LRP1-β链短肽在治疗非酒精性脂肪肝中的应用

本发明涉及分子生物学和生物医药，具体涉及lrp1-β链短肽在治疗非酒精性脂肪肝中的应用。

背景技术：

1、非酒精性脂肪性肝病(nafld)是指除外长期大量饮酒和其他明确的损肝因素所引起的，以甘油三酯为主的脂质在肝细胞中过度蓄积和弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为病理特征的肝脏代谢性疾病。nafld的发病机制尚不明确，目前广为接受的“二次打击”学说认为，“一次打击”指由脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗引起肝细胞脂肪变性形成单纯性脂肪肝。“二次打击”是指肝脏大量蓄积脂肪后，发生氧化应激与脂质过氧化损伤而引起肝细胞炎症、肝纤维化甚至肝硬化和肝癌。此外，nafld显著增加2型糖尿病、高血压病和心脑血管疾病的发病风险。nafld已经成为当前临床最常见的肝脏疾病，严重威胁我国人民的生命健康。然而nafld的临床治疗尚缺乏有效的手段。nafld的病程长，反复发作，迁延难愈。目前认为干预生活方式如膳食控制和增加运动等可能有助于改善nafld，但其长期有效性和可行性尚有待评估。而药物性治疗主要包括调脂治疗、增强胰岛素敏感性、保护肝功能等，但其严格的适应症及长期用药引起的药物毒性往往限制了其长期使用。

2、腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)是微小病毒科家族的成员之一，是一类无法自主复制、无包膜的二十面体微小病毒。在非致病的野生型aav基础上进一步改造获得了重组腺相关病毒载体(raav)，具有安全性高、免疫原性低、宿主细胞范围广、扩散能力强、基因表达高效、体内表达时间长、血清型多样等特点。采用aav基因组与不同的衣壳蛋白结合产生混合型病毒载体，具有不同的组织感染嗜亲性，从而表现出一定的器官靶向特异性，其中aav8可靶向作用于肝脏。raav目前已被广泛应用于神经、代谢、基因治疗等研究领域，主要用于体内研究，被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。截止2022年4月，美国、欧盟、中国、日本已经批准超过16款基因和细胞治疗产品上市，其中luxtunra、zolgensma即为2款基于raav的基因治疗药物。在可预见的未来，随着raav载体和基因治疗的火热发展，越来越多基于aav的基因疗法将会进入临床试验并获得广泛应用。

3、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(lrp1)是属于低密度脂蛋白受体(ldl-r)家族的i型跨膜蛋白，广泛表达于全身各处组织和细胞。lrp1由一个515kda的α链和一个85kd的β链通过非共价键连接组成,α链主要与胞外配体相结合，β链则介导细胞内吞作用和胞内信号传导。lrp1介导血浆中乳糜微粒残体经肝脏清除，参与调节细胞胆固醇代谢及维持血管和血脑屏障的完整性等生理过程。

4、现有技术并没有将lrp1-β链应用于改善非酒精性脂肪肝的相关报道，而目前常用的nafld治疗药物或治疗措施存在适用局限性、疗效不佳及副作用，进一步研究nafld的发病机制并寻找新的药物治疗靶点对指导临床nafld的诊治、治疗及预后有重要意义。

技术实现思路

1、发明人构建了肝脏特异性过表达小鼠野生型lrp1-β链短肽的aav8-lrp1-β腺相关病毒，研究了肝脏过表达lrp1-β链短肽对高脂诱导nafld模型小鼠的血脂水平、血浆肝脏功能指标、肝脏组织形态结构、肝脏脂质含量及肝脏炎症因子表达水平的影响，证实了lrp1-β链短肽可以明显改善高脂饲养引起的小鼠脂代谢紊乱并显著地改善和逆转小鼠nafld的形成。基于此，本发明提供了如下技术方案：

2、lrp1-β链短肽或者lrp1-β链短肽促进剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

3、在上述的应用技术方案中，所述lrp1-β链短肽的氨基酸序列如seq id no.6所示。

4、在上述的应用技术方案中，所述lrp1-β链短肽促进剂为特异性过表达lrp1-β链短肽的病毒过表达载体。

5、在上述的应用技术方案中，所述lrp1-β链短肽促进剂为腺相关病毒(aav)载体。

6、在上述的应用技术方案中，所述腺相关病毒载体是靶向肝脏过表达lrp1-β链短肽的重组腺相关病毒，

7、优选所述aav载体是aav8，所述aav载体是重组aav(raav)载体。

8、在上述的应用技术方案中，所述重组腺相关病毒载体是将如seq id no.5所示的信号肽编码序列和如seq id no.6所示的lrp1-β链短肽的编码基因序列插入aav8病毒中得到。其中，信号肽起到在lrp1-β链短肽过表达的时候引导这个短肽定位到细胞膜上的作用。

9、优选地，所述重组腺相关病毒载体是将如seq id no.4所示的核苷酸序列插入aav8病毒中得到。

10、在上述的应用技术方案中，lrp1-β链短肽下调小鼠肝脏的甘油三酯水平进而改善小鼠整体水平的脂代谢及肝功能，抑制炎症因子表达，逆转nafld的肝脏形态结构改变并使其基本恢复正常。

11、本发明构建了靶向肝脏的raav8-lrp1-β链短肽腺相关病毒，研究了肝脏过表达lrp1-β链短肽对高脂诱导的nafld模型小鼠的影响，经实验证实了：

12、1.肝脏过表达lrp1-β链短肽纠正高脂饮食诱导nafld小鼠的脂代谢紊乱。

13、2.肝脏过表达lrp1-β链短肽降低高脂饮食诱导nafld小鼠肝脏重量/体重的比值。

14、3.肝脏过表达lrp1-β链短肽明显逆转高脂饮食诱导nafld小鼠肝脏组织弥漫性大泡样脂肪变性，恢复肝脏正常形态结构并显著减少肝脏脂质沉积。

15、4.肝脏过表达lrp1-β链短肽显著降低高脂饮食诱导nafld小鼠肝脏组织的甘油三酯以及游离脂肪酸含量。

16、5.肝脏过表达lrp1-β链短肽改善高脂饮食诱导nafld小鼠的肝功能。

17、6.肝脏过表达lrp1-β链短肽抑制高脂饮食诱导nafld小鼠肝脏炎症因子的表达。

18、本发明的有益效果是：

19、本发明首次发现肝脏过表达lrp1-β链短肽可用于治疗高脂饮食诱导的nafld，为nafld的治疗提供了新的靶点和治疗策略。本发明验证了lrp1-β链短肽改善高脂饮食诱导的nafld小鼠的脂质代谢及肝功能，改善小鼠肝脏组织脂质蓄积、抑制肝脏炎症因子表达并使其肝脏形态结构基本恢复正常，且不引起明显的不良反应或副作用。将lrp1-β链短肽应用在nafld治疗上，具有显著的优势：首先，lrp1-β链短肽来自于生物体自身蛋白，与生物体自身蛋白片段结构和免疫原性具有一致性，减少了生理排异反应和过敏反应出现的可能，具有很好的容受性；其次lrp1-β链短肽的肝脏过表达未见明显异常的副作用；第三，lrp1-β链短肽的肝脏过表达作用维持持久，效果良好。

20、本发明通过开发靶向肝脏过表达lrp1-β链短肽的腺相关病毒，并从nafld模型小鼠证实其对nafld具有明显的改善作用，据此可以利用分子生物学手段提高lrp1-β链短肽在肝脏细胞内的表达量，或通过基因工程制备lrp1-β链短肽再用于制备与人类nafld相关疾病的治疗药物。本发明研究对于推动临床nafld的防治进展、改善nafld患者预后及减轻社会卫生压力具有重要意义。