对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物及其制备方法

专利名称：对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物及其制备方法技术领域：本发明属于有机杂环化合物合成技术领域，涉及对-异硫氰基苄基五氮杂环四乙 酸螯合物及其制备方法以及该螯合物作为均相时间分辨荧光免疫分析试剂用于免疫分析 的应用。背景技术：时间分辨荧光免疫分析法以其灵敏度高、快速、自动化分析仪器的使用及技术的 发展使这一分析法得到迅速的发展和广泛的应用。该方法是以镧系元素为标记物，用来标 记抗体(或抗原)、寡核苷酸、生物大分子、靶细胞等，然后进行抗原抗体的免疫反应生成免 疫复合物，或进行核酸杂交分析、检测DNA序列等，其原理是镧系离子如铕、钐、铽、镝等与 具有紫外吸收的配基螯合，受某一波段的紫外光激发后，配基能将激发态能转移给镧系离 子，发射强度高且寿命长的荧光光谱，不同的元素具有不同的荧光光谱且谱线窄。而且激发 光(300-350nm)与所要测量的发射光谱(490-643nm)之间有很长的Stokes位移，发射的 荧光寿命长(从微秒到毫秒级)，所以用其作标记物通过光谱分辨和时间分辨，待本底荧光 (纳秒级)淬灭后再进行标记物或标记物复合物的荧光测量，用作微量生物活性物的测量 大大提高了灵敏度。近年来，国内外文献大量的报道了时间分辨荧光分析的研究进展并对1，4，7，10， 13-五氮杂环十五烷的衍生物作为核磁共振显像造影剂和放射性药物的潜在配体已进行了 广泛的研究。但是将其衍生物与镧系元素螯合作为时间分辨荧光免疫分析试剂尚未见有研 究报道。发明内容本发明的目的在于提供了一种全新的对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物，它 是钢性穴状化合物，可螯合铕、钐、铽等镧系元素形成鏊合物。本发明的另一个目的在于公开了对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合剂的制备 方法。本发明的再一个目的在于公开了对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸镧系元素螯合 物用来标记抗体(或抗原)进行荧光免疫分析，遗传学诊断，各种病原体诊断，癌基因、抑癌 基因的检出等，还可标记DNA做成探针进行基因诊断、酶分析、受体分析等等。发明的技术方案如下具有下述结构的对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物 本发明所述螯合物的制备方法，其特征在于， (1)化合物III与化合物V进行成环缩合反应，制得化合物VI ； (2)将化合物VI水解制得化合物VII；(3)在有机溶剂中，将化合物VII与对硝基溴化苄进行取代反应，制得化合物 VIII ；所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、吡啶、DMF、乙腈、氯仿等等。 (4)化合物VIII与溴乙酸反应，制得化合物IX。(5)化合物IX与R螯合，得到螯合物X;其中R为铕、钐、铽或镝离子。(6)化合物X还原制得化合物XI。(7)化合物X与硫代光气反应，得到化合物I。 本发明所述的对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物的制备方法其中化合物 VII与对硝基溴化苄的摩尔比为1 0. 2-0. 6mol 反应温度25_50°C，反应时间5-8小时。其中化合物VIII 溴乙酸的摩尔比为1 2-4，反应温度40_60°C，反应时间5-8小 时。其中化合物IX还原所用还原剂为5-10% Pd/C，化合物IX与还原剂的摩尔比为 1 0. 03-0. 06mol，反应温度15_30°C，反应时间3-5小时。其中化合物X与硫代光气的摩尔比为1 3-5，反应温度20_30°C，反应时间3_5 小时。本发明所述的1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸，其制备方法中对现有文献 方法做了一定的改进参考文献①EUR. J. MED. CHIM. THER. 1984. 19 (5) 42 ；② Inors. Chem. 1991. 30 2092 ；③ CN 1225461C ；具体如下1)生成队&，N"-三对甲苯磺酰二乙烯三胺，反应温度20_35°C，反应时间2-5 小时，重结晶溶剂甲醇或乙醇。2)生成的N，N' - 二对甲苯磺酰羟乙基-N，N' -二对甲苯磺酰乙二胺，反应温 度-5-5°C，反应时间1-3小时，重结晶溶剂甲醇或乙醇。3)N,N'，N"-三对甲苯磺酰二乙烯三胺可和甲醇钠(乙醇钠)或NaH成盐。4) 1， 4，7，10，13-五对甲苯磺酰五氮杂环十五烷反应温度100-120 V，反应时间3-5小时。本发明的对_异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合剂的合成路线如下 本发明进一步公开了对-异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物作为在制备用于 时间分辨荧光免疫分析方面的应用。特别是在标记抗体或抗原进行荧光免疫分析方面的应 用。具有代表意义的螯合物为对_异硫氰基苄基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕 钠。用此螯合剂标记抗体(或抗原)用于时间分辨荧光免疫分析，检测激素，癌标志物，或 用于标记寡核苷酸，进行基因诊断等等。 具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供下述对_异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯 合剂制备实施实例。典型的是对_异硫氰基苄基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕 螯合物制备方法，这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。下面是对异硫氰基苄基-1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷四乙酸铕钠螯合物的合成路线7 参考实施例实施例1N, N’ - 二对甲苯磺酰羟乙基-N，N’ - 二对甲苯磺酰乙二胺(化合物III)77g(0. 4mol)对甲苯磺酰氯在IOOml吡啶中，剧烈搅拌下，滴加14. 8g(0. Imo 1) N，N’ - 二(2-羟乙基)乙二胺在200ml吡啶中的溶液，滴毕室温搅拌3小时。将溶液倒入 250ml冰和250ml浓盐酸中过滤，水洗，乙醇重结晶，得淡黄色晶体，mp :99-100°C (70% )0实施例2N，N，，N” -三对甲苯磺酰二乙三胺(化合物IV)10. 3g(0. lmol) 二乙烯三胺加106ml (0. 4mol)氢氧化钠溶液中，在剧烈搅拌下， 0°C滴加57. Ig(0. 3mol)对甲苯磺酰氯在375ml的乙醚溶液，加毕，继续搅拌1小时，过滤得 粗品，用乙醇重结晶，mp 200-2020C (60% )实施例3N, N，，N” -三对甲苯磺酰二乙三胺二钠盐(化合物V)56. 4g(0. lmol)化合物2加到13. 6g(0. 2mol)乙醇钠在150ml无水乙醇溶液80°C 加热1小时，减压除去溶剂，真空干燥得到产品。制备实施例实施例11，4，7，10，13-五对甲苯磺酰基五氮杂环十五烷(化合物VI)先加入100ml DMF，然后通氮气，100°C加热，搅拌下缓慢同时滴加76. 4g(0. Imo 1) 化合物III在200ml DMF的溶液和61g(0. Imo 1)化合物V在200ml DMF的溶液，滴毕，棕色 反应液在100-110°C反应3小时。冷却，搅拌下，倒入水中，滤出沉淀，水洗，醇洗，用乙醇重 结晶得白色晶体 mp 289-2900C (文献290-291°C, 278-280°C ) (65% ) 实施例21，4，7，10，13-五氮杂环十五烷(化合物VII)2. 0g(2. 03mmol)化合物VI和IOml 98 %浓硫酸混合，通氮气，在180°C加热搅 拌，水解反应4-5小时，得棕灰色液体。冰水冷却下缓慢从滴液漏斗加入50ml乙醚，灰色 沉淀很快过滤立即用乙醚洗，然后溶解在20ml水中，用过量NaOH片碱，调成pH 8左右，用 01(13提取，除去溶剂得到白色结晶，乙醚重结晶，得到结晶mp :90-91oC (文献100_102°C ) (80%)。1HNMR, δ = 2. 774(s，20H，CH2) ； 1· 829 (s，5H，NH)。实施例31-对硝基苄基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷(化合物VIII)0. 5g(2. 3mmol)化合物VII加IOml无水甲苯，搅拌下，在25-30 °C滴加 0. 2g(0. 9mmol)对硝基溴化苄在IOml甲苯中的溶液，滴毕继续反应5_6小时，甲苯溶液用水 提取(15ml X 3)，水溶液用NaCl固体饱和后，用氯仿提取(15ml X 3)，合并氯仿提取液，用无 水 Na2SO4 干燥，除去氯仿，得淡黄色粘稠物，0. 307g(95. 9%)0 1HNMr(CDCI3) δ = 8. 176 (d， 2H)，7. 559 (d, 2H)，3. 694 (s, 2H)，2. 810-2. 767 (m, 9H)，2. 671-2. 640 (m, 12H)，2. 146 (s,6H)。实施例4N-对硝基苄基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷4，7，10，13-四乙酸(化合物IX)0. 233g(0. 665mmol)化合物 VIII，加入 4ml 去离子水，用 2NNa0H 调节 pH = 9-10, 在25-30°C滴加0. 47g(3. 38mmol)溴乙酸在Iml水中的溶液，保持反应液pH = 10，继续搅 拌5-6小时，停止反应过夜，用6NHC1调节pH = 3，反应水层上大孔吸附树脂柱(Amberlite XAD-1600)先用蒸馏水洗脱，洗脱液无Cl—，Br—后，用甲醇洗脱，蒸除甲醇得到黄色固体 0. 23g, (59. 9 % ) ο 1HNMR400MHz (D2O) δ = 8· 271 (s，2Η)，8· 250 (s，2Η)，7· 733-7. 711 (d， 2Η)，4· 261 (s，2H)，3. 674 (s，4H) , 3. 540 (s, 4Η) , 3. 414-3. 426 (m, 4Η) , 3. 354-3. 333 (m，12Η)， 3. 320-3. 299 (m, 4Η)，3. 256 (s,4H)。实施例5N-对硝基苄基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷4，7，10，13-四乙酸铕钠(化合物 X)0. 23g(0. 395mmol)加入磷酸缓冲液 pH = 5-6，室温滴加 0. 102g(0. 395mmol)三氯 化铕，搅拌1-2小时，用HPLC分离，得到29mg淡黄色晶体。1HNMR 300MHz (D2O) δ = 17. 833 (s, 1H) , 17. 188 (s, 1H) , 13. 863 (s, 1H), 10. 134-10. 109 (d, 2H) ,8. 977-8. 951 (d，2H),8. 687 (s,1H)，7.885-7.818 (d,2H)， 7. 321 (s，1H) ,6. 216 (s，1H)，4. 980(s，2H)，4· 807 (s，1H)，4. 159-4. Ill (m，1H)，3· 923 (s， 1H) , 3. 678 (s，1Η) ,3. 152(s, 1Η) ,0. 348 (s，1H)，-0. 629—0. 629 (d，1H)，-0. 877 (s， 1H)，-1. 097 (s，1H)，-2. 062 — 2. 238 (m, 3H)，-3. 186 (s, 3H)，-3. 422—3. 445 (d, 1H)，-4. 263--4. 320 (d，1H)，-5. 564--5. 698 (m, 3H) , -6. 82 5 ——6· 7 70 (d，1H)，-11. 514—11. 574 (d，1H)。实施例6N-对氨基苄基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷4，7，10，13-四乙酸铕钠(化合物 XI)0. 028g(0. 037mmol)化合物 X，加入 3ml 水，加入 18ml 10% Pd/C，用 2NNa0H 调节 pH =9-10，室温氢化大约4-6小时，过滤反应液，滤液冷藏用于下步反应。实施例7N-对异硫氰基苄基1，4，7，10，13-五氮杂环十五烷4，7，10，13-四乙酸铕钠(化合 物 XII)化合物XI的水溶液(约8ml)，加入NaHCO3O. 052g,调节ρΗ8_8· 5，保持温度25°C， 滴加0. 034g硫代光气的6ml氯仿溶液，加毕，继续搅拌3. 5小时，用氯仿提取反应液，除去 原料，水溶液调节PH = 7，过滤，用HPLC分离(C18，5y，10X25(kim，10%甲醇/水，UV = 270nm)得到10mg，纯度为95%以上(HPLC)。10权利要求具有下述结构的对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物F2009100690951C0000011.tif2.权利要求1所述螯合物的制备方法，其特征在于，(1)化合物III与化合物V进行成环缩合反应，制得化合物VI ； (2)将化合物VI水解制得化合物VII；(3)在有机溶剂中，将化合物VII与对硝基溴化苄进行取代反应，制得化合物VIII (4)化合物VIII与溴乙酸反应，制得化合物IX；(5)化合物IX与R螯合，得到螯合物X；(6)化合物X还原制得化合物XI； 其中R为铕、钐、铽或镝离子；(7)化合物X与硫代光气反应，得到化合物I。3.如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物VII与对硝基溴化苄的摩尔比为 1 0. 2-0. 6mol ；反应温度25_50°C，反应时间5-8小时。4.如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物VIII溴乙酸的摩尔比为 1 2-4mol，反应温度40-60°C，反应时间5-8小时。5.如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物IX还原所用还原剂为5-10%Pd/ C，化合物IX与还原剂的摩尔比为1 0. 03-0. 06mol，反应温度15_30°C，反应时间3_5小 时。6.如权利要求2所述螯合物的制备方法，其中化合物X与硫代光气的摩尔比为 1 3-5mol，反应温度20-30°C，反应时间3-5小时。7.权利要求1所述螯合物在制备用于时间分辨荧光免疫分析方面的应用。8.权利要求1所述螯合物在标记抗体或抗原进行荧光免疫分析方面的应用。9.如权利要求8所述螯合物，其特征在于所述螯合物为对异硫氰基苄基-1，4，7，10， 13-五氮杂环十五烷四乙酸铕螯合物。全文摘要本发明涉及异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物及其制备方法，其中包括缩合、水解、取代反应，生成物与溴乙酸缩合，再和镧系元素螯合得到对硝基苄基五氮杂环四乙酸，再经5％Pd/C还原，最后和硫代光气反应，得到目标化合物I。本发明的对异硫氰基苄基五氮杂环四乙酸螯合物为未知化合物，形成的钢性穴状化合物和铕、铟、钐、铽等镧系元素螯合，经元素分析、红外光谱、紫外光谱、核磁及质谱确定其结构，所制备的螯合物主要用做时间分辨荧光免疫分析。文档编号C07D259/00GK101906077SQ20091006909公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月2日 优先权日2009年6月2日发明者周晓靓, 尹鹏, 施培基, 李美佳, 武明芬, 王浩, 王荣先 申请人:中国医学科学院放射医学研究所