新的同配多肽的制作方法

专利名称：新的同配多肽的制作方法技术领域：本发明涉及新的竞争性凝血酶抑制剂、其合成方法、含有这些化合物作为活性成分的药物组合物、以及这些化合物作为抗凝血剂在预防和治疗血栓栓塞病中的应用。血栓栓塞病的例子有静脉血栓形成、肺栓塞、动脉血栓形成，特别是心肌梗塞和脑血栓形成、全身性凝固性过高症和局部凝固性过高症，例如血管成形术和冠状动脉分流术后凝固性过高症。血液凝固是止血过程(即防止由于血管损伤失血)和血栓形成过程(即血管被血块病理性闭塞)都要涉及到的关键过程。凝血是下面的反应式1所画出的一系列复杂酶反应的结果。反应式1中的各种凝血因子用罗马数字来标识。无论凝血过程是由内在途径还是外在途径引发，凝血酶都在凝血过程中起核心作用它激活血小板;它将血纤维蛋白原转化为血纤维蛋白单体，而血纤维蛋白单体自发聚合成丝;它激活FⅩⅢ，而FⅩⅢ本身又使上述聚合物交联成为不溶性的血纤维蛋白。凝血酶在一个正反馈反应中进一步激活FⅤ和FⅧ。所以，预计凝血酶抑制剂是有效的抗凝血剂。 如M.Szelke和D.M.Jones所述(EP-A1-0，118，280，英国优先权日为1983年3月4日)，最早研制出的凝血酶抑制剂是以亲电的酮类为基础的。这些早期的化合物是由血纤维蛋白原Aα链的P3-P2′五肽顺序衍生的，其中的P1-P1′肽键裂开而由-CO-CH2-部分代替，形成了相应肽的酮同配物。以亲电性酮类为基础的丝氨酸蛋白酶抑制剂的其他已知例子包括(a)M.Kolb等(Merrel-Dow)的EP-A2-0，195，212(优先权日为1986年2月4日)，描述了肽α-酮酯类和酰胺类;(b)B.Imperiali和R.H.Abeles，Biochemistry 253760，1986(肽基氟烷基酮类);(c)Ueda等，Biochem.J.265539，1990(肽基氟烷基酮类);(d)D.Schirlin等(Merrel-Dow)的EP-A1-0，362，002(优先权日为1988年9月1日)，描述了氟烷基酰胺酮类;(e)P.Bey等(Merrel-Dow)的EP-A2-0，364，344(优先权日为1988年10月7日)，描述了α，β，δ-三酮化合物;(f)E.N.Shaw等(Research Corporation)的美国专利4，318，904(优先权日为1980年4月25日)，描述了肽氯甲基酮类，如H-DPhe-Pro-Arg-CH2Cl。S.Bajusz等人已报导了以肽醛类为基础的凝血酶抑制剂(J.Med.Chem.331729，1990;Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R T，EP-A2-0，185，390，优先权日为1984年12月21日)。A.D.Kettner等人(杜邦公司)的EP-A2-0，293，881(优先权日为1987年6月5日和1988年4月6日)报导了肽形式的凝血酶抑制剂，其中包含精氨酸的C末端硼酸衍生物及其异硫糖醛酸(isothiouronium)类似物。具有凝血酶抑制作用且不含亲电性酮的精氨酸衍生物或类似物的例子有(a)S.Okamoto等(三菱化成工业株式会社)的EP-A1-0，008，746(优先权日为1978年8月31日)，描述了芳基磺酰基精氨酸酰胺类，例如阿格特罗本(argatroban);(b)J.Stürzebecher等，Pharmazie 36639，1981(芳基磺酰基对脒基苯丙氨酸酰胺类)。本发明的一个目的是提供对其酶具有竞争性抑制活性(即引起可逆抑制)的新的强效凝血酶抑制剂。另一个目的是得到可口服生物利用且对凝血酶的抑制作用相对于其他丝氨酸蛋白酶具有选择性的抑制剂。稳定性、作用的持续性、以及治疗剂量下的低毒性，是本发明的另一些目的。化合物现已发现，通式1的化合物，不论是原有形式还是生理上可接受盐的形式，包括立体异构体，是凝血酶的强效抑制剂 除非另外指出，各取代基在式1中及在以后出现时的定义如下A代表-CH2-，-CH＝CH-，-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-;R1和R2相同或不同，各自代表H或X-B-，其中B是含1-3个碳原子的直链或支链亚烷基，X是H、甲基、乙基、含3-6个碳原子的环烷基或R′CO-，其中R′为OH、含1-4个碳原子的直链或支链烷氧基、NH2或NHR″，其中R″是含1-4个碳原子的直链或支链烷基;或者X是本身已知的羧酸类似物，选自-PO(OR′′′)2，-SO3H和5-(1H)-四唑基，其中R′′′是H、甲基或乙基;或者B为-SO2-而X为甲基或乙基;m为0、1或2，R3代表环己基;R3A代表H;或者m为1，R3代表环己基或苯基，R3A与R1一起形成亚乙基桥;Y代表O或S(O)p，其中p为0、1或2;R4代表H;含有1-6个碳原子、未取代或被一个或更多个氟原子和/或苯基取代的直链或支链烷基或环烷基;取代或未取代的芳环，选自苯基、4-甲氧基苯基、4-叔丁基苯基、4-甲基苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、被1-5个氟原子取代的苯基;或-CH(CF3)苯基。式1化合物涉及到人血纤维蛋白原Aα链中代表经过修饰的亚位点P3-P1′的肽顺序H-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-1 5 10P3P2P1! P1′ P2′ P3′-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg—Gly-Pro-Arg-Val-14 15 16 17 20本发明的一个优选实施方案涉及式1化合物，其中A代表-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-;R1是H，R2代表HOCO(CH2)n-或CH3CH2OCO(CH2)n-，n为1或2;Y为O;m为1，R3代表环己基，R3A代表H;本发明特别优选的实施方案由以下化合物代表HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-CH2-CF3HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-nBuHOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBuHOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBu医学和药学应用本发明的另一实施方案涉及对人或动物体需要抑制凝血酶的症状进行治疗。预计本发明的化合物特别可用于包括人在内的动物，治疗或预防血液和组织中的血栓形成和凝固性过高。这些化合物具有潜在治疗和/或预防用途的疾病包括静脉血栓形成和肺栓塞、动脉血栓形成，例如心肌梗塞、不稳定心绞痛、血栓形成引起的中风、外周动脉血栓形成。另外，预计这些化合物可用于预防动脉硬化病，例如冠状动脉疾病、脑动脉疾病和外周动脉疾病。另外，预计这些化合物可与血栓溶解剂一起用于心肌梗塞。另外，预计这些化合物可用于预防血栓溶解手术后、经皮跨腔血管成形手术(PTCA)后、及冠状动脉分流手术后的再堵塞。另外，预计这些化合物可用于预防显微手术后的血栓再形成。另外，预计这些化合物可用于与人造器官和心脏瓣膜有关的抗凝血治疗。另外，预计这些化合物可用于血液透析和散布性血管内凝血中的抗凝血治疗。日剂量通常在0.1mg至10g活性成分范围内。静脉注射液优选含有0.1-100mg/ml，而一个剂量单位优选含有1-1000mg，并优选每日给药1-4次。另一个预期的用途是用于对患者体内使用的导管和机械装置进行冲洗，并作为抗凝血剂用于血液、血浆和其他血液制品的体外保存。制备本发明的另一个目的是本发明化合物的制备方法。于是，本发明进一步涉及一种制备式1化合物的方法，该方法包括(方法Ⅰ)用R4Y-(Y＝O，S)置换下式卤甲基酮中的卤素(如步骤(A)、(D)和(F)中所说明的)， 其中W1是氨基末端保护基如叔丁氧羰基，W2是保护基如苄氧羰基;将该酮还原为醇，脱除氨基末端保护基，进行常规肽偶联，然后将醇氧化，得到受护的三肽酮，脱除氨基末端保护基，然后进行N-烷基化(如步骤(A)、(B)、(G)、(H)中所说明的)并脱保护，或者用氨基末端-N-烷基化的N-三氟酰基保护的二肽(步骤K)置换前面提到并说明过的偶联反应中的受护二肽(例如步骤(A)(ⅲ))，然后进行氧化和脱保护;或者(方法Ⅱ)用R4-卤素使下式的α-酮醇烷基化(如步骤(E)中所说明的)，然后再如方法Ⅰ进一步反应; 其中W1和W2如上所限定;或者(方法Ⅲ)将经过修改的Dakin-West反应(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.8981，1969)应用于三肽(J.Org.Chem.，501112，1985)使下式化合物(或直接使用氨基末端-N-烷基化的N-三氟酰基保护的三肽)与(T-CH2CO)2O和4-DMAP反应，然后如方法Ⅰ进一步反应，其中T为卤素、R4O或R4S; 其中W1和W2如上所限定。在该反应生成立体异构体混合物的情况下，可以用常规色谱技术或重结晶技术分离这些立体异构体，需要时分离出单个立体异构体。下列叙述说明了本发明的各个方面。合成和药学制备这里要求保护的抑制剂时所用的化学反应概括于“合成方案”(步骤A至H)及步骤I和K中。必需的精氨酸烷氧甲基酮或精氨酸苯氧甲基酮的主要制备方法是(Ⅰ)使用预先制成的NaOR4(步骤A)或通过使用KF(步骤D和F)，用R4O-置换溴甲基酮中的Br;或者(Ⅱ)用Ag2O/R4I使精氨酸α-酮醇烷基化(见步骤E)。利用常规的肽偶联反应引入DCha、Pro及其类似物。在N末端引入羧烷基的方法是用溴乙酸酯进行烷基化或在丙烯酸叔丁酯上进行迈克尔加成(步骤A、B)，或者预先在二肽部分中引入羧烷基(见步骤K)。然后脱除所有保护基(见下面的脱保护步骤a-c)。一般实验步骤常规后处理是指乙酸乙酯萃取;通常用0.3M KHSO4、1M KHCO3、H2O和盐水洗涤，然后用Whatman相分离滤纸过滤;以及用甲苯共沸法干燥。在涂有Merck硅胶60F254的商品玻璃板上进行TLC。将紫外光照射、加热后喷荧光素或加热后氯化(Cl2池)、以及喷1%淀粉/KI溶液结合起来进行显色。闪式色谱在Merck硅胶60(40-63μm)上于N2压力下进行。用Beckman Gold System进行氨基酸分析。将肽水解(6N HCl+苯酚，110℃，22小时)，然后注入，并对脯氨酸峰进行定量。在装填Vydac C18 15-25μm硅胶的玻璃柱(Anachem)中进行MPLC，用1%TFA-MeCN至1%TFA-H2O梯度进行洗脱，在226nm处监测。用HPLC分析各级分，并将纯级分合并并冰冻干燥。用Spectra-Physics 8700系列色谱仪进行HPLC。溶剂体系与MPLC所用的相同，在210nm处进行检测。流速为1.5ml/分。柱为Novapak C18，4μm(8×100mm柱体，Waters)。所有中间体都用NMR(Hitachi-Perkin Elmer R24 60MHz或Jeol 270MHz核磁共振仪)进行定性。所有最终的肽都以其FAB质谱(M-Scan Ascot，Berks.，U.K.)进行定性。原料的制备(ⅰ)将Boc-Arg(Z2)-OH(10毫摩尔)的无水THF(50ml)溶液和NMM(10毫摩尔)冷却到-10℃，滴加iBC(10毫摩尔)，同时保持温度为-10℃。-10℃下10分钟后，将混合酸酐倒入CH2N2-乙醚(25毫摩尔-150毫升)中。3小时后，用乙酸破坏掉过量的CH2N2，溶液用H2O(3次)和盐水洗涤。干燥并蒸发后，得到黄色油状的重氮酮。IR 2100cm-1(COCHN2)。(ⅱ)将重氮酮(10毫摩尔)的无水乙酸乙酯(200ml)溶液冷却到-15℃，滴加1M HBr/乙酸乙酯(约11ml)。黄色消失后，TLC(乙酸乙酯/己烷)表明重氮酮已完全转化为溴甲基酮。将该溶液迅速转移到分液漏斗中，用1M KHCO3和盐水洗涤，干燥并蒸发后留下一种固体物。将其溶于热乙醇中再冷却，得到无定形白色粉末状的溴甲基酮。NMR(CDCl3)δ1.3(5，9H)，1.5-1.85(m，4H)，3.75-3.95(m+s，4H)，4.3(m，1H)，5.05(s，2H)，5.15(s，2H)，5.65(d，2H)，7.30(m，10H)，9.2(br，s，1H)，9.3(br，s，1H).在50℃时软化，然后在＞70℃时缓慢分解。Boc-DCha-X-ONSu(X＝Pro，Pic或Aze)(ⅰ)将Boc-DCha-OH(10毫摩尔)的CH2Cl2/DMF(1∶5 50ml)溶液用HONSu(11毫摩尔)处理，冷却至0℃，加入WSCDI(13毫摩尔)。30分钟后将其温热至室温。3小时后，TLC表明已完全生成Boc-DCha-ONSu。加入乙醚(200ml)并用H2O(3次)和盐水洗涤，干燥后得到无色泡沫状的酯。(ⅱ)将N-羟基琥珀酰亚胺基酯(10毫摩尔)的CH2Cl2(50ml)溶液用H-Pro-OBzl.HCl或H-Pic-OBzl.HCl或H-Aze-OBzl(11毫摩尔)和iPr2NEt(20毫摩尔)处理。搅拌3小时后进行常规的乙酸乙酯/0.3M KHSO4后处理，得到二肽酯，其纯度足以用于下一步。(ⅲ)将Boc-DCha-X-OBzl的THF溶液在标准温度压力下用5%Pd/C氢化4小时。过滤并蒸发后得到固体或泡沫状的酸。重结晶(异丙醚或乙醚/己烷)得到纯产物。Boc-DCha-Pro-OH(固体m.p.163-166℃)NMR(CDCl3)δ0.8-2.05(m，+s 1.4，26H)，3.4(m，1H)，3.85(m，1H)，4.5(m，2H)，5.2(m，1H).Boc-DCha-Pic-OH(固体m.p.121-122℃)NMR(CDCl3)δ0.8-2.05(m，+s 1.45，28H)，3.35(m，1H)，3.95(m，1H)，4.6-4.9(m，1H)，5.4(m，1H)，5.6(m，1H)，8.8(br，s，1H).Boc-(Me)DCha-Pro-ONSu将Boc-(Me)DPhe-OH在0.41兆帕下用5%Rh-C/90%乙酸-水氢化3天，得到定量产率的Boc-(Me)DCha-OH。将Boc-(Me)DCha-OH，(10毫摩尔)和NMM(10毫摩尔)的CH2Cl2(50ml)溶液冷却至-15℃，加入Ph2PO-Cl(10毫摩尔)。20分钟后，加入H-Pro-OBzl.HCl(11毫摩尔)和NMM(20毫摩尔)。1小时后使其温热至室温。2小时后进行常规后处理和闪式色谱(40%乙酸乙酯/己烷)，得到无色油状的纯Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl(80)。NMR(CDCl3)δ0.5-2.2(m，+s 1.4，26H)2.65(s，3H)，3.5(m，2H)，4.3-5.0(m，2H)，5.1(s，2H)，7.30(s，5H).如下面对Boc-DCha-X-ONSu所述将上述化合物转化为N-羟基琥珀酰亚胺基酯。合成方案步骤(A) 步骤(C) 步骤(E) 步骤(G)Boc-DCha-X-Arg(Z2)-CH2OR4(1)HCl-二噁烷)/(2)MeSO2Cl) Me-SO2-DCha-X-Arg(Z2)-CH2OR4例如 R4＝CH2CF3步骤(H)Boc-DCha-X-Arg(Z2)-CH2OR4(1)HCl-二噁烷)/(2)ChCHO/NaCNBH3) ChCH2-DCha-X-Arg(Z2)-CH2OR4例如 R4＝CH2CF3制备步骤下列制备步骤说明了上述方法Ⅰ-Ⅲ及合成最终化合物的后续步骤。步骤(A)(ⅰ)在-20℃和N2下，在预先制成的醇盐或酚盐(醇或酚10毫摩尔，以及80%NaH-油，10毫摩尔)的DMF(40ml)溶液中，加入固体Boc-Arg(Z2)-CH2Br(10毫摩尔)。30分钟后将溶液温热至室温。2小时后加入0.3M KHSO4中和剩余的所有醇盐，并真空除去DMF。使粗产物在乙酸乙酯和水之间分配，乙酸乙酯层用盐水洗涤，干燥并蒸发。闪式色谱或结晶后得到纯的烷氧基酮。Boc-Arg(Z2)-CH2OPh(固体)NMR(CDCl3)δ1.41(s，10H)，1.64-1.68(m，3H)，3.92(dd，2H)，4.5(m，1H)，4.62(q，2H)，5.1(s，2H)，5.2(s，2H)，5.5(d，1H)，6.8(d，2H)，6.95(t，1H)，7.2-7.45(m，12H)，9.2(br，s，1H)，9.3(br，s，1H). 熔点115-118℃.Boc-Arg(Z2)-CH2OCH2CF3(固体)NMR(CDCl3)δ1.35(s，10H)，1.55-1.75(m，3H)，3.7(q，2H)，3.85(m，2H)，4.2(q+m，3H)，5.05(s，2H)，5.15(s，2H)，5.7(d，1H)，7.15-7.35(m，10H)，9.15(br，s，1H)，9.3(br，s，1H).熔点87-90℃.(ⅱ)在0℃下，将烷氧甲基酮或苯氧甲基酮的MeOH/THF(1∶1)溶液用NaBH4(1当量)处理。10分钟后，加入0.3KHSO4使pH达到7，将该混合物蒸发除去MeOH/THF。加入乙酸乙酯，进行常规后处理(乙酸乙酯/0.3M KHSO4)后，分离出对映体混合物形式的醇。(ⅲ)将上述醇在室温下用4M HCl的二噁烷溶液处理15分钟，然后蒸发。将CH2Cl2(5ml)中的残渣(1毫摩尔)用Boc-DCha-X-ONSu(1当量)和iPr2NEt处理(处理至用湿pH试纸测试时pH为9)。3小时后进行常规后处理，得到经过修饰的三肽，将其用闪式色谱法(含有1%乙酸的乙酸乙酯-己烷混合物)纯化。收率50-85%。(ⅳ)将三肽醇的CH2Cl2溶液用Dess-Martin高碘烷(periodinane，3当量)处理(Dess，D.B.和Martin，J.C.，J.Org.Chem.484155-4156，1983)。室温下搅拌2小时后，进行常规后处理(乙醚/1M KHCO3/Na2S2O3)，得到粗制三肽酮，将其用闪式色谱法(乙酸乙酯-己烷)纯化。(ⅴ)将上述酮在室温下用4M HCl-二噁烷处理15分钟，然后蒸发。将无水MeCN(5ml)中的残渣(1毫摩尔)用溴乙酸苄酯或溴乙酸叔丁酯(1.2当量)和iPr2NEt(3当量)处理。回流2小时后，将该溶液蒸发并进行闪式柱色谱(乙酸乙酯-己烷)，得到油状的苄氧羰甲基肽或叔丁氧羰甲基肽(40-50%)。在实施例30和31中，用2.5当量溴乙酸酯来实现双烷基化。步骤(B)在室温下，用过量的4M HCl-二噁烷将肽烷氧甲基酮处理15分钟。蒸发后得到盐酸盐，将其分配在乙酸乙酯和1M KHCO3之间。分出乙酸乙酯，干燥并蒸发后得到游离胺，将其吸收在甲醇中并加入新蒸的丙烯酸叔丁酯(1.5当量)。回流4小时后得到叔丁氧羰乙基肽，将其用闪式色谱法(乙酸乙酯/己烷)纯化。步骤(C)将溶解在醇R4OH(5ml)中的Boc-Arg(Z2)-CHN2(1毫摩尔)用Rh2(OAc)4(催化剂)处理。室温下若干小时后，TLC分析表明已没有剩余的重氮酮。真空除去醇，用乙酸乙酯/己烷混合物以闪式色谱法分离出产物。步骤(D)(ⅰ)将Boc-Arg(Z2)-OH(10毫摩尔)的无水CH2Cl2(50ml)溶液用2，2，2-三氯乙醇(11毫摩尔)和4-DMAP(1毫摩尔)处理，冷却至0℃，加入WSCDI(13毫摩尔)。30分钟后将其温热至室温并搅拌24小时。蒸发后在乙酸乙酯/0.3M KHSO4之间分配，然后用0.3M KHSO4洗3次，用H2O洗1次，用盐水洗1次，干燥并蒸发后得到Tce酯，原样使用。(ⅱ)在室温下，用4M HCl-二噁烷(50ml)将Tce酯(10毫摩尔)处理20分钟，然后蒸发。干燥后，将CH2Cl2(50ml)中的残余物依次用Boc-DCha-X-ONSu(10毫摩尔)(X＝Pro，Pic)和iPr2NEt处理(处理至用湿pH试纸测试时pH为9)。3小时后进行常规后处理(乙酸乙酯/0.3M KHSO4)，得到油状三肽酯。在1小时内，将90%乙酸-水(50ml)中的Tce酯(10毫摩尔)每隔5分钟用少量新活化的Zn处理一次。再过1小时后，将混合物过滤，溶液蒸发。进行常规后处理(乙酸乙酯/0.3M KHSO4)，得到三肽酸，对其进行硅胶闪式色谱纯化(2%乙酸-乙酸乙酯)，得到无色泡沫状的三肽酸(三步收率为80%)。(ⅲ)用与对Boc-Arg(Z2)-CH2Br所述同样的步骤，将三肽酸转化为溴甲基酮。用乙酸乙酯/己烷混合物进行闪式色谱，得到无色油状的三肽溴甲基酮。NMR(CDCl3)δ0.9(m)，1.15(m)，1.25(m)，1.35(s)，1.6(m)，1.85(m)，2.1(m)[共 30H]，3.3(m，1H)，3.7(m，1H)，3.95(m，2H)，4.15(s，2H)，4.25(m，1H)，4.4(m，1H)，4.5(m，1H)，5.0(d，1H)，5.1(dd，2H)，5.2(s，2H)，7.2-7.4(s，m，10H)，9.2-9.5(2 br，s，2H).(ⅳ)将三肽溴甲基酮(1毫摩尔)的无水DMF(5ml)溶液用氟化醇、酚或硫醇(1.2毫摩尔)和无水氟化钾(1.5毫摩尔)处理，室温下搅拌24小时。蒸发后进行常规后处理和闪式色谱，得到三肽酮。Boc-DCha-Pro-Arg(Z2)-CH2O-Ph(4-Me)NMR(CDCl3)δ0.9(m)，1.15(m)，1.25(m)，1.35(s)，1.6(m)，1.85(m)，2.1(m)[共 30H]，2.38(s，3H)，3.4(m，1H)，3.9(m，1H)，4.1(br，s，2H)，4.4(m，1H)，4.6(m，1H)，4.7(m，1H)，4.9(q，2H)，6.9(d，1H)，7.15(d，1H)，7.4-7.5(m，2H)，7.45(s，10H)，9.4(br，s，1H)，9.6(br，s，1H).实施例37的作法是，在室温下，用间氯过苯甲酸的二氯甲烷溶液将受护硫化物氧化成砜。步骤(E)(ⅰ)将Boc-Arg(Z2)-CH2Br(10毫摩尔)和苯甲酰甲酸(12毫摩尔)的DMF(40ml)溶液用KF(14毫摩尔)处理。搅拌3小时后蒸掉DMF，将产物分配在乙酸乙酯和H2O之间。干燥并蒸发后，得到粗制的苯甲酰甲酸酯，用结晶法(CH2Cl2-己烷)纯化后得到白色固体状产物(86%)。NMR(CDCl3)δ1.4(s，9H)，1.65-1.9(m，4H)，3.95(m，2H)，4.3(m，1H)，4.95(q，2H)，5.15(ABq，2H)，5.25(s，2H)，5.9(d，1H)，7.35(m，10H)，7.5(t，2H)，7.65(t，1H)，8.15(t，2H)，9.25(br，s，1H)，9.45(br，s，1H). 熔点130-132℃.(ⅱ)将苯甲酰甲酸酯(5毫摩尔)在THF(200ml)和1M KHCO3(200ml)中的溶液于室温下剧烈搅拌24小时。分出THF并蒸发，水相用乙酸乙酯萃取，萃取液与来自THF的物料合并。用CH2Cl2-己烷结晶后得到白色固体状的α-酮醇(90%)。NMR(CDCl3)δ1.4(s，9H)，1.7(m，4H)，2.95(t，1H)，3.95(m，2H)，4.25(m，2H)，5.15(s，2H)，5.25(s，2H)，5.6(d，1H)，7.35(m，10H)，9.25(br，s，1H)，9.4(br，s，1H). 熔点101-103℃.(ⅲ)将α-酮醇(1毫摩尔)的无水CH2Cl2(5ml)溶液用烷基碘(5-10毫摩尔)和氧化银(2毫摩尔)处理。将该混合物在暗处回流2-17小时(例如，MeI、EtI、nPrI2小时;nBuI5小时)。蒸发后进行闪式色谱(乙酸乙酯-己烷)，得到无色油状的烷氧甲基酮(50-85%)。Boc-Arg(Z2)-CH2OEt(油)NMR(CDCl3)δ1.15(t，3H)，1.4(s，9H)，1.5-1.8(m，4H)，3.4(q，2H)，3.95(t，2H)，4.1(q，2H)，4.45(m，1H)，5.15(s，2H)，5.25(s，2H)，5.4(d，1H)，7.35(m，10H)，9.25(br，s，1H)，9.4(br，s，1H).Boc-Arg(Z2)-CH2NBu(油)NMR(CDCl3)δ0.9(t，3H)，1.25-1.8(m)+1.4(s)[17H]，3.3(dd，2H)，3.95(t，2H)，4.05(q，2H)，4.45(m，1H)，5.1(s，2H)，5.2(s，2H)，5.35(d，1H)，7.35(m，10H)，9.25(br，s，1H)，9.4(br，s，1H).步骤(F)用步骤(D)(ⅳ)中概述的方法，将Boc-Arg(Z2)-CH2Br用CF3CH2OH，CF3(CF2)2CH2OH或Ar-OH和KF的DMF溶液处理。步骤(G)将Boc保护的肽用4M HCl-二噁烷在室温下处理15分钟，然后蒸发。将CH2Cl2中的残余物用MeSO2Cl(1.1当量)和iPr2NEt(2.5当量)处理。1小时后进行常规后处理和闪式色谱，得到甲磺酰基肽，按脱保护步骤(a)进行脱保护。步骤(H)如上所述脱除肽的Boc保护基，用乙酸乙酯/1M KHCO3分配法洗去HCl。将游离胺的甲醇溶液冷却至0℃，用醛Ch-CHO(1.5当量)和NaCNBH3(1当量)处理。1小时后，在冷处进行蒸发并进行闪式色谱，得到N-烷基化的肽。用脱保护步骤(a)脱保护。步骤(I)如Chung等人所述(J.Org.Chem.55270，1990)制备Boc-(3-反式苯基)-D，L-脯氨酸，并按前面对Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl所述使其与H-Pro-OBzl偶联。然后如下所述将该二肽转化为其-ONSu酯。由苯基类似物制备Boc-(3-反式环己基)-D，L-脯氨酸，方法是，在0.41兆帕下，在90% HOAc-H2O中用5% Rh-C氢化3天。步骤(K)中间体N-(Bzlo2C-CH2-)，N-(CF3CO)-DCha-Pro-ONSu的合成 (ⅰ)在标准温度和压力下，用5% Pd-C使Z-DCha-Pro-OtBu(用常规肽偶联反应制得)在THF中氢化24小时。过滤并蒸发后得到H-DCha-Pro-OtBu(油状，100%)。(ⅱ)将上述产物(2毫摩尔)和乙醛酸苄酯(1当量)的苯溶液蒸发三次(每次加入新鲜苯)，以除去水。残留的亚胺(2毫摩尔)置于1%乙酸/甲醇(8ml)中用NaCNBH3(2毫摩尔)处理。1小时后进行蒸发，然后进行硅胶闪式色谱(60%乙酸乙酯-己烷)，得到385mg BzlO2C-CH2-DCha-Pro-OtBu(41%)。(ⅲ)将上述产物(380mg)的无水CH2CL2(8ml)液用Et3N(2当量)和(CF3CO)2O(1.2当量)处理。40分钟后，进行蒸发和闪式色谱(硅胶，30%乙酸乙酯-己烷)，得到390mg油状的N-(BzlO2C-CH2-)，N-(CF3CO)-DCha-Pro-OtBu(86%)。1HNmr(COCl3)由于存在4种旋转异构体而变得复杂，例如δ1.4-1.5处的叔丁基裂分四次，比例为1∶0.25∶0.8∶0.4.ù 0，9(m)，1.1(m)，1.65(m)，1.95(m)，2.2(m)[17H];1.4-1.5[4xs，9H];3.1(m)，3.5(m)，3.7(m)[2H];4.3-4.6[m，3H];5.05-5.4(m，3H);7.35[.s，5H].(ⅳ)在室温下，将上述产物(335mg)用CH2CL2-TFA(11，8ml)处理2.5小时。蒸发后再由甲苯中蒸发三次，得到游离酸(100%)。(ⅴ)按前面对Boc-DCha-OH所述，用HONSu将上述酸转为其-ONSu酯(100%)。该中间体可以用已概述的一般方法与H-Arg(Z2)-CH2-Y-R4偶联。脱保护步骤(a)生成用N-CF3-CO-保护的肽。N-CF3-CO用脱保护步骤(d)脱除。脱保护步骤(a)在标准温度压力下，用5%Pd/C使含有1M HCl(2当量)的受护肽在MeOH/H2O(3∶1)中的溶液氢化40分钟。过滤(0.2μm)并蒸发，然后从水中冰冻干燥，得到蓬松白色固体状的肽。需要的话用MPLC进行纯化(见一般步骤)。(b)将受护肽先用TFA/CH2Cl2(1∶1)处理1小时并蒸发，然后如前面(a)所述进行氢化。(c)先按(E)(ⅱ)水解COCOPh基团，然后按(a)用H2-Pd/C氢化。(d)脱除N-CF3-CO(N-三氟乙酰基)将N-三氟乙酰基肽溶解在MeCN-H2O-0.880氨(1∶1∶1)中，室温下保持24小时。必要时在蒸发后进行纯化，得到肽。实施例下列实施例更详细地说明本发明的原理。表1列出了本发明化合物的实施例。表2指出了其制备所用的步骤，这些步骤已在题为“制备步骤”的部分作了描述。表3给出了所列化合物的定性数据。实施例1-37表1实施例号 化学式1 H-DCha-Pro-D,LArg-CH2-OH2 H-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Me3 H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF34 H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH(CF3)25 H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-C*H(Ph)-CF36 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF37 Et-OOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF38 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF2-CF2-CF39 HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph10 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-OMe)11 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-tBu)12 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-Me)13 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-F)14 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(3-F)15 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(2-F)16 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(3-CF3)17 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-CF3)18 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(2-CF3)19 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-C6F520 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Et21 HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nPr22 HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBu23 HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-iBu24 HOOC-CH2-DCha-Aze-D,LArg-CH2-O-CH2-CF325 HOOC-CH2-DCha-Pic-D,LArg-CH2-O-CH2-CF326 HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-nBu27 Me-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF328 Me-SO2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF329 Ch-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF330 (HOOC-CH2)2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3表1(续)实施例号 化学式31 (HOOC-CH2)2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-iBu32 HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-nBu33 HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF334 H-(3-trans-Ph)-D,LPro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF335 H-(3-trans-Ch)-D,LPro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF336 HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-S-nBu37 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-SO2-nBu＊绝对构型R或S表2实施例号 制备步骤 脱保护步骤1 D c2 E b3 A或C b4 A或C b5 A或C b6 A a7 A a8 F a9 A或D a10 F a11 D a12 D a13 D a14 D a15 D a16 D a17 D a18 D a19 D a20 E a21 E a22 E a23 E a24 A a25 A a26 E a27 A和F a28 A和G a29 A和H a30 A a表2(续)实施例号 制备步骤 脱保护步骤31 E a32 E和B b33 A和B b34 I和A b35 I和A b36 D a37 D a表3实施例号 分子量 FAB MS 氨基酸分析: HPLC保留时间(M+1) 肽含量(%)*(分)/系统**1 438.57 439 56/Pro 10.3/E2 452.60 453 65/Pro 9.9/E3 520.6 521 59/Pro 8.6/A4 588.6 589 60/Pro 10.7/A5 596.7 597 61/Pro 12.2/A6 578.64 579 72/Pro 14.8/C7 606.69 607.7 65/Pro 22.0/B8 678.65 679.8 76/Pro 18.2/G9 572.71 573.3 73/Pro 19.9/B10 602.74 603.8 76/Pro 13.4/G11 628.82 629.5 77/Pro 22.0/G12 586.74 587.2 75/Pro 16.0/G13 590.70 591.4 76/Pro 15.2/G14 590.70 591.4 63/Pro 15.0/G15 590.70 591.4 54/Pro 14.0/G16 640.71 641.5 68/Pro 19.0/G17 640.71 641.6 70/Pro 20.0/G18 640.71 641.4 65/Pro 18.4/G19 662.66 663 49/Pro 21.0/G20 524.67 525.4 79/Pro 15.5/B21 538.69 539 67/Pro 9.2/F22 552.72 553 69/Pro 19.3/B23 552.72 553.4 56/Pro 9.2/F24 564.61 565 67/Aze 13.6/D25 592.66 593 90/Pic 8.4/D26 566.75 567.4 86/Pic 17.0/G27 534.63 535.6 70/Pro 18.8/B28 598.69 599 71/Pro 11.2/D表3(续)实施例号 分子量 FAB MS 氨基酸分析: HPLC保留时间(M+1) 肽含量(%)*(分)/系统**29 616.77 617 64/Pro 14.5/C30 636.67 637.6 70/Pro 12.0/A31 610.76 611.2 67/Pro 10.0/F32 566.75 567.5 65/Pro 19.7/B33 592.66 593 46/Pro 10.6/F34 540.59 541 56/Pro 14.3/C35 546.64 547 49/Pro 15.9/C36 568.78 569.4 45/Pro 17.4/G37 600.78 601.3 62/Pro 14.6/G＊按所示氨基酸计算。＊＊参见“一般实验步骤”。所给时间是指L-Arg差向异构体。D-差向异构体(少量)通常早0.5分流出。系统A1%TFA-MeCN在1%TFA-H2O中的浓度在25分钟内由20%增至80%(20-80%，25分)。系统B10-60%，30分系统C10-90%，30分系统D30-100%，30分系统E10-90%，20分系统F20-100%，20分系统G20-70%，30分实施例38用于连续静脉给药的溶液由下列成分制备溶液凝血酶抑制剂 50mg注射用氯化钠 4.5g注射用水加至500ml将活性成分和氯化钠溶于水中，然后将溶液过滤，再用高压灭菌法或无菌0.2μm滤器过滤法灭菌，并无菌装入无菌输液瓶中。实施例39注射液由下列成分制备溶液凝血酶抑制剂 5g注射用氯化钠 9g注射用水加至1000ml将活性成分和氯化钠溶于水中，然后将溶液过滤，再用高压灭菌法或无菌0.2μm滤器过滤法灭菌，并无菌装入无菌安瓿瓶中(5ml)。实施例40用于经鼻给药的溶液由下列成分制备溶液凝血酶抑制剂 10g甘油 200g对羟基苯甲酸甲酯 1g对羟基苯甲酸丙酯 0.2g注射用水加至1000ml将活性成分和防腐剂溶解在甘油和大部分水中。然后把体积调至1000ml，将溶液装入无菌聚乙烯容器中。实施例41口服片剂由下列成分制备1000片片剂凝血酶抑制剂 100g乳糖 200g聚乙烯吡咯烷酮 30g微晶纤维素 30g硬脂酸镁 6g将活性成分和乳糖与聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合。将该混合物干燥并磨成颗粒。然后混入微晶纤维素，再混入硬脂酸镁。然后将该混合物用压片机压制成1000片片剂，每片含100mg活性成分。实施例42口服明胶胶囊用下列成分的混合物装明胶胶囊凝血酶抑制剂 50mg硬脂酸镁 3mg乳糖 100mg生物学凝血酶凝血时间和IC50TT的测定将100μl人凝血酶(T6769，Sigma化学公司)的缓冲溶液(pH7.4)和100μl抑制剂溶液保温1分钟。然后加入100μl加有柠檬酸盐的合并正常人血浆，用自动装置(KC 10，Amelung)测定凝血时间。将凝血时间(秒)对抑制剂浓度作图，用内推法确定IC50TT。IC50TT是使凝血酶对人血浆的凝血时间加倍的抑制剂浓度。pIC50TT是IC50TT(摩尔/升)的负对数，结果列于表4。表4实施例号 pIC50TT1 7.712 7.813 7.924 7.385 7.776 8.047 7.708 7.649 8.4510 7.9011 7.8612 8.2513 8.2214 8.1515 8.1216 7.7717 8.6818 7.3019 8.2720 8.1721 8.1422 8.6923 7.6424 8.0125 8.0026 7.8927 7.5228 6.8529 6.4730 7.38表4(续)实施例号 pIC50TT31 6.8832 7.6333 7.7834 7.0335 7.2536 7.5737 7.72缩写4-DMAP4-二甲氨基吡啶ArgL-精氨酸Arg(Z2)N，N-二苄氧羰基-L-精氨酸AzeL-氮杂环丁烷-2-羧酸Boc叔丁氧羰基Bu丁基Bzl苄基Ch环己基ChaL-β-环己基丙氨酸DMF二甲基甲酰胺Et乙基EtOAc乙酸乙酯FAB快原子轰击FⅠ至FⅩⅢ凝血因子Ⅰ至ⅩⅢFⅡa至FⅩⅢa凝血因子Ⅱ至ⅩⅢ的活化形式Gly甘氨酸HMW-K高分子量激肽原HOAc乙酸HONSuN-羟基琥珀酰亚胺HPLC高效液相色谱iBC氯甲酸异丁酯Kall激肽释放酶Me甲基MPLC中压液相色谱NMMN-甲基吗啉Nph萘基Ph苯基PicL-2-哌啶酸PL磷脂Pr丙基Prekall前激肽释放酶ProL-脯氨酸Tce2，2，2-三氯乙基TFA三氟乙酸THF四氢呋喃ValL-缬氨酸WSCDI水溶性碳二亚胺Z苄氧羰基前缀n、i和t具有其通常含义正、异和叔。权利要求1.一种通式如下的化合物，它既可以是原有形式，也可以是生理上可接受的盐的形式，包括其立体异构体其中A代表-CH2-，-CH=CH-，-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-；R1和R2相同或不同，各自代表H或X-B-，其中B是含1-3个碳原子的直链或支链亚烷基，X是H、甲基、乙基、含3-6个碳原子的环烷基或R′CO-，其中R′为OH、含1-4个碳原子的直链或支链烷氧基、NH2或NHR″，其中R″是含1-4个碳原子的直链或支链烷基；或者X是本身已知的羧酸类似物，选自-PO(OR″′)2，-SO3H和5-(1H)-四唑基，其中R″′是H、甲基或乙基；或者B为-SO2-而X为甲基或乙基；m为0、1或2，R3代表环已基；R3A代表H；或者m为1，R3代表环己基或苯基，R3A与R1一起形成亚乙基桥；Y代表O或S(O)p，其中p为0、1或2；R4代表H；含有1-6个碳原子、未取代或被一个或更多个氟原子和/或苯基取代的直链或支链烷基或环烷基；取代或未取代的芳环，选自苯基、4-甲氧基苯基、4-叔丁基苯基、4-甲基苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、被1-5个氟原子取代的苯基；或-CH(CF3)苯基。2.根据权利要求1的化合物，其中A代表-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-;R1是H，R2代表HOCO(CH2)n-或CH3CH2OCO(CH2)n-，n为1或2;Y为O;m为1，R3代表环己基，R3A代表H。3.根据权利要求1的化合物，该化合物选自以下化合物的原有形式或生理上可接受的盐的形式，包括立体异构体H-DCha-Pro-Arg-CH2-OH，H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Me，H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH(CF3)2，H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-(R or S)CH(Ph)-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，Et-OOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF2-CF2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(4-OMe)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(4-tBu)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(4-Me)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(4-F)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(3-F)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(2-F)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(3-CF3)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(4-CF3)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Ph(2-CF3)，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-C6F5，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-Et，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nPr，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBu，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-iBu，HOOC-CH2-DCha-Aze-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-nBu，Me-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，Me-SO2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，Ch-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，(HOOC-CH2)2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，(HOOC-CH2)2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-iBu，HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBu，HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，H-(3-trans-Ph)-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，H-(3-trans-Ch)-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-S-nBu，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-SO2-nBu，4.根据权利要求1的化合物，该化合物选自以下化合物的原有形式或生理上可接受的盐的形式，包括立体异构体HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-nBu，HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBu，HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH2-CF3，HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-O-nBu，5.根据权利要求1-4中任一项的化合物在治疗中的应用。6.一种制备根据权利要求1-4中任一项的化合物的方法，该方法包括(方法Ⅰ)用R4Y-(Y＝O，S)置换下式卤甲基酮中的卤素其中W1是氨基末端保护基，W2是保护基将该酮还原为醇，脱除氨基末端保护基，进行常规肽偶联，然后将醇氧化，得到受护的三肽酮，脱除氨基末端保护基，然后进行N-烷基化并脱保护，或者用氨基末端-N-烷基化的-N-三氟酰基保护的二肽置换上述偶联反应中的受护二肽，然后进行氧化和脱保护;或者(方法Ⅱ)用R4-卤素使下式的α-酮醇烷基化，然后再如方法Ⅰ进一步反应其中W1和W2如上所限定;或者(方法Ⅲ)使下式化合物(其中W1和W2如上所限定)与(T-CH2CO)2O(其中T为卤素、R4O或R4S)和4-DMAP反应，然后再如方法Ⅰ进一步反应需要时制成生理上可接受的盐;在该反应生成立体异构体混合物的情况下，可以用常规色谱技术或重结晶技术分离这些立体异构体，需要时分离出单个异构体。7.一种药物制剂，该制剂含有有效量的权利要求1-4中所述的任何化合物，还含有一种或更多种药物载体。8.根据权利要求1-4中任一项的化合物作为活性成分在制备一种药物制剂中的应用，该药物制剂用于抑制人或动物体内的凝血酶。9.根据权利要求1-4中任一项的化合物作为抗凝血剂的应用。10.一种在需要抑制凝血酶的人或动物体内抑制凝血酶的方法，该方法包括，给予所述人或动物有效抑制量的权利要求1-4中任一项所述的化合物。11.一种治疗或预防人或动物血液和组织中的血栓形成和凝固性过高的方法，该方法包括，对需要进行所述治疗或预防的宿主，给予有效量的权利要求1-4中任一项所述的化合物。12.如权利要求1-11中任一项所述并基本如上所述的化合物、方法、药物制剂、应用和方法。全文摘要本发明涉及新的竞争性凝血酶抑制剂。其合成方法，含有这些化合物作为活性成分的药物组合物、以及上式化合物或其生理上可接受的盐(包括立体异构体)作为抗凝血剂在预防和治疗血栓栓塞疾病中的应用，其中A、R文档编号C07K5/06GK1069736SQ92109600公开日1993年3月10日 申请日期1992年8月28日 优先权日1991年8月28日发明者B·阿特拉什, D·M·琼斯, M·谢尔克 申请人:阿斯特拉公司