比为：6％(w/v)纤维素酶：1％(w/v)果胶裂解酶＝1：1。

32、上述方法步骤(4)中所述的混合酶液的制备方法，按照上述体积百分比将纤维素酶和果胶裂解酶混合均匀即可。

33、与现有的构树染色体制片方法相比，本发明具有的优点和有益效果为：(1)本发明方法一次性获得的根尖数量大，且可连续获取根尖，可满足大通量染色体研究的需求。(2)本发明方法制作的构属植物染色体制片背景清晰、染色体分裂相好，形态清晰，可清楚显示染色体的数目和特征，所得染色体鉴定结果准确、可靠性高。(3)本发明方法在枝条上取材后不影响植株的正常生长发育，可避免重要材料的丢失，对于珍贵的遗传材料和远缘杂交育种后代具有重要意义。(4)本发明方法简单，用较少的人力、物力，在较短的时间内获得大量可用于染色体制片的幼嫩根尖。(5)本发明方法从5-8月份的任何时间均可进行茎生根尖的诱导，对构属植物的细胞遗传学研究具有重要意义。(6)本发明方法中在切口的上、下部涂抹薄荷油，可防止蚂蚁于高压繁殖盒中筑巢或活动。(7)本发明方法中利用透明塑料制作高压繁殖盒，可随时观察生根情况。(8)本发明用黑色塑料薄膜包裹高压繁殖盒，可避免光线对根尖的影响。(9)本发明采用铝箔纸作为最外层包装，可起到反光隔热的作用，避免因高温影响高压繁殖盒内的根尖发育。