抗根结线虫的方法

专利名称：抗根结线虫的方法技术领域：本发明涉及抗植物根结线虫侵染引起的有害影响的方法。根结线虫(Meloidogynespp)是例如蔬菜类植物、豆科类植物、烟草、西红柿、西瓜、葡萄、花生和棉花等许多农作物的主要病原体。化学防治、栽培实践和使用抗虫品种是目前防治线虫采用的主要手段，并经常综合利用这些方法对抗根结线虫病。由于这些例行方法对农作物提供的保护还不够，所以还需要对防治线虫的方法加以改进。杀线虫剂的使用对环境状态存在的问题，且也并非总是有效。栽培防治对种植者有着几方面的潜在损失。根结线虫寄主范围宽，这就限制了能获得经济上满意的非寄主作物。有效的抗虫栽培品种常常不易获得，而栽培者时常能够实际使用的那些栽培品种是在低根结线虫密度下易感染的栽培品种。此外，抵抗性也可在如热带和亚热带环境那样的高温土壤条件中减退。当根结线虫侵害植物根时，它穿过细胞间隙，达根的分生组织，线虫通过小针刺将咽腺分泌液注入分生组织细胞部位中，使细胞的正常发育受到破坏，而产生核分裂，无细胞分裂，由此产生称为“巨细胞”的多核细胞，随着巨细胞的形成，周围的细胞膨胀，被称为“过度生长细胞”，这种细胞不是线虫用针刺直接攻击的。巨细胞和周围的过度生长细胞一起构成了根结线虫的侵染位点。所观察到的在感染根上形成的结，是这种线虫感染产生的巨细胞和随之产生的生长过度的细胞组成的。巨细胞产生的机理在所有易感染的植物品种中类似。随着巨细胞的诱发，依靠线虫引起的巨细胞生活的根结线虫失去了移动的能力，且线虫在生活的地点被喂养，发育和繁殖。在公开的国际专利WO92/04453号上披露了根囊线虫的防治方法。在Gurr等人(1991)发表的题为“线虫感染的植物根中基因表达”一文中公开了有关从马铃薯根囊线虫中的mRNA获得cDNA的方法。本发明提供了一种生产根结线虫抗性植物的方法，其中，就被根结线虫侵染的植物而言，识别了表达在植物根结巨细胞和/或伴随的生长过度细胞的基因，所述基因的启动子与编码序列融合以提供编码分子的嵌合体基因。该基因有害于一种或多种1.根结巨细胞、2.根结生长过度细胞和3.根结线虫，且进一步的将所述的嵌合体基因转移到植物中。根据本发明的方法赋予植物对抗根结线虫的抗性植物，例如蔬菜类植物，食用豆科类植物，烟草，食用水果类植物，食用坚果类植物和棉花。胡萝卜和西红柿分别为其蔬菜类植物和水果类植物的例子。由于巨细胞产生的机理在所有易受感染的植物种类中是相似的，所以事实上，本发明的方法也适用于可按本发明的转换步骤予以转换的所有植物。本发明的方法适用于线虫类，但并不是仅限于M.incognita，M.javanica，M.arenaria和M.hapla。从感染植物中识别的和选出的基因优选的是在线虫基本上失去活动能力以后发生表达的基因。所述启动子控制的将要表达的序列(位于嵌合体基因)包括下述一种或多种1.能使巨细胞和/或生长过度细胞坏死的分子的编码序列。2.使根结线虫坏死的分子的编码序列。3.具有降低植物代谢作用活性的任何数量的酶的编码序列。4.侵染位点特异性基因的反义链。5.临界于植物细胞代谢作用的酶的编码序列的反义链。由于如果在其它位点表达基因，此位点产生的嵌合体基因的表达产物对转换的植物会有不利影响，所以一般有必要确保选择的基因是仅在巨细胞和/或伴随的生长过度的细胞表达的基因。如上述1-5点所述，本发明的优点之一是赋予植物对根结线虫抗性，而不需构建产生抗线虫感染的产物。下面将对本发明的优选实施步骤予以介绍烟草类植物的生长和感染用FisonsF1混合肥料，于下述条件下使C319烟草籽发芽，在光照度为4500-5000lux的条件下照射16小时，无光照时间8小时，温度为20-25℃。约3周后，用自来水轻轻冲洗籽苗以除土，转入盒中(每盒2株;Northrupking)，于25℃下，Conviron中，光照度为5500lux下16小时，无光照下8小时的条件下再生长一周。从盒上部将根提升，根尖处用玻璃纤维纸(WhatmanGF/A)支撑。把三日龄线虫用一份10μl(50个线虫)(M.javanica)释放于根尖，再用第二张GF/A纸置于顶部以将根尖全部包覆。为确定感染周期，侵染后24小时除去GF/A纸并立即在液氮中冷冻，侵染后3天割去根结(留下健康根和根尖组织)，能从80株接种植物上收集约0.5-1g侵染的根组织。染色以目测侵染根的线虫为了确定侵染量，测定每根尖侵染的线虫数。收集侵染3天后的植物的根并于95℃下浸于含乳酚0.1%的棉染兰中90秒钟。接着再用水进行第二次冲洗，于室温下(RT)，将此根置于乳酚中3-4天以变透明。然后用光学显微镜观察染色线虫。从健康和侵染的根组织中分离RNA于液氮冷却的杵和研钵中将根组织研成细末，按约每份100mg的量将其转移于用类似方法冷却的Eppendorf管中并加入300μl热酚萃取缓冲液(50%苯酚，50%萃取缓冲液0.1M氯化锂，0.1MTris-HCl，PH8.0(RT)，10mMEDTA，1%SDS)并于80℃下温育5分钟。加入等体积氯仿，4℃下，微离心均浆15分钟。水相用600μl苯酚/氯仿萃取并按如上条件进行微离心。然后再次除去水相，于4℃下，用等体积的氯化锂对RNA进行沉淀过夜，于RT条件下，进行微离心以对此沉淀进行造粒，并用70%乙醇洗涤。将所得丸粒低压冻干，再悬浮于DEPC处理的水中，用分光光度计进行测定。用变性凝胶电泳测定RNA的量。(Shirzadegan等人，1991年的改变方法)。侵染的特异cDNAs的底物克隆按制造商的说明，用磁化寡dT Dynabeads从总量为200μg健康和侵染的C319根组织RNA样品中分离Poly(A)+RNA(mRNA)。在连接健康组织Poly(A)+片段的Dynabead上原位完成第一条cDNA。此cDNA是驱动DNA(Diver DNA)。于连接侵染组织的Poly(A)+片段的Dynabead上原位合成第一和第二条cDNA。此cDNA是靶DNA。全部cDNA反应均使用Pharmacid′s cDNA合成试剂盒且按制造商的说明来进行的。三种寡核苷酸SUB21(5′CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3′)，SUB25(5′TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3′)(该序列摘自Duguid & Dinauer，1990)和LDT15(5′GACAGAAGCGGATCCd(T)153′)(O′Reilly等人，1991年)都是根据Maniatis等人(1982年)的方法用多核苷酸激活酶T4激活的。然后按King & Blakesley(1986)披露的方法将SUB21和SUB25退火，在T4DNA连接酶参予下，同靶DNA连接形成连接物。其后用TE充分洗涤此靶的携带珠，并于95℃下用5XSSC洗脱第二条cDNA。用加热方法将连接到驱动DNA的Dynabead上的RNA除去，并于55℃下，5XSSC中，用5小时将此洗脱的靶DNA杂交为该驱动DNA。于室温下，遵循厂商的说明将未杂交的靶DNA从连接驱动DNA的珠上分离除去。其后，于95℃下，采用类似办法将杂交的靶DNA从连接驱动DNA的珠上分离除去。然后把RT洗脱的靶DNA加回到所说驱动DNA中并重复进行杂交，直至杂交为靶驱动DNA的量不再超过未杂交的量。DNA的浓度按制造商的说明用INvitrogen的DNADipstick进行测定。将几等份的经洗脱的最终物用于PCR放大(Eckert等人，1990年)以产生用于克隆为质粒载体双股cDNA。按Frohman等人(1988)介绍的条件，用引物SUB21和LDT15及HybaidThermalCycler而能获得靶DNA的放大。按King&Blakesley(1986)介绍的方法使PCR产物连接到Smal消化的pBluescript载体上。利用反向Northern分析筛选底物的程序库用Gussow&Clackson(1989)介绍的方法用克隆PCR识别重组体。按膜制造厂的介绍，把放大的插入物三份印迹于PallBiodyne膜上。于同样的温度和缓冲溶液下进行预杂交和杂交。此温度为42℃且缓冲液为5XSSPE，0.05%BLOTTO，50%甲酰胺。再将其分别杂交为健康和侵染组织的cDNA探针(见下述)及包含最终底物的放大的靶DNA的探针。选择仅仅对感染的cDNA探针表现出杂交信号或对底物的探针表现出杂交信号但不对cDNA探针表现出杂交信号的克隆，作进一步分析。生产cDNA探针为了获得对不同筛选的具有高度专一活性的探针，在全部RNA上“冷”合成cDNA，并用寡标记对合成产物进行标记。于37℃下，先用2.5单位DNase1酶处理健康和侵染组织的10μg全部RNA样品15分钟。于95℃下将DNase酶变性10分钟后再进行合成cDNA(药用标准草案)。于0.4M氢氧化钠存在及室温下，用10分钟时间除去RNA，且此DNA用细SpunSephacry1400HR柱纯化。cDNA的产率和浓度用DNADipsticks测定(Invitrogen)。用如药用的标准寡标草案对此cDNA产物进行标记(C.35ng/探针)。Northern印迹法为了测定从反向Northern分析中选出的cDNAs在不同组织中的表达形式，无论是在健康或侵染的根、茎、叶和花的全部或Poly(A)+RNA的Northern分析均用此克隆作为探针。全部RNA印迹每道包括25μgRNA，而Poly(A)+印迹每道含RNA0.5-1μg。按如Fourney等人(1988)所述方法，用甲醛凝胶对RNA进行电泳并在PallBiodyneB膜上进行印迹。按上述方法标记和杂交探针为印迹。Southern印迹法为了确定此cDNAs是来源于植物还是线虫，按Gawel&jarret(1991)介绍的方法制备C319和M.javanica的DNA。制备的Southern印迹中每道含10μgEcoRⅠ和HindⅢ消化的DNA。按如上方法把此印迹杂化为寡标记的探针。原位杂化为了确定有价值的cDNAs在侵染位点表达的地点，进行原位杂化，按Jackson的方法(1991)，把侵染的和健康根的组织嵌于蜡中，切片并杂交为探针。分离mRNAs5′终端确定有价值的RNAs5′终端后再分离它们的启动子序列。按Frohman等人(1988)介绍的方法，使用5′RACE即能实现此目的。分离启动子区用称之为载体连接的PCR方法分离所需基因的启动子区。按1986年King&Blackesky介绍的方法，室温下将限制性内切酶消化的C319基因组DNA样品(100ng)同用限制性内切酶消化的产生亲和末端的pBluescript样品(100ng)连接4小时(一般所用酶是EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、BGlⅡ、XhoⅠ、ClaⅠ、SalⅠ、KpnⅠ、PstⅠ和SstⅠ)。PCR是用诸如排列顺序-40的载体引物或同此mRNA5′末端互补的载体引物在连接体上进行连接的。然后将此PCR产物进行克隆和定序。如有必要，为了确保分离启动子的控制序列，用同启动子片段5′末端互补的新引物重复该方法。二元植物转化载体中的嵌合体基因的构建体分离的启动子是通过5′末端连接的，其序列是上述1.-5.类中的一种序列，如本身是此基因的一反义链(如第4类)或barnase基因(Hartley等人，1972年)(第1或第3类)。这些是二元载体的构建(Bevan，1984)。生产基因转变的植物用Horsch等人披露(1985)的标准农业细菌间接叶盘法即可生产如烟草一类基因转变的植物，从而提供了抗根结线虫的植物。本发明方法生产的植物种籽或其他繁殖体可贮存使用。正如本领域的技术人员所了解的那样，对于某些类的植物而言，除了采用上述农业细菌间接法外，还可以用其他方法来转变植物，这是适宜或必须的。所属领域普通技术人员也知道，一旦根结线虫侵染植物，根据本发明方法生产的植物将不再遭受这样侵染所造成的不利影响同时也提高了抗根结线虫的繁殖能力，这种植物生长地的土壤中的根结线虫数目大大减少，使经济效益大大提高。根据本发明赋予植物对根结线虫抗性的方法对于易遭受根结线虫侵染的单子叶植物、双子叶植物、草本植物和木本植物均适用。参考文献BEVAN，M.(1984)NucleicAcidsResearch12(22)8711-8721.DUGUID，J.R.&DINAUER，M.C.(1990)NucleicAcidsResearch18(9)2789-2792.ECKERT，K.A.&KUNKEL，T.A.(1990)NucleicAcidsResearch18(13)3737-3744.FOURNEY，R.M.，MIYAKOSHI，J.，DAYIII，R.S.&PATERSON，M.C.(1988)Focus10(1)5-7.FROHMAN，M.A.，DUSH，M.K.&MARTIN，G.R.(1988)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA858998-9002.GAWEL，N.J.&JARRET，R.L.(1991).PlantMolecularBiologyReporter9(3)262-266.GUSSOW，D.，&CLACKSON，T.(1989).NucleicAcidsResearch174000.GURR，S.J.，McPHERSON，M.J.，SCOLLAN，S.，ATKINSON，H.J.&BOWLES，D.J.(1991) 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申请日期1993年3月13日 优先权日1992年3月13日发明者H·J·阿特金森, D·J·包尔斯, S·J·格尔, M·J·麦克弗森 申请人:先进技术(剑桥)有限公司