一种iPSC-NK细胞的冻存液及冻存、复苏方法与流程

本方案属于生物，具体为一种ipsc-nk细胞的冻存液及冻存、复苏方法。

背景技术：

1、在试验操作中，发现冻存液在细胞冻存过程中冻存的活率，且发现在配置且控制人血小板裂解物hpl、人ab血清后二者的比例，即二者协同作用能够提高冻存后细胞的数量与活率，并且在探究二者相互浓度配比时，发现人血小板裂解物hpl的浓度越高及人ab血清的浓度越低，冻存细胞的活率越高，细胞表面标志物表达并未降低。进而，在实验操作中一般的冻存后，我们在实验中都是直接将复苏液加入到冻存管中，这样会导致的缺陷就是还会有细胞残留在内腔壁上，影响细胞的存活率及细胞数量，因此研制在控制总量的情况下分步骤的加入复苏液从而能够解决上述问题。本方案针对冻存液及其冻存与复苏方式做了改进从而解决冻存前后的ink数量与活率及其表征的技术问题。

技术实现思路

1、本发明中研制出一种能够解决上述问题的技术方案，其具体方案如下：

2、一种ipsc-nk细胞的冻存液的冻存、复苏方法，包括以下组分：70-90％基础培养基、2.5-15％的二甲基亚砜dmso、1-20％的人血白蛋白hsa、1.0-10.0％人血小板裂解物hpl、1.0-9.0％人a b血清；以重量百分比计，包括2.0-5.0％的右旋糖酐-40、1.0-6.0％的葡萄糖、1.0-10.0％羟乙基淀粉；还包括10-100ug/ml抗坏血酸，50-200ug/ml人转铁蛋白。

3、进一步改进在于，按照体积百分比计，所述人血小板裂解物hpl为2.5-9.0％，所述人ab血清为1.0-8.0％。

4、进一步改进在于，所述人血小板裂解物hpl与人ab血清的总计体积百分比为10％。

5、进一步改进在于，所述基础培养基为x-vivo15、x-vivo10、stemspan、stempro-34、rim1640和imdm中的一种或两种以上的组合。

6、本发明还公开一种ipsc-nk细胞的冻存液的冻存、复苏方法，其特征在于，冻存时包括以下步骤：

7、收集分化成熟的ipsc-nk细胞，加入冻存液重悬细胞沉淀，通过使用2ml的移液管吹打细胞悬液，吹打3-5次，并转移至细胞冻存管中。进一步改进在于，复苏时包括以下步骤：

8、复苏时，细胞化冻后转移至复苏液中，离心弃上清，在控制复苏试剂液的总量的基础上，加复苏液重悬细胞，即分多次步骤冲洗冻存管，冲洗2-3次。

9、进一步改进在于，细胞冻存时，在冻存管中加入1ml冻存液重悬细胞沉淀，随后进行吹打3-5次。

10、按照上述方法在细胞冻存后均能保持93.84％以上的活率。

11、本发明相对于现有技术具有如下的优点在于：

12、其一.冻存液改进后，采用本发明研制的冻存液其ink细胞在冻存前后保持相对稳定的数量与较高细胞活率，说明符合ink细胞冻存后符合科研级使用要求。

13、其二.冻存方式改进后有益效果：相对于仅改进了细胞冻存液，在冻存方式改进后，其ink细胞冻存前数量与活率均高于仅改进冻存液在其冻存前的ink细胞。

14、其三.复苏方式改进后有益效果：ink细胞冻存后的细胞活率相对于冻存前的活率上升，说明本方案中的复苏方式能够提高细胞活率。

15、其四.冻存方式与复苏方式改进后有益效果：在本发明技术方案下ink细胞冻存后的数量与活率均高于仅改进冻存液在其冻存后的ink细胞，细胞存活率能达到99％，且不影响ink细胞的纯度及其肿瘤杀伤能力。

技术特征：

1.一种ipsc-nk细胞的冻存液，其特征在于，以体积百分比计，包括以下组分：70-90％基础培养基、2.5-15％的二甲基亚砜dmso、1-20％的人血白蛋白hsa、1.0-10.0%人血小板裂解物hpl、1.0-9.0％人 a b 血清；以重量百分比计，包括2.0-5.0％的右旋糖酐-40、1.0-6.0％的葡萄糖、1.0-10.0 %羟乙基淀粉；还包括10-100ug/ml抗坏血酸，50-200ug/ml人转铁蛋白。

2.如权利要求1所述的一种ipsc-nk细胞的冻存液，其特征在于，按照体积百分比计，所述人血小板裂解物hpl为2.5-9.0％，所述人 ab 血清为1.0-8.0％。

3.如权利要求1所述的一种ipsc-nk细胞的冻存液，其特征在于，所述人血小板裂解物hpl与人 ab 血清的总计体积百分比为10%。

4.如权利要求1所述的一种ipsc-nk细胞的冻存液，其特征在于，所述基础培养基为x-vivo15、x-vivo10、stemspan、stempro-34、rim1640和imdm中的一种或两种以上的组合。

5.一种ipsc-nk细胞的冻存液的冻存、复苏方法，其特征在于，冻存时包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的一种ipsc-nk细胞的冻存液的冻存、复苏方法，其特征在于，复苏时包括以下步骤：

7.如权利要求5所述的一种ipsc-nk细胞的冻存液的冻存、复苏方法，其特征在于，细胞冻存时，在冻存管中加入1ml 冻存液重悬细胞沉淀，随后进行吹打3-5次。

8.如权利要求7所述的一种ipsc-nk细胞的冻存液的冻存、复苏方法，其特征在于，按照上述方法在细胞冻存后均能保持93.84%以上的活率。

技术总结本发明公开一种iPSC‑NK细胞的冻存液的冻存、复苏方法，以体积百分比计，包括70‑90％基础培养基、2.5‑15％的二甲基亚砜DMSO、1‑20％的人血白蛋白HSA、1.0‑10.0%人血小板裂解物HPL、1.0‑9.0％人A B血清；以重量百分比计，包括2.0‑5.0％的右旋糖酐‑40、1.0‑6.0％的葡萄糖、1.0‑10.0%羟乙基淀粉；还包括10‑100ug/ml抗坏血酸，50‑200ug/ml人转铁蛋白。其有益效果在于，经过本方案改进后iNK细胞冻存后的数量与活率较高，尤其活率能够达到99%，并且检测了冻存前后iNK细胞表面表征与肿瘤杀伤效果并未受到冻存的影响。技术研发人员：葛文雪,王嘉显受保护的技术使用者：南京艾尔普再生医学科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/11