α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白特异性抗体及试剂盒和试纸条的制作方法

专利名称：α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白特异性抗体及试剂盒和试纸条的制作方法技术领域：本发明涉及生物技术领域，更具体的说，是涉艮一种乳品蛋白含量测定一级掺杂使假与否鉴别的ou-酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体(IgG )及试剂盒和试纸条。背景技术：目前，原料乳掺假的检测方法局限千传统的物理化学反应及仪器化模式，虽然已有像Fossl20这样的先进仪器可以快速检验出原料乳掺假，但是 这些仪器一般价格昂贵，需要专业人员操作，不适于中小企业的应用，更不 适用于现场检测，满足不了当前乳品行业的快速发展，而且其测定蛋白含量 是依靠含氮量的测定，这也为掺杂使假埋下了隐患。国外对牛乳酪蛋白检测技术的研究起步比较早，D. M. Barbano等人 (1987年)用红外线测乳仪检测牛乳中酪蛋白含量，该法检测时将待测样 品分成两份， 一份用红外测乳仪测出牛乳中总蛋由含量，另一份用磷酸调 pH到4. 6，沉淀后过滤，将滤液用红外测乳仪测出乳清蛋白含量，二者之差 即为酪蛋白含量。H Elbertzhagen将免疫交叉电泳技术与银染色技术结合 起来，用抗牛乳酪蛋白的兔血清来检测羊乳制品中掺杂的牛乳。JBelloque 等人用P-NMR技术测定牛奶中酪蛋白含量。他们测定了原料奶、巴氏消毒奶 以及超高温灭菌奶中的酪蛋由含量分别为25. 6 ±1.4、 26. 4 ±1.8、 25. 5 ± 1.6g/l，与散装液体奶中平均酪蛋白含量25. 8土1.6g/1无明显差异，因此 这种方法可用来测定原料奶、巴氏消毒奶、奶粉以及超高温灭菌奶中的酪蛋 白含量。现有的测定技术都是用凯氏定蛋法或者考马斯亮兰染色法来测定乳中 的蛋白含量，前者凡是含氮化合物都可以冒充乳蛋白，后者则可以用其他杂 蛋白或者劣质蛋白来冒充如蛋白。而乳蛋白，特别是酪蛋白是一种只有奈里 才有的具有多种生物功能，而且全营养的优质蛋白，所以通过本发明的技术， 通过老蛋白含量来评价原料奶的蛋白含量是否合格可以有效避免上述掺杂5使假问题。 发明内容本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种对原料乳品酪蛋白 含量是否达标实现实地快速特异性检测，分辨率高，检测时间短的Ots广酪蛋 白和k -酪蛋白特异性抗体及试剂盒和试纸条。本发明通过下述技术方案实现一种兔抗as广酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体，其特征在于，该oc"-酪 蛋白和k -酪蛋白特异性抗体通过下述方法制备(1) 动物的饲养与处理新西兰大白兔，预养一周后，观察无异样， 采集兔耳中央动脉血样2~3ml，将收集的血样分离血清，作为抗血清检测 时的阴性对照血清； ，(2) 初次免疫兔子在免疫前进行编号；取a"-酪蛋白标准样品用生 理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的ocs厂酪蛋白溶液，取k-酪蛋白标准样品 用生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的k-酪蛋白溶液；将得到的0Cs广酪蛋 白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得到ocs厂酪蛋白溶液； 将得到的k-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得到 k -酪蛋白混合溶液，用两只注射器分别抽取a sl-酪蛋白溶液和k -酪蛋白溶 液相对反复抽送直至两种酪蛋白混合溶液完全乳化得到免疫注射液，对编号 的新西兰大白兔进行腹部皮下5点免疫注射，每点0. 2ml;(3) 加强免疫对编号的新西兰大白兔初次免疫21天后，进行第一次 加强免疫，第一次加强免疫的方法为分别用步骤2中制备的浓度为2mg/ml 的ou-酪蛋白溶液和浓度为2mg/inl的k-酪蛋白溶液采用耳缘静脉注射免 疫，免疫剂量分别为lml/只；以后每隔7天加强免疫1次，免疫剂量与免 疫方法与第一次加强免疫相同，共进行4次加强免疫；在每次加强免疫后的 7-IO天抽取静脉血，分离血清，用ELISA法测定抗血清的效价。(4 )当用ELISA法测定抗血清的效价达到1: 2700以上时分别经心脏采 血收集a 81-酪蛋白和k -酪蛋白的多克隆抗血清；(5 )用石克酸氨沉淀法对oc s广酪蛋白和k -酪蛋白多克隆抗血清进行分离 纯化，得到oc s厂酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体。一种含有OCs广酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述试剂盒中检测样品的特异性蛋白含量的检测抗体为兔抗ot s!-酪蛋白和K-酪蛋白特异性抗体，标记酶为过氧化物酶，标记抗体为羊抗 兔抗体，其中兔抗cc酪蛋白和K-酪蛋白特异性抗体通过上述步骤1-5的 方法制备。一种含有a s广酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体的金标免疫层析试纸条， 包括吸水滤纸、醋酸纤维膜、胶体金结合垫、玻璃纤维，其特征在于所述 胶体金结合垫吸附有oc "-酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体，所述oc "-酪蛋白 和k -酪蛋白特异性抗体通过上述步骤1-5的方法制备。本发明具有下述技术效果本发明的a"-酪蛋白和K-酪蛋白特异性抗体及含有该抗体的试剂盒和 试纸条为乳制品，特别是液体奶乳蛋白含量的现场快速特异性检测和含酪蛋 白产品的质量控制等提供有效的手段。因为这两种酪蛋白是原料奶中较为稳 定的成分，也是乳的特征蛋白，所以其含量是否合格，不仅可以判断乳品蛋 白含量和质量，而且可以有效避免用含氮化合物、其他非乳蛋白冒充如蛋白 的掺杂使假。本发明专利通过把ou-酪蛋白和k-酪蛋白分别注射家兔制备 出高效价(ELISA法测定1:2700以上)的特异性抗体，用ELISA法检测液 体奶样品，并和FOSS120检测方法所测定的如蛋白含量进行比较，按我国国 家标准制订的> 3%的蛋白含量标准作为主要参数制备成免疫胶体金检测试 纸条，经过测试，其测试时间《30分钟，掺杂使假检出率>98%。而且，操 作筒单，不需要任何复杂、精密和昂贵的仪器设备。 具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明详细说明。实施例1.动物的饲养与处理实验动物新西兰大白兔6只，其体重1.5kg左右。 预养一周后，观察无异样，进行血样采集。把兔子固定住，用酒精棉球 擦兔子的耳中央动脉，促进动脉充血；左手固定兔耳，右手持注射器在中夹 动脉末端，使针头沿动脉平行方向刺入动脉，血液即可进入注射器，收集2 ~ 3ml血样，取血后用棉球压住针刺部位，压迫止血。将收集的血样分离血清，作为抗血清检测时的阴性对照血清。2. 初次免疫兔子在免疫前进行编号。取5mg oc51-酪蛋白标准样品用 10ml生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的ocs广酪蛋白溶液。取5mg k-酪 蛋白标准样品用10ml生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的k-酪蛋白溶液。 将得到的ocsr"酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得 到ot 81-酪蛋白溶液。将得到的k -酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为 1: 1的比例混合得到k-酪蛋白溶液，用两只注射器分别抽取ocs,-酪蛋白混 合溶液和k -酪蛋白混合溶液相对反复抽送直至两种酪蛋白混合溶液完全乳 化得到免疫注射液，对编号的新西兰大白兔进行腹部皮下5点免疫注射，每 点0. 2ml。3. 加强免疫初次免疫21天后，分别用步骤2中制备的浓度为2mg/ml 的(Xs,-酪蛋白溶液和浓度为2mg/ml的k-酪蛋白溶液采用耳缘静脉注射免 疫，免疫剂量分别为1ml/只；以后每隔7天加强免疫1次，免疫剂量与免 疫方法与第一次加强免疫相同，共进行4次加强免疫；在每次免疫后的7~ 10天抽取少许静脉血，分离血清，用ELISA法测定抗血清的效价以检测免 疫效果，达到1:2700 (ELISA)以上时即可采全血。4. 釆集抗血清当达满意效价时，经心脏^jk收集a"-酪蛋白和k-酪 蛋白多克隆抗血清。心脏a法家兔仰面，由助手抓住四肢固定，剪去左 胸部兔毛，消毒皮肤。用左拇指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻 轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后以左拇指触摸心脏搏动最 强的部位，用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45'C，对准心搏最强 处刺入心脏抽血致死。5. 抗血清的保存将抽取的血液立即注入大无菌平皿中，待血液凝固血 块收缩后，置37。C温箱1小时，再置4'C冰箱内3~4小时，用吸管吸Wl 清，分装于小冷冻管中，加入适当的1%。防腐剂，置-20'C以下低温保存。 操作必须在无菌条件下进行。6. IgG的分离与纯化用硫酸氨(中性盐)沉淀法对ots广酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗血清进行分离纯化，得到a"-酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗 体，其最终纯度应达到95%以上。一种含有a s广酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体的酶联免疫吸附试剂盒，所述试剂盒中检测样品的特异性蛋白含量的检测抗体为兔抗OCs厂酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体，标记酶为过氧化物酶，标记抗体为羊抗兔抗体，按 照常规的酶联免疫吸附试剂盒的制备方法制备。其中兔抗a s,-酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体采用上述步骤1-6的方法制备得到。试剂盒按照常规的制作方法制作，其第一抗体分别用上述方法获得兔抗 酪蛋白特异性抗体(兔抗OCs广酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体)，酶标羊抗 兔采用市售的试剂。一种含有OCs厂酪蛋白和k,-酪蛋白特异性抗体的金标免疫层析试纸条，包括吸水滤纸、醋酸纤维膜、胶体金结合垫、玻璃纤维，其中，该试纸条中的胶体金结合垫吸附有定量的OU-酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体，按照常 规的金标免疫层析试纸条的制备方法制备。Ots广酪蛋白和k-酪蛋白特异性 抗体的用量根据抗体效价和测定灵敏度确定。其中Ots广酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体采用上述步骤1-6的方法制备得到。通过和FOSS120检测方法所测定的乳蛋白含量(按照国家标准，原料乳 的蛋白含量达到3%即为合格，)进行比较，确定ELISA法检测液体奶样品， 和胶体金标记免疫层析试纸条检测液体奶样品的具体操作规程和参数，同时 经过测试，胶体金标记免疫层析试纸条的测试时间《30分钟，但是只能作 为定性分析；而ELISA试剂盒的测试时间为《4小时，可以进行定量分析， 其掺杂使假检出率>98%。权利要求1、一种兔抗αs1-酪蛋白和K-酪蛋白特异性抗体，其特征在于，该αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白特异性抗体通过下述方法制备(1)动物的饲养与处理新西兰大白兔，预养一周后，观察无异样，采集兔耳中央动脉血样2～3ml，将收集的血样分离血清，作为抗血清检测时的阴性对照血清；(2)初次免疫兔子在免疫前进行编号；取αs1-酪蛋白标准样品用生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的αs1-酪蛋白溶液，取K-酪蛋白标准样品用生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的κ-酪蛋白溶液；将得到的αs1-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1∶1的比例混合得到αs1-酪蛋白溶液；将得到的κ-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1∶1的比例混合得到κ-酪蛋白混合溶液，用两只注射器分别抽取αs1-酪蛋白溶液和K-酪蛋白溶液相对反复抽送直至两种酪蛋白混合溶液完全乳化得到免疫注射液，对编号的新西兰大白兔进行腹部皮下5点免疫注射，每点0.2ml；(3)加强免疫对编号的新西兰大白兔初次免疫21天后，进行第一次加强免疫，第一次加强免疫的方法为分别用步骤2中制备的浓度为2mg/ml的αs1-酪蛋白溶液和浓度为2mg/ml的κ-酪蛋白溶液采用耳缘静脉注射免疫，免疫剂量分别为1ml/只；以后每隔7天加强免疫1次，免疫剂量与免疫方法与第一次加强免疫相同，共进行4次加强免疫；在每次加强免疫后的7～10天抽取静脉血，分离血清，用ELISA法测定抗血清的效价。(4)当用ELISA法测定抗血清的效价达到1∶2700以上时分别经心脏采血收集αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白的多克隆抗血清；(5)用硫酸氨沉淀法对αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白多克隆抗血清进行分离纯化，得到αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白特异性抗体。2、 一种含有权利要求1所述的OU-酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体的 酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述试剂盒中检测样品的特异性蛋白含 量的检测抗体为兔抗a s!-酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体，标记酶为过氧化 物酶，标记抗体为羊抗兔抗侔，其中兔抗a"-酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗 体通过下述方法制备(1) 动物的饲养与处理新西兰大白兔，预养一周后，观察无异样， 采集兔耳中央动脉血样2 ~ 3ml，将收集的血样分离血清，作为抗血清检测时 的阴性对照血清；(2) 初次免疫兔子在免疫前进行编号；取ocsi-酪蛋白标准样品用生 理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的0Cs,-酪蛋白溶液，取k-酪蛋白标准样品 用生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的k-酪蛋白.溶液；将得到的c^-酪蛋 白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得到ots广酪蛋白溶液； 将得到的k-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得到 k -酪蛋白溶液，用两只注射器分别抽取a s广酪蛋白混合溶液和k -酪蛋白混 合溶液相对反复抽送直至两种酪蛋白混合溶液完全乳化得到免疫注射液，对 编号的新西兰大白兔进行腹部皮下5点免疫注射，每点0.2ml;(3) 加强免疫对编号的新西兰大白兔初次免疫21天后，进行第一次 加强免疫，第一次加强免疫的方法为分别用步骤2中制备的浓度为2mg/ml 的ocs广酪蛋白溶液和浓度为2mg/ml的k-酪蛋白溶液采用耳缘静脉注射免 疫，免疫剂量分别为lml/只；以后每隔7天加强免疫1次，免疫剂量与免 疫方法与第一次加强免疫相同，共进行4次加强免疫；在每次加强免疫后的 7~10天抽取静脉血，分离血清，用ELISA法测定抗血清的效价；(4 )当用ELISA法测定抗血清的效价达到1: 2700以上时分别经心脏采 血收集a "-酪蛋白和k -酪蛋白的多克隆抗血清；(5 )用硫酸氨沉淀法对a s厂酪蛋白和k -酪蛋白多克隆抗血清进行分离纯化，得到OCs广酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体。3、 一种含有权利要求1所述的a 51-酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体的 金标免疫层析试纸条，包括吸水滤纸、醋酸纤维膜、胶体金结合垫、玻璃 纤维，其特征在于所述胶体金结合垫吸附有ots「酪蛋白和k-酪蛋白特异 性抗体，所述0Cs,-酪蛋白和k-酪蛋白特异性抗体通过下述方法制备(1) 动物的饲养与处理新西兰大白兔，预养一周后，观察无异样， 采集兔耳中央动脉血样2 ~ 3ml，将收集的血样分离血清，作为抗血清检测时 的阴性对照血清；(2) 初次免疫兔子在免疫前进行编号；取ots,-酪蛋白标准样品用生 理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的a"-酪蛋白溶液，取k-酪蛋白标准样品用生理盐水溶解，配成浓度为2mg/ml的k-酪蛋白溶液；将得到的ots广酪蛋 白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得到ots,-酪蛋白溶液； 将得到的k-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂按照体积比为1: 1的比例混合得到 k -酪蛋白溶液，用两只注射器分别抽取oc s广酪蛋白混合溶液和k -酪蛋白混 合溶液相对反复抽送直至两种酪蛋白混合溶液完全乳化得到免疫注射液，对 编号的新西兰大白兔进行腹部皮下5点免疫注射，.每点0. 2ml;(3)加强免疫对编号的新西兰大白兔初次免疫21天后，进行第一次 加强免疫，第一次加强免疫的方法为分別用步骤2中制备的浓度为2mg/ml 的ou-酪蛋白溶液和浓度为2mg/ml的k-酪蛋白溶液采用耳缘静脉注射免 疫，免疫剂量分别为lml/只；以后每隔7天加强免疫1次，免疫剂量与免 疫方法与第一次加强免疫相同，共进行4次加强免疫；在每次加强免疫后的 7-10天抽取静脉血，分离血清，用ELISA法测定抗血清的效价；(4 )当用ELISA法测定抗血清的效价达到1: 2700以上时分别经心脏采 血收集cx "-酪蛋白和k -酪蛋白的多克隆抗血清；(5 )用硫酸氨沉淀法对OCs厂酪蛋白和k -酪蛋白多克隆抗血清进行分离 纯化，得到oc "-酪蛋白和k -酪蛋白特异性抗体。全文摘要本发明公开了一种α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白特异性抗体及试剂盒和试纸条，旨在提供一种对原料乳品酪蛋白含量是否达标实现实地快速特异性检测，分辨率高，缩短检测时间。该特异性抗体通过下述方法制备采集兔血样分离血清作为抗血清检测时的阴性对照血清；将α_s1-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂混合得到α_s1-酪蛋白溶液；将κ-酪蛋白溶液与完全福氏佐剂混合得到κ-酪蛋白混合溶液，分别抽取两种酪蛋白溶液混合至完全乳化得到免疫注射液，进行腹部皮下5点免疫注射；初次免疫21天后进行4次加强免疫；在每次加强免疫后的7～10天抽取静脉血分离血清，测定抗血清的效价达到1∶2700以上时采血收集多克隆抗血清，分离纯化得到特异性抗体。文档编号C07K16/18GK101531716SQ20091006865公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日发明者庞广昌, 涛 张, 方素云, 丹 李, 娲 胡, 艾丽萍, 越 赵 申请人:天津商业大学