具有生长激素释放活性的多肽化合物的制作方法

专利名称：具有生长激素释放活性的多肽化合物的制作方法技术领域：本发明涉及到新的多肽化合物，给动物使用这种多肽化合物可以促进生长激素的释放。另一方面，本发明还涉及到通过给动物使用特定的释放生长激素多肽化合物而促进动物体内生长激素释放及使其水平升高的方法。如果给哺乳动物使用释放生长激素(GH)化合物而出现GH水平升高，假如达到足够高水平，便可以引起体重增加和奶产量增加。而且，已经知道通过使用已知的生长激素释放剂，如自然存在的生长激素释放激素，可以使哺乳动物体内生长激素水平升高。也可以通过使用生长激素释放肽使动物体内的生长激素水平升高，其中有些肽在以前已有叙述，如在美国专利U.S4，223，019，U.S.4，223，020，U.S.4，223，021，U.S.4，224，316，U.S.4，226，857，U.S.4，228，155，U.S.4，228，156，U.S.4，228，157，U.S.4，228，158，U.S.4，410，512，U.S.4，410，513，U.S.4，411，890和U.S.4，839，344中。也曾使用内源性生长激素释放抑制因子，即生长抑放素(SRIF)的抗体而使生长激素水平升高。在后例中，通过将这种内源性生长激素释放抑制因子在到达垂体(在此处它抑制GH释放)之前去除而使生长激素水平升高。所有这些促进生长激素水平升高的方法都涉及到合成和/或分离这种用于目的动物的足够高纯度物质，其价格十分昂贵。因此希望能有短链的，相对简单的多肽能够促进生长激素的释放，因为这种多肽制备容易且不昂贵，化学和/或物理改性容易，而且也易于纯化和配制;并且还具有良好的运输特性。人们一直希望能有短链的多肽可以促进动物血中生长激素的释放及使其水平升高，能够运用这些多肽促进动物血中生长激素的释放及其水平升高是非常有用的。我们现在已经发现几种新的多肽化合物可以促进动物体内生长激素的释放。这些多肽具有通式A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z，其中A1是组氨酸，3(NMe)组氨酸，A0-组氨酸，A0-3(NMe)组氨酸，丙氨酸，酪氨酸，或组氨酸-丙氨酸，其中A0是任何自然存在的L-氨基酸，蛋氨酸(O)，多巴(DOPA)，α-氨基丁酸或通式L-A0的多肽，其中L是H，多巴(DOPA)，赖氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，Tyr-DAla-Phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-Phe，Tyr-Ala-Gly-Thr或者Tyr-DAla-Phe-Sar，优选A0是任何自然存在的氨基酸，更为优选的是，A0是丙氨酸，赖氨酸，或谷氨酸;A2是DβNal或D(右旋)苯丙氨酸;A3是丙氨酸，甘氨酸，或丝氨酸;A5是D苯丙氨酸，D/Lβ(Me)苯丙氨酸或(NMe)D苯丙氨酸;A6是B-G或G，其中B是任何自然存在的氨基酸，任何自然存在的氨基酸的二肽或H2N-(CH2)n-CO2H(其中n＝2-12)而G是精氨酸，异赖氨酸(iLys)，或鸟氨酸;Z是C末端基团-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1(其中R1是H，具有1到大约6个碳原子的烷基，具有3到大约8个碳原子的环烷基，具有2到大约8个碳原子的链烯基或具有6到大约12个碳原子的芳基，而R2定义如R1，并且可以相同或者不同)，-Gly-Z′，-Met-Z′，Lys-Z′，-Cys-Z′，-Gly-Tyr-Z′，或-Ala-Tyr-Z′，其中Z′是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1(其中R1和R2定义如上)，及其药剂学上可接受的有机或无机盐。最好这种肽具有通式His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2，A0-His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2(例如Ala-His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2)或Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。更为优选A2是DβNal。通过给以有效量的肽，可以运用这种肽促进动物，最好是人，体内血中生长激素水平的释放和升高。本发明的依据是发现了几种短链多肽可以促进动物血中生长激素的释放及其水平升高。属于本发明范围的多肽由下面的通式定义A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z，其中A1，A2，A3，A5，A6和Z定义如下。A1是组氨酸，3(NMe)组氨酸(也就是，其中的咪唑环在3位上被甲基化)，组氨酸-丙氨酸，A0-组氨酸，丙氨酸，酪氨酸，或A0-3(NMe)组氨酸，其中A0是任何自然存在的L-氨基酸，蛋氨酸(O)，多巴(DOPA)，α-氨基丁酸或分子式L-A0的肽，其中L是H，多巴(DOPA)，赖氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，Tyr-DAla-Phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-Phe，Tyr-Ala-Gly-Thr和Tyr-DAla-Phe-Sar。A1优选是组氨酸，丙氨酸，组氨酸-丙氨酸，A0-组氨酸，或丙氨酸。更为优选的是A1为组氨酸或A0-组氨酸。A0优选任何自然存在的L-氨基酸，A0更为优选是丙氨酸，赖氨酸，或谷氨酸，再进一步优选Ao是丙氨酸。A2是DβNal或右旋苯丙氨酸。A2最好是DβNal。A3是丙氨酸，甘氨酸或丝氨酸。A3优选丙氨酸。A5是D-苯丙氨酸、D/Lβ(Me)苯丙氨酸或(NMe)D苯丙氨酸。A5优选D苯丙氨酸。A6是B-G或G，其中B是任何自然存在的L-氨基酸，任何自然存在的L-氨基酸的二肽(如Ala-Lys，Ala-Ala，Ala-Leu)或H2N(CH2)nCO2H，其中n＝2-12，而G是精氨酸，异赖氨酸(iLys)，赖氨酸，或鸟氨酸。优选B是任何自然存在的L-氨基酸或H2N(CH2)nCO2H，其中n＝4-8，更为优选，A6是G，Ala-Lys，或Ala-Ala-Lys。甚至再进一步优选A6是G。最优选A6是赖氨酸。Z代表多肽的C末端基团或C末端氨基酸加上末端基团，其中Z是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1，其中R1是H，具有1到大约6个碳原子的烷基，具有3到大约8个碳原子的环烷基，具有2到大约8个碳原子的链烯基，或具有6到大约12个碳原子的芳基。R2定义如R1，二者可以相同或不同。R1优选是H或具有1到大约6个碳原子的烷基。Z也可以是-Gly-Z′，-Met-Z′，-Lys-Z′，-Cys-Z′，-Gly-Tyr-Z′，或-Ala-Tyr-Z′，其中Z′是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1，其中R1和R2定义同上。Z优选是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1。和任何所说多肽的药剂学上可接受的有机或无机加成盐。所用氨基酸缩写与标准肽命名法一致Gly＝甘氨酸Tyr＝L-酪氨酸Ile＝L-异亮氨酸Glu＝L-谷氨酸Thr＝L-苏氨酸Phe＝L-苯丙氨酸Ala＝L-丙氨酸Lys＝L-赖氨酸Asp＝L-天冬氨酸Cys＝L-半胱氨酸Arg＝L-精氨酸Gln＝L-谷氨酰胺Pro＝L-脯氨酸Leu＝L-亮氨酸Met＝L-蛋氨酸Ser＝L-丝氨酸Asn＝L-天冬酰胺His＝L-组氨酸Trp＝L-色氨酸val＝L-缬氨酸DOPA＝3，4-二羟基苯丙氨酸Met(O)＝蛋氨酸亚砜Abu＝α-氨基丁酸iLys＝Nε-异丙基-L-赖氨酸4-Abu＝4-氨基丁酸Orn＝L-鸟氨酸DαNal＝α-萘基-D-丙氨酸DβNal＝β-萘基-D-丙氨酸Sar＝肌氨酸所有三字母氨基酸缩写前面带“D”则表示该氨基酸的D-构型，而前面有“D/L”的缩写则表示所说氨基酸的D-和L-构型的混合物。在本说明书中，甘氨酸被认为是属于术语“自然存在的L-氨基酸”范围之内。可用于氨基酸A1，A3，A5和A6的碱性，中性或酸性氨基酸残基可以使人们在很大程度上控制所需肽的生理化学特性，这种灵活性对配制所需肽并将其用于任何所给种类动物中具有重要优越性。通过选择R和Z基团还可以得到其他的可变性，从而对所需化合物的生理化学特性进一步地控制。实施本发明的优选生长激素释放化合物是A1-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，如A0-His-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，His-Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z和His-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z和它们的有机或无机加成盐。A2优选是DβNal，进一步优选是A0-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2(尤其是，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2)，和His-DβNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2，和任何所说多肽的有机或无机加成盐。这些化合物一般易于合成，具有促进血清生长激素水平增加的效应，并且能满足商业化水平的生产和利用。另外，由于可通过在这些多肽化合物的多个位点进行取代，选择这些多肽化合物N-末端、C-末端和中心位点的极性，中性或非极性特性使之与所需传递方法相适应，从而带来多变性，使这些化合物具有将其有效地传递给各种动物种类所需要的生理化学特性。这些肽比大部分在A2位点带有不同氨基酸残基的等同肽在促进血清生长激素水平升高方面典型地表现出较高水平的促进能力。由于高水平的促进效能，一般DβNal肽是最优选的肽。目前最优选的是His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2和A0-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2肽(如Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2)，A0-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2肽如Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2和它们的有机或无机加成盐。这些化合物表现出了高水平的促进血清生长激素水平增加的能力。本发明的化合物可以用来升高动物血中生长激素的水平，增加牛奶产量，增加动物体重如哺乳动物(如，人，羊，牛和猪)，以及鱼，家禽，其他脊椎动物和甲壳纲动物;并且增加哺乳动物的毛和/或皮毛的产量。体重增加量取决于动物品种的性别和年龄，生长激素释放化合物的给药量和特性，给药途径，等。本发明的新型多肽化合物可以按照普通的液固相肽化学方法，或者通过本技术领域中已知的经典方法进行合成。固相合成是从肽的C-末端开始。例如，可以通过将所需的保护的α-氨基酸连接到氯甲基化树脂，羟甲基树脂，二苯甲基胺(BHA)树脂，或对-甲基-二苯甲基胺(P-Me-BHA)树脂上制备一种合适的起始物质。其中一种氯甲基树脂由Bio Rad Laboratories，Richmond，California以商品名BIOBEADS SX-1出售。Bodansky等人，在Chem，Ind.(Lon-don)38，1597(1966)对羟甲基树脂的制备进行了描述。Pietta和Marshall，在Chem.Comm，650(1970)曾对BHA树脂进行过描述，并且可以从Peninsula Laboratories，Inc.，Belmont，California购买到这种树脂。起始连接之后，可以在室温下选择酸性试剂，包括溶于有机溶剂中的三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl)溶液去除掉α-氨基保护基团。去掉α-氨基保护基团之后，则可以按照所需顺序分段使剩余的保护氨基酸偶联。一般用，例如，二氯甲烷(CH2Cl2)或二甲基甲酰胺(DMF)和其混合物中的一种合适的羧基活化剂如二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)溶液在大约3倍过量的条件下可以使每一种保护的氨基酸发生反应。在完成所需要的氨基酸顺序之后，用一种试剂如氟化氢(HF)处理可以将所需肽从树脂上切下，它不仅从树脂上切下肽，而且还可以切下最普遍使用的侧链保护基因。如果使用氯甲基树脂或羟甲基树脂，HF处理可以形成游离肽酸。如果使用BHA或P-Me-BHA，HF处理可以直接产生游离的肽酰胺。上述的固相方法在本技术领域中是公知的，并且Stewart和Young曾对此进行过描述，见Solid Phase Peptide Synthesis;Second Edn.(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL 1984)。Bodansky等人曾提供了可用来合成本发明肽基团的某些溶液法，见Peptide Synthesis，2nd Edition，John Wiley.&Sons，New York，N.Y.1976。公认肽的合成最好采用溶液方法，它涉及到至少两个肽片段的缩合反应。这种方法包括使一种肽片段X-A1-y与肽片段U-V-W进行缩合，其中除A1外所有氨基酸侧链是中性或被保护的，而X是Prot，或Prot-A0，这里Prot，是一个N-末端保护基团;y是A2-Q，Ala-A2-Q，A2-A3-Q，Ala-A2-A3-Q，A2-A3-A4-Q，Ala-A2-A3-A4-Q，Ala-Q或-Q，其中当y是Q时，U是J-A2-A3-A4，或J-Ala-A2-A3-A4，如果y是Ala-Q，U是J-A2-A3-A4，如果y是A2-O或Ala-A2-Q，U是J-A3-A4，当y是A2-A3-Q或Ala-A2-A3-Q时，U是J-A4。当y是A2-A3-A4-Q或Ala-A2-A3-A4-Q时，U是J，V是A5或Z，如果V是A5，W是A6-Z或Z，当V是Z时，W则不存在。A1，A5，A6和Z如本文定义。在目前情况下A2是DβNal或DPhe而A4是Trp。Q是肽片段的羧基端，是-OR3或-M，这里M是一种能够被含氮亲核物质取代的基团，而R3是H，含有1到大约10个碳原子的烷基，6到约12个碳原子的芳基，具有7到大约12个碳原子的芳烷基;J代表所指片段的胺末端，是H或一种保护基团，这种基团不影响偶联反应，例如苯甲基。然后，可以去掉该保护基团。也可以使用该保护肽进一步缩合制备一种较大的肽。这种优选方法更为详细的叙述见由John C.Hubbs和S.W.Parker于1990年7月24日申请的题为“合成肽的方法”的美国专利申请号-，该申请列入本发明作为参考。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种促进动物血中生长激素释放和水平升高的方法。所说的方法包括给动物使用一定有效量的至少一种上述多肽。本发明化合物可以通过口服、非肠道(肌肉(i.m.)、腹膜内(i.p.)、静脉(i.v.)或皮下(s.c.)注射)、鼻腔、阴道、直肠或舌下途径给药，并且可以配制成适合于各种给药途径的剂型。优选非肠道给药。用于口服的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性载体如蔗糖、乳糖、或淀粉混合。正如一般实际应用中这些剂型也可以包括除惰性稀释剂外的其他物质，例如，润滑剂如硬脂酸镁。在胶囊，片剂和丸剂中，该剂型也可以包括缓冲剂。片剂和丸剂还可以制备成肠衣片。用于口服的液体剂型包括乳剂，溶液，悬浮液，糖浆，含有本领域中常用的惰性稀释剂(如水)的酏剂。除了这些惰性稀释剂外，该组合物中还可以包括佐剂，如湿润剂，乳化剂，和悬浮剂，以及甜味剂，调味剂和香料。用于本发明非肠道给药的配制品包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液，或乳剂。非水性溶剂或载体的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，如椰榄油和玉米油，明胶和可注射的有机酯如油酸乙酯。这种剂型也可以含有佐剂如防腐剂，湿润剂，乳化剂，和分散剂。这些剂型的灭菌可以通过，例如，细菌非透过滤纸过滤，向组合物中加入消毒剂，对组合物进行辐射照射，或加热该组合物等方式进行。也可以用一种无菌水介质或其他可注射的无菌介质在使用之前临时配制。本发明的新型化合物也可以和生长激素释放激素(即自然存在的生长激素释放激素，及其类似物和功能等同物)以其他可促进释放生长激素的化合物，如释放生长激素肽结合使用(见美国专利No.4，880，778引入本发明作为参考)。这种联合用药代表了一种特别优选的本发明释放生长激素肽的给药方式，因为这种联合用药比各个成份单独用药产生效应的总和比预期引起的生长激素的释放增加更为强烈。也就是说，联合用药可以带来各个单独成份药效的协同作用。上面所引用的专利对于释放生长激素肽的联合给药进行了更为详细的描述。这些协同作用的化合物优选那些作为生长激素释放激素受体的激活剂或抑制生长激素释放抑制因子之效应的化合物。这种协同作用可以是二元的，即本发明化合物和协同作用的化合物的一种，或者包括不只一种协同作用的化合物。本发明多肽或多肽联合给药的量因多方面因素而有所不同，例如，可取决于所用药的特定动物，其年龄和性别，所要达到的治疗效果，给药途径，以及使用的是哪种多肽或多肽配制品。在所有情况下，都要使用达到促进受体动物血中生长激素释放和水平升高的有效剂量。一般情况下，这种剂量水平为每公斤体重大约0.1μg至10mg总肽量的范围之内。熟练的技术人员根据本发明公开书明书凭经验可以容易地确定优选剂量。例如，在人体中如果静脉给药，优选的剂量水平在每公斤体重大约0.1μg至10μg总肽量范围内，更为优选是每公斤体重大约0.5μg至5μg的总肽量，再进一步优选是每公斤体重大约0.7μg至3.0μg。如果使用生长激素释放肽的联合给药，则可以给以较低量的本发明多肽。例如，将本发明的肽与美国专利No.4，880，778中第1组中的协同作用化合物如GHRH联合使用时，优选给药范围是本发明化合物(如Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，或His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z)每公斤体重给药大约0.1μg至大约5μg和大约0.5μg至大约15.0μg的协同化合物(如GHRH)，更为优选是每公斤体重给以大约0.1μg至大约3μg的本发明化合物和大约1.0μg至大约3.0μg的协同化合物。如果口服给药，一般需要较大的剂量。例如，人口服约药，剂量水平一般是每公斤体重大约30μg至大约600μg的多肽，优选为每公斤体重大约70μg至大约500μg的多肽，更为优选是每公斤体重大约100μg至大约350μg的总多肽，甚至再进一步优选是，每公斤体重大约200μg至大约300μg的总多肽。牛的给药剂量与人相同，而鼠一般需要较多的剂量水平。根据本发明公开说明书凭经验可以容易地确定精确给药水平。一般情况下，如前所述，释放生长激素肽联合约药时，由于其协同效应，达到同样效果所用各释放生长激素化合物的剂量，比其单独用药所需的剂量要小。本发明还包括以上述多肽的有机和无机加成盐和其结合物为活性成份的组合物;也可以任意与载体、稀释剂、缓慢释放基质，或包衣联合使用。被认为属于本发明范围之内的生长激素释放化合物及其结合物的有机无机加成盐包括如下有机盐，如乙酸盐，三氟乙酸盐，草酸盐，戊酸盐，油酸盐，十二酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，甲苯磺酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，反丁烯二酸盐，丁二酸盐，酒石酸盐，萘甲酸盐(naphthalate)等;和无机部分如周期表第一族(即碱金属盐)，第二族(即碱土金属盐)、铵和鱼精蛋白盐，锌、铁等的氯化物、溴化物、硫酸盐、磷酸盐等，以及上述的有机盐。如果给人体用药则优选医药上可接受的盐。这些盐包括制药工业中常用的非毒性碱金属，碱土金属和铵盐，这包括通过本技术领域中熟知的方法制备的钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵和鱼精蛋白盐。该术语也包括通常将本发明的化合物与合适的有机或无机酸反应而产生的非毒性酸加成盐。有代表性的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、十二酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、反丁烯二酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)等。下面的非限制性实施例将对本发明作进一步的说明。实施例1释放生长激素肽的合成将盐酸对甲基二苯甲基胺(PMe-BHA·HCl)树脂装入市面上可买到的自动肽合成仪的反应容器中。以每克5m moles的负载量用游离胺取代树脂。运用合适的活化剂，如N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)从肽顺序的羧基末端开始，将单个的氨基酸偶连在一起来制备该化合物。各个单一氨基酸的α氨基要进行保护，例如，表1中所述如对t-丁基氧代羰基衍生物(t-BOC)和反应性侧链官能团进行保护。表1适用于固相肽合成的侧链保护基团精氨酸 Ng-甲苯磺酰基天冬氨酸 O-苄基半胱氨酸 S-对-甲基苄基谷氨酸 O-苄基组氨酸 Nfm-甲苯磺酰基赖氨酸 Nε-2，4-二氯苄基氧代羰基蛋氨酸 S-亚砜基丝氨酸 O-苄基苏氨酸 O-苄基色氨酸 Nln-甲酰基酪氨酸 O-2，6-二氯苄基在加入起始氨基酸之前，加入二氯甲烷(CH2Cl2大约10ml/gm树脂)搅动树脂三次(每次约一分钟)，再用含有N，N-二异丙基乙胺(DIEA)的二氯甲烷(10∶90);大约10ml/gm树脂)三次搅拌(大约每次2分钟)进行中和，并加二氯甲烷(大约10ml/gm树脂)搅动三次(每次大约1分钟)。运用一种预制的对称酐，用含有大约3倍于结合能力总量的适合于保护氨基酸的树脂和大约1.5倍于结合能力总量的DCC树脂的适量二氯甲烷，将起始和随后每一个氨基酸偶连到树脂上。对于在二氯甲烷中的溶解度较低的氨基酸来说，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)可形成均相溶液。一般情况下，要在加入反应器中之前30分钟于室温或更低温度下制备好对称性酐。通过重力过滤使溶液入反应器将在对称酐制备过程中形成的二环己基脲去除。一般用试剂如水合茚三酮(它可与伯胺和肿胺反应)通过显色试验来检测氨基酸于树脂上偶连的程度。在被保护氨基酸完全连接到树脂上(＞99%)后，通过用酸性试剂(一种或多种)处理去掉α氨基保护基团。常用试剂由一种三氟乙酸(TPA)和含有苯甲醚的二氯甲烷(45∶2∶53)溶液组成。将每个氨基酸连接到树脂上的全过程如表2所述。表2单个氨基酸向树脂上的结合步骤试剂搅动次数 搅动时间1.二氯甲烷 3 1分钟2.三氟乙酸、苯甲醚、二氯甲烷1 2分钟(45253)3.三氟乙酸、苯甲醚、二氯甲烷1 20分钟(45253)4.二氯甲烷3 1分钟5.二异丙基乙胺、二氯甲烷 3 2分钟(1090)6.二氯甲烷3 1分钟7.预制对称酐(preformed symmetrical anhydride)1 15－120分钟＊8.二氯甲烷3 1分钟9.异丙醇 3 1分钟10.二氯甲烷 3 1分钟11.检测偶连反应程度＊＊12.对于每一个氨基酸重复步骤1－12＊偶连时间取决于各个氨基酸＊＊一般可通过显色试验检测偶连水平。如果连接不完全，可以重复7-11的步骤再偶连相同的氨基酸。如果偶连完全，则可以偶连下一个氨基酸。使用这种肽合成方法，可以得到新的树脂结合多肽如A1-DβNal-A3-Trp-A5-A6- 和A1-DPhe-A3-Trp-A5-A6- (其中A1，A3，A5和A6定义同上，而 是一种聚合树脂，并且如果需要，可用合适的保护基团对组成氨基酸之官能团进行保护)。已经制备的特定顺序(以合适的保护形式存在)包括His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，His-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，His-DαNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，His-DAsp-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，His-DCys(SMe)-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- ，His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- ，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- ，Try-DArg-Phe-Gly-R，Ala-His-Dphe-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，Ala-His-DHis-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，和Ala-His-DPro-Ala-Trp-DPhe-Lys- .实施例2鼠体内GH释放未成熟雌性Sprague-Dawley鼠来源于Charles River实验室(Wilmington，MA)。取来鼠后将其在20℃下，以14∶10小时的光暗循环条件进行室内喂养。水和Purina鼠食可以任意喂给。幼鼠要和母亲一起长至21天。将26天龄的鼠分为每个治疗组6只，在静脉注射肽之前20分钟以50mg/Kg的戊巴比妥腹膜内给药进行麻醉。以含有0.1%明胶的普通盐水作为静脉注射这种肽的载体。以表3，4和5中所示的用量给体重为55-65克，且已经麻醉的鼠静脉注射释放生长激素化合物。每次向颈静脉内注射0.2ml的溶液。在最后的试验注射之后10分钟用铡刀将所有的动物杀死(见表3和4)。断头之后收集动脉血以测定血中GH水平。血液凝集之后，离心分离血清。将血清冷冻保存至进行放射免疫(RIA)测试那天，以确定其生长激素水平，按照由国家关节炎、糖尿病、消化和肾病研究所(NIADDK)建立的下列程序进行。一般以下列顺序在冰箱温度(大约4℃)下逐一向RIA分析试管中加入试剂(a)缓冲液，(b)“冷”(也即非放射活性)标准液或所要分析的未知血清样本，(c)放射碘化的生长激素抗原，和(d)生长激素抗血清。一般情况下试剂的加入要达到最终RIA试管稀释浓度为大约1∶30，000(抗血清比总液体量;体积∶体积)。在向混合液中加入第二种可以与生长激素抗血清结合并引起生长激素抗血清复合物沉淀的抗体(如，山羊或兔抗-猴，γ球蛋白血清)之前，一般要将该混合试剂在室温下保温(大约25℃)大约24小时。然后在γ闪烁计数器上分析特定时间内RIA试管内沉淀物的计数。用放射活性计数与生长激素(GH)水平为坐标绘制标准曲线。通过查阅标准曲线则可以确定未知的GH含量。用由国家激素与垂体研究项目(National Hormone and Pituitary Program)提供的试剂通过RIA测定血清GH。表3，4，5，和6中的血清水平以ng/ml为单位记录，相当于0.61鼠GH标准国际单位/mg(IU/mg)。数据为平均值+/-平均值标准误差(SEM)。用Student′s t-试验进行统计学分析。NS是指差没有统计学显著意义。表3，4，5和6中所示结果都是6只鼠的研究结果平均值。表3释放生长激素化合物在戊巴比妥麻醉鼠体内对GH释放(ng/ml)的促进作用(最后注射之后10分钟处死动物)A栏 总剂量对照组 由A栏中化合物释放释放生长激素化合物(μg)GH ng/ml的GH ng/ml+SEMP值His-DTrp-Ala-Trp- .1151±16246±39 -DPhe-Lys-NH2.3 151±16 670±75 -1.0151±16 1000±276 -3.0151±16 2106±216 -His-DβNal-Ala- .1 151±16 938±255 ＜.02Trp-DPhe-Lys-NH2.3 151±16 1716±258 ＜.021.0151±16 3728±691 ＜.013.0151±16 3238±237 ＜.01His-DTrp-Ala-Trp- .1138±12226±31-Dphe-Lys-NH2.3 138±12 613±73 -1.0138±12 1581±228 -3.0138±12 2875±393 -Ala-His-DTrp-Ala-.1138±12254±78 NS -Trp-DPhe-Lys-NH2.3 138±12 809±59 NS -1.0 138±12 1516±215 NS -3.0 138±12 3095±473 NS -Ala-His-DβNal- .1 138±12 1128±309 ＜.02＜.02Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2.3 138±12 2479±389 ＜.001＜.0011.0 138±12 3899±514 .001 .0013.0 138±12 4202±369 ＜.05 NSAla-His-DTrp-Ala-Trp- 0.1 111±25 360±35 -DPhe-Lys-NH20.3 111±25 903±217 -1.0 111±25 2957±427 -3.0 111±25 3956±485 -Ala-His-DβNal- 0.1 111±25 970±169 ＜.01Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.3 111±25 2898±248 ＜.0011.0 111±25 3908±327NS表4释放生长激素化合物在戊巴比妥麻醉鼠体内对GH释放(ng/ml)的促进作用(最后注射10分钟处死动物)A栏 由A栏的化释放生长激素化合物 对照组 总剂量 合物释放的GHGH ng/mL (μg) ng/mlAlaHisDTrpAlaTrpDpheLysNH2111±25 .3 901±21AlaHisDPheAlaTrpDPheLysNH2181±69 .3 616±74AlaHisDHisAlaTrpDPheLysNH2117±19 .3 268±54AlaHisDProAlaTrpDPheLysNH2117±19 .3 262±51表5肽 总剂量 对照组 释放的GH(μg) GH ng/ml ng/mlHis-DAsp-Ala-Trp- 1.0 150±20 154±63DPhe-Lys-NH23.0 150±20 155±3410.0 150±20 163±4430.0 150±20 224±62100.0 150±20 178±83His-DCys(SMe)-Ala- .3 181±69 178±28Trp-DPhe-Lys-NH21.0 181±69 193±283.0 181±69 180±34His-DαNal-Ala- .1 151±16 280±70Trp-DPhe-Lys-NH2.3 151±16 439±1221.0 151±16 1130±1793.0 151±16 2319±139His-DTrp-Ala-Trp- .1 181±69 512±43Dphe-Lys-NH2.3 181±69 566±1141.0 181±69 1531±3033.0 181±69 2349±267His-DTrp-Ala-Trp- .1 220±29 420±105DPhe-Ala-Lys-NH2.3 220±29 900±1631.0 220±29 1965±3663.0 220±29 4553±670His-DβNal-Ala- .1 111±25 484±89Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2.3 107±16 971±2411.0 107±16 1593±3593.0 107±16 3337±583His-Ala-DTrp-Ala-Trp- .1 111±25 -DPhe-Lys-NH2.3 151±16 261±321.0 151±16 830±1033.0 151±16 2588±341表3，4，5，和6表明本发明的化合物对给以这种化合物的鼠血中生长激素的释放及水平升高有促进作用。本发明的肽表现出可在A2位点被取代的等同化合物(如，用DAsp，Dcys(Sme)，DHis，和DPro取代)所不能表现的活性。这些表格也说明，His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2比在A2位点带有DTrp，DαNal，DAsp和DCys(Sme)的化合物活性更强。同样，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2比等同DTrp化合物活性更强。实施例3释放生长激素化合物的联合用药重复实施例2的方法，不同之处是不对鼠进行麻醉，也不用戊巴比妥对鼠进行予处理，并且用多种肽给鼠联合用药。所给化合物，剂量以及结果如表6所示。表6释放生长激素化合物在戊巴比妥麻醉的鼠体内对GH释放的促进作用(在最后注射之后10分钟处死动物)A栏释放GH 总剂量 对照血清 GH被释放肽 (μg) GH ng/ml 的血清GH ng/ml±SEM(N＝6)+SEM(N＝6)Als-His-DβNal- 0.1 337±51 610±90DPhe-Lys-NH20.3 337±51 1140±1871.0 337±51 2909±2573.0 337±51 3686±436Ala-DβNal-Ala- 0.3 167±46 363±73Trp-DPhe-Lys-NH21.0 167±46 1450±2943.0 167±46 2072±20810.0 167±46 2698±369Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.3 160±51 1418±3021.0 160±51 2201±269Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.3 228±23 1746±3181.0 228±23 2610±176Ala-HIs-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.1 160±36 822±2430.3 160±36 1549±2921.0 160±36 2180±284表7本发明化合物与第1类和/或第3类化合物在未麻醉鼠体内的协同作用所使用的化合物 剂量(μg) 释放的GH(ng/mL)±SEM对照 - - - 12±3175-1a- - 1 58±13175-1 - - 3 240±32Cb- - 10 204±50GHRHc- - 3 131±50TPd- - 10 79±29175-1 GHRH - 1+3 2014±224175-1 TP - 1+10 987±204175-1 GHRH TP 1+3+10 4150±555175-1 GHRH - 3+3 1994±249175-1 TP - 3+10 2149±451175-1 GHRH TP 3+3+10 2922±384C GHRH - 10+3 2525±453C TP - 10+10 1597±387C GHRH TP 10+3+10 4344±374＊第1类和第3类化合物在美国专利No.4，880，778中进行了详细描述。a-175-1＝His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2，(本发明的化合物)b-C＝His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2(对比化合物)c-GHRH＝Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2(第1类化合物)d-TP＝Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2(第3类化合物)表7表明本发明化合物如果与例举的第1类和/或第3类化合物一起使用时可以产生协同作用。表7中的结果还表明本发明化合物与以往曾表现有协同反应的对比化合物(C)一起可以产生更大的协同作用。实施例4肽片段形成肽的缩合反应一般方法用Thomas Hoover毛细管熔点仪测定熔点。在Perkin-Elmer Model137或Nicolet Model 5 DX分光光度计上记录红外(IR)光谱，并记下波数(cm-1)。使用VG Analytical Ltd，Model ZAB-1F质谱仪以EI(电冲击)、FD(场吸收)或FAB(快速原子轰击)方式获得质谱(MS)。使用配备有一个30mDB5毛细柱(J & W Scientific)的Finnigan 4023 GCMS用氦载体气体获得GCMS。用Rudolph Research生产的Autopol Ⅲ偏振计测量旋光度。在J.EOL GX-400 NMR仪器上以400MHz操作或用JEOL-270NMR仪器以270MHz操作可以获得1HNMR光谱。这些仪器能够进行小于0.7Hz的常规数字分辨。相对于内标物3-(三甲硅烷基)-四氚丙酸钠(TSP)的化学位移以百万分率表示。使用由L-5000梯度控制器和连接到Vydac 201TP1010或218TP1010半制备柱子上的655A泵组成的Hitachi系统可以进行高效液相色谱分析(HPLC)。可以使用含有0.2%三氟乙酸和甲醇的混合水溶液作为洗脱剂。一般情况下，用以大约每分钟1-2%的速度增加有机成份的梯度以每分钟6ml的流速可以洗脱出有用的化合物，然后用LKB2140二极管阵U.V.检测仪在合适的波长下检测这些化合物。然后用Nelson分析软件(Version3.6)完成积分计算。未特别指出时，则在一种惰性气体氮或氩存在下进行反应。无水四氢呋喃(THF，U.V.级)和二甲基甲酰胺(DMF)从Burdick and Jackson购买到，并可从瓶中直接使用。A.制备三肽片段-2HN-Trp-DPhe-Lys(Boc)-NH2Nα-苄氧基羰基-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酸酰胺.4.向10℃的羰基二咪唑(CD1，2，88，24g，0.544mol)和无水四氢呋喃(THF，1500ml)溶液中缓慢加入Nα-苄氧基羰基-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酸(I，180g，0.474mol)，在加入过程中放出气体。在Nε-苄氧基羰基-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酰咪唑(Lysine imidazolide)(中间体3)形成同时，制备氨和THF(2000ml)的饱和溶液(无水，NH3气于5-10℃下通过THF)。当判断已完全形成了中间体3时(放气停止时，大约2小时)，向氨溶液中加入含有3的THF溶液的一半，30分钟之后再加入含有3的剩余溶液。在加入过程中保持连续通入氨气，并且之后还要再通入45分钟。在加入两次含有3的溶液时，形成白色沉淀。将反应液回升到室温并搅拌15小时。在真空中去除浆液中的溶剂。把剩余物再于水中形成浆液，通过真空过滤收集所产生的固体物。Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸-酰胺，5.在氩气存在下向5%Pd/c(5g)甲醇催化剂浆液(250ml)中加入赖氨酸酰胺4(181.48g，0.479mol)甲醇(1000ml)溶液。使氢气通入反应混合液中冒泡(约15分钟)，然后在氢气存在下搅拌反应液直至HPLC分析表明反应已完成(36小时)。用氩取代氢气。反应液通过Celite 垫澄清，并在真空中去除溶剂得到固体物。Nα-苄氧基羰基-D-苯丙氨酰基-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酸-酰胺.8将Nα-苄氧基羰基-D-苯丙氨酸(6，126，39g，0.423mol)缓慢加入到10℃的CDI(2，66.03g，0.409mol)的THF溶液中(500ml)。在加入过程中可以发现放出气体，当停止放气时，再加入赖氨酸酰胺5(110.75g，0.452mol)的THF溶液(500ml)。大约48小时之后，使混合液过滤去掉固体物。在真空中浓缩滤液。将所得到的残留物溶于乙酸乙酯(EtOAc，500ml)中，然后在分液漏斗中按照下列步骤洗涤1.HCl水溶液(1N，3×500 ml)洗1次pH约为8，接着洗到pH1，2.水(500ml)3.Na2CO3水溶液(1/2饱和，2×500ml)，过滤收集形成的结晶固体(8)，4.水(3×500ml)。将有机层用MgSO4干燥。澄清之后，真空去除溶剂。使得到的残留物从热EtOAc中重结晶得到第二种样品8。D-苯丙氨酰基-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酸酰胺9.将酰胺8(120.53g，0.229mol)的甲醇溶液加入到含有5%Pd/c(50g)的甲醇(200ml)催化剂浆液中。用氢气取代氩气。当HPLC分析表明反应完全完成时(大约4小时)，用氩气取代氢气。然后使反应液通过Celite 垫澄清，并在真空中使滤液形成残渣。这种二肽产物可以直接用来制备三肽12。Nα-苄氧基羰基-色氨酰-D-苯丙氨酰-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酸-酰胺，12。将10℃的Nα-苄氧基羰基-色氨酸(10，67.60g，0.200mol)，THF(500ml)和CDI(2，33.05g，0.204mol)溶液进行搅拌直至没有气体放出。然后再向反应混合液中加入含有9(40.8g，0.103mol)的THF(大约200ml)溶液。使所得的溶液在室温下反应15小时。通过真空过滤收集形成的固体物。通过真空浓缩使滤液形成残渣。将所得到的残渣和固体物再混合并溶于EtOAc(4000ml)中，轻微加热。溶液冷却至室温时，即形成固体物。通过真空过滤收集固体物。使固体从热的MeOH中重结晶得到纯化的三肽12。将EtOAc滤液(来自第一次结晶)按照下列步骤在分液漏斗中洗涤1.HCl水溶液(1N，2×500ml)，2.水(1×500ml)，3.Na2CO3水溶液(1/2饱和，2×500ml)，4.NaCl水溶液(1×500ml)。有机层用MgSO4干燥，然后真空过滤澄清。在真空中去除滤液的溶剂。将所得到的残留物再溶于EtOAc中以得到干燥的固体物。可以将该固体物从热MeOH重结晶，形成第二种白色固体物12。色氨酰-D-苯丙氨酰基-(Nε-t-丁氧基羰基)赖氨酸-酰胺13。在氩气存在下将三肽12(64.59g，0.091mol)的甲醇溶液(1500ml)加入到含有5%Pd/c(5g)和甲醇(250ml)的催化剂浆液中。再加入额外量的甲醇(2250ml)。用氢气取代氩气，使之反应(大约24小时)。在反应完成后，用氩气代替氢气。使溶液通过Celite 垫进行澄清，并在真空中浓缩滤液得到白色固体物三肽13。B.制备三肽片段-K-His-DβNal-Ala-OMeNα-苄氧基羰基-组氨酰基-D-β-萘基丙氨酸甲酯，25.用饱和碳酸钠(400ml)和0.8N氢氧化钠水溶液(大约500ml)洗涤EtOAc(400ml)和D-β-萘基丙氨酸甲酯盐酸盐(22，0.62mol)溶液。去除掉所产生的水相(pH8.5)，并且接着用半饱和的Na2CO3水溶液(150ml)洗有机相，然后再用水(50ml)洗。在真空中浓缩乙酸乙酯离析出游离碱形式的22。-5℃(冰-乙醇浴)的含有Nα-苄氧基羰基-组氨酸(19，143.5g，0.50mol)，N-羟基丁二酰胺(HONSu，23，0.62mol)和新制备的游离碱性22(大约0.52mol)的DMF(大约3L)溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC，大约95g，0.46mol)。对所得到的反应液在室温下搅拌24小时。应进行HPLC分析以观察反应是否完全。如果反应不完全则将反应液冷却至大约-5℃，并向反应液中整批再加入二环己基碳二亚胺(大约0.17mol)。然后使反应混合液加热至室温并再搅拌24小时。过滤混合液去除二环己基脲(DCU)。向滤液中加水(1L)，并在真空中浓缩该溶液。把所得到的残留物溶于1NHCl水溶液中(大约1L，直至液相pH达到1)。用乙酸乙酯(每次1L)提取该水相两次，去除掉乙酸乙酯层。加入冷却的2N氢氧化钠(500ml)和氢氧化钠片调节该水相的pH。在中和过程中，加入冷却的乙酸乙酯(1L)以保持该溶液冷却。当水相的pH达到大约7时，一般会产生大量的白色固体沉淀或油状物。通过真空过滤或倾析收集沉淀物，并接着用饱和的碳酸钠(2×1500ml)，水(6×1500ml)和乙酸乙酯(3×1500ml)洗涤。在高真空下使所产生的物质干燥使达恒重。这种物质可以直接被水溶解而无需进一步纯化。可用D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐做为化合物22来代替D-β-萘基丙氨酸甲酯盐酸盐制备出DPhe肽。Nα-苄氧基羰基-组氨酰-β-萘基-D-丙氨酯.26.一种含有二肽25(大约，0.38mol)，水(360ml)和MeOH(大约6L)的溶液中加入氢氧化钠水溶液(192ml，0.08g/ml溶液，0.38mol)。在室温下搅拌该溶液直至完全水解(大约24小时)。通过HPLC分析证实起始肽已消失。在真空中将该溶液浓缩得到残留物，并将其溶于水中(大约1L)。用EtOAc(2×500ml)在分液漏斗中对水溶液层(pH大约10)萃取。去掉乙酸乙酯层。用浓盐酸调节所得到的水相pH至大约5，在此pH点一般产生白色固体或油状物。收集产物并在真空中干燥。Nα-苄氧基羰基-组氨酰-D-β-萘基丙氨酰-丙氨酸甲酯.20.在氩气存在下HONSu(23，0.505mol)的DMF(800ml)溶液中加入二肽Nα-苄氧基羰基-组氨酰-D-β-萘基丙氨酸(26，0.253mol)。再向该溶液中加入含有丙氨酸甲酯盐酸盐(15，0.303mol)，N-甲基吗啉(16，0.303mol)和DMF(200ml)的混合液。将所得到的溶液冷却至10℃，此时加入含有二环己基碳二亚胺(24，0.265mol)的二氯甲烷(273ml)。用HPLC检测该反应，使反应温度保持在10℃直至反应完全。几天(大约4天)之后，如果反应尚未完全，再加入24(0.080mol)，并且将反应混合液在10℃下再搅拌1天。用HPLC分析再检测反应直至完全反应(一般大约5天)。通过真空过滤收集反应形成的固体。把滤液在真空中浓缩成残渣。将所得到的残渣溶于乙酸乙酯中，并用半饱和的Na2CO3水溶液(2×500ml)提取。乙酸乙酯相用MgSO4干燥。澄清所得到的溶液并在真空中浓缩得到残渣。C.制备四肽片段Ala-His-DβNal-Ala-OH组氨酰-D-B-萘基-丙氨酰-丙氨酸甲酯.30.在氩气存在下，Nα-苄氧基羰基-组氨酰-D-β-萘基丙氨酰-丙氨酸甲酯20(71mmol)的甲醇溶液(500ml)中小心地加入在碳(3g)上的5%钯。向反应混合物中通入氩气鼓泡15分钟，并加入乙酸(15ml，0.26mol)。再向这种混合物中通入鼓泡(液面下)氢气15分钟，然后在稳定通入氢气(1atm)下于室温搅拌反应液。用HPLC分析检测起始物质剩余量。如果剩余一部分，则要小心地向反应混合物中通入氩气(液面下通入30分钟)，并再加入一份碳(2.5g)上的5%钯。然后再通入氢气，再向反应混合物中通入氩气，并通过硅藻土垫过滤澄清所得到的溶液。在真空中浓缩该溶液得到产物。将一份这种产物溶于水或于水中成浆状(500ml)。向这些物质中加入乙酸乙酯和饱和的碳酸钠水溶液。分离乙酸乙酯层或产生的固体，可得到一种不含乙酸酯的物质(30)。Boc-丙氨酸N-羟基丁二酰亚胺酯。31.Boc-丙氨酸(43mmol)和N-羟基丁二酰胺(48mmol)的二氯甲烷(250ml)的室温溶液中加入二环己基碳二亚胺(43mmol)。将所得溶液搅拌过夜。然后过滤反应混合物以去除二环己基脲，并在真空中浓缩澄清的滤液以得到产物，在使用之前将该产物存放于-20℃氩气中。Boc-Ala-His-DβNal-Ala-OMe.32.将上述的丙氨酸酯(23.9mmol)加入到His-D-βNal-Ala-OMe(30)(20.1mmol)无水二甲基甲酰胺(DMF，200ml)溶液中。在室温下搅拌所得到的均相溶液过周末并进行检测。当HPLC分析表明反应混合液中基本上没有三肽存在时(例如，大约3天)，向反应液中加水(50ml)，并且搅拌所得到的混合液一天。然后在真空中浓缩该溶液。将所得到的残留物溶于乙酸乙酯中，然后在半饱和的碳酸钠溶液(2×300ml)提取。有机相用MgSO4和Na2SO4进行干燥，并在真空中浓缩得到四肽。可以使用这种物质无需进一步纯化来制备Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH.Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH.33.含有Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OMe(13.7mmol)的甲醇(500ml)和水溶液(200ml)中加入2N氢氧化钠水溶液(7.5ml，15mmol)。在室温下搅拌该反应液过夜后，HPLC分析确定所剩余的起始物质的量。当反应基本完全时(大约过夜)，在真空中将所得溶液浓缩至大约200ml的体积。加水(100ml)，并且加入2N氢氧化钠(1ml)调节pH至大约12。用乙酸乙酯(2×500ml)提取该溶液。去掉乙酸乙酯层。加入HCl水溶液调节水相的pH至大约5，此时一般会得到产物的沉淀。重要的是要将水相的体积减少到最小以促进沉淀。将水相从产物中倾析掉，然后用水(2×50ml)漂洗该产物。在真空中将分离的产物干燥至恒重。D.肽片段缩合反应产生七肽Boc-Ala-His-Dβ-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH2.34.将两种肽Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH(3.3，2.6mmol)和Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH2(13，2.8mmol)溶于无水DMF中，并在真空中浓缩所得到的溶液。这种初步浓缩目的是企图去除任何可能存在的甲醇。将所得到的肽混合物再溶于DMF中，然后加入N-羟基丁二酰亚胺(5.1mmol)。将所得溶液温度冷却至-2℃，然后加入二环己基碳二亚胺(3.4mmol)的二氯甲烷(3，5ml)溶液。在-2℃的溶液温度下搅拌所得到的反应混合物三天。用HPLC分析确定该反应是否基本完全。这段时间之后，如果反应不完全，再加入二环己基碳二亚胺，并在-2℃下再搅拌所得到的反应混合液一天。如果在第二天(总共4天)HPLC分析再表明反应尚不完全，必须终止对反应混合物的冷却。可以在几个小时(大约8)的时间内使反应液的温度缓慢上升至室温(25℃)。在室温下搅拌该反应混合物过夜。重复该程序直至反应完全。然后，加水(50ml)，并再搅拌该混合液一天。过滤该反应液去除二环己基脲，并在真空中将所得到的滤液浓缩成粘性油。所得到的残留物中加入乙酸乙酯和半饱和的碳酸钠水溶液(200ml)。将两相混合物在旋转蒸发器上高速旋转大约1小时。在烧结玻璃漏斗上过滤收集形成的任何固体，得到产物。用水洗涤有机相，然后在真空中干燥至恒重得到产物。Ala-His-DβNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2.35.将七肽Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-(Boc)-NH2(34，1.02mmol)加入到含有三氟乙酸(30ml)，甲硫醚(14ml)，1.2乙二硫酚(ethanedithiol)(7ml)和苯甲醚(2.2ml)的二氯甲烷(15ml)室温溶液中。将均相反应混合液搅拌15分钟。这段时间之后，加入无水乙醚(450ml)以引起粗制生物活性肽产物35的沉淀。通过在烧结玻璃漏斗上过滤或倾析分离这种产物。把所得产物溶于水并冻干。可以通过中压色谱法在含有LichroprepTMRP-18柱填充材料(C-18，25-40nm，不规则筛孔)的26×460nm玻璃柱子上进一步纯化冻干的产物。注射入肽的水溶液之后，以每分钟9ml的流速，用0到25%甲醇的浅梯度洗脱该柱子5-20小时，然后以25至55%甲醇梯度洗脱大约48小时。甲醇浓度梯度以每小时2%的速度增加。洗脱过程中，保留的溶剂成份由含有0.2%三氟乙酸乙酯的水溶液组成。通过HPLC鉴定该产物(35)，并通过浓缩相应的洗脱体积分离出该产物。本发明通过优选的实施例对本发明进行了详细地描述。但是，本领域中的那些熟练人员，根据本发明公开说明书在本发明的精神和范围内进行变动和修改是有价值的。权利要求1.一种具有通式A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z的肽，其中A1是His，3(NMe)His，His-Ala，Ala，Tyr，Ao-His或Ao-3(NMe)Hie，其中Ao是任何自然存在的L-氨基酸，蛋氨酸(Met(O))，Dopa(3，4-二羟基苯基丙氨酸)，α-氨基丁酸或分子式L-Ao的肽，其中L是H，3，4-二羟基苯基丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、Tyr-DAla-phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-phe，Tyr-Ala-Gly-Thr或Tyr-DAla-phe-SarA2是β-萘基-D丙氨酸或D苯丙氨酸A3是丙氨酸，甘氨酸或丝氨酸；A5是D苯丙氨酸，D/Lβ(Me)苯丙氨酸或(NMe)D-苯丙氨酸；A6是B-G或G，其中B是任何自然存在的L-氨基酸，任何自然存在氨基酸的二肽或者H2N(CH2)nCO2H，其中n=2-12，而G是精氨酸、异赖氨酸(iLys)、赖氨酸或鸟氨酸；Z是多肽的C末端基团或C末端氨基酸加末端基团，且Z是-CONR1R2，-COOR1，-CH2OR1，-Gly-Z′，-Met-Z′，-Ly·s-Z′，-Cys-Z′，-Gly-Tyr-Z′，或者-ALa-Tyr-Z′，其中Z′是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1，其中R1是H，具有1到约6个碳原子的烷基，是3到约8个碳原子的环烷基，是2到约8个碳原子的链烯基、或是6到约12个碳原子的芳基；R2的定义同R1，二者可相同或不同；以及该肽医药上可接受的有机或无机盐。2.根据权利要求1的肽，其中A1是组氨酸、丙氨酸、组氨酸-丙氨酸或A0-组氨酸。3.根据权利要求2的肽，其中A3是丙氨酸。4.根据权利要求2的肽，其中A0是丙氨酸、赖氨酸或谷氨酸;A3是丙氨酸;A6是赖氨酸、异赖氨酸(iLys)，丙氨酸-赖氨酸、丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸或H2N(CH2)n′CO-赖氨酸，其中n′是4-8。5.根据权利要求1的肽，其中A2是DβNal。6.根据权利要求1的肽，具有分子式His-DβNal-Ala-Trp-Dphe-A6-Z。7.根据权利要求1的肽，其中A2是DPhe。8.根据权利要求6的肽，具有分子式His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。9.根据权利要求1的肽，具有分子式A0-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z或Ao-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。10.根据权利要求9的肽，其中A0是丙氨酸。11.根据权利要求6，9，18或20的肽，其中Z是-CONH212.根据权利要求12的肽，具有分子式Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NH2，Lys-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2，或Glu-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2.13.根据权利要求2，6，9，18，或20的肽，其中A6是G。14.根据权利要求8的肽，具有分子式Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NH2Lys-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2或Glu-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2.15.根据权利要求1的肽，具有分子式His-Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。16.根据权利要求15的肽，其中Z是-CONH2。17.根据权利要求16的肽，具有分子式His-Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。18.根据权利要求1的肽，具有分子式His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。19.根据权利要求18的肽，具有分子式His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。20.根据权利要求1的肽，具有分子式Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z或Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。21.根据权利要求20的肽，具有分子式Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2或Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。22.一种用于促进动物体内生长激素含量释放的药物组合物，包括权利要求1、4、5、7、9、12、14或15中的至少一种肽和其医药上可接受的载体或稀释剂。23.根据权利要求2的肽，其中A0是任何自然存在的氨基酸。24.如权利要求22的药物组合物，还包括可以作为释放生长激素激素受体兴奋剂或可以抑制生长激素释放抑制因子活性的第二种化合物。25.制备分子式为A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z的化合物的方法，其中A1是His，3(NMe)His，His-Ala.Ala，Tyr，A0-His或A0-3(NMe)His，其中A0是自然存在的L-氨基酸，Met(O)，DOPA，Abu或分子式为L-A0的肽，其中L是H，DOPA，Lys，Phe，Tyr，Cys，Tyr-DAla-Phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-Phe，Thr-Ala-Gly-Tyr或Tyr-DAla-Phe-SarA2是DβNal或DPhe;A3是Ala，Gly或Ser;A5是DPhe，D/Lβ(Me)Phe或(NMe)DPhe;A6是B-G或G，它包括偶连氨基酸或氨基酸衍生物以形成该化合物。26.制备权利要求1的肽的方法，它包括肽片段的缩合反应以形成肽。全文摘要本发明描述了新型多肽，给动物使用这种多肽，可以促进生长激素的释放。这些多肽具有分子式A文档编号C07K14/60GK1061606SQ91105938公开日1992年6月3日 申请日期1991年7月24日 优先权日1990年7月24日发明者J·C·哈布斯, C·H·福斯特, C·Y·包瓦斯, F·A·莫门尼, W·L·科迪 申请人:多价控股公司