绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法

专利名称：绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法技术领域：本发明涉及一种神经生长因子的制造方法，特别是用人体胚胎的绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法。神经生长因子(NGF)是外周感觉与交感神经分化和生存必需的一种蛋白质，1948年首先由Bucker发现，70年代由Levi—Montalcini和Cohen从雄性小鼠颌下腺及某些毒蛇的组织中提取获得成功，并于1986年荣获诺贝尔医学奖。神经生长因子可促进神经系统的生长，对正常神经细胞具有营养作用，对损伤神经有恢复机能，近年来，许多学者认为可望应用NGF治疗老年痴呆症，帕金森氏，病肌萎缩性侧索硬化等疾病，国外一些公司也正在开发NGF用于这方面疾病的治疗，并取得了一定的疗效。然而，从小鼠颌下腺及毒蛇提取NGF工艺繁复，它必须经过一系列的处理才能适用于人体，原料来源少，提取成本高，远不能满足社会需求。本发明的目的是提供一种从人体胚胎的绒毛、蜕膜中直接提取符合人体需要的人神经生长因子的方法，以简化工艺，降低成本，提高治疗效果。本发明以妊娠期流产的人胚胎绒毛、蜕膜为原料，经下列步骤制得(1)将绒毛、蜕膜除血后匀浆；(2)将匀浆后物料在低温下冻结，随后在＜38℃的室温下融化，如此重复冻融数次到细胞壁完全破裂；(3)、将步骤(2)的物料加入C—6885胶原酶酶解；(4)、将步骤(3)所得物料离心分离除去固体杂质，收集上清液；(5)、将步骤(4)的上清液用30000超滤膜超滤除去分子量＞30000的杂蛋白；(6)、将步骤(5)所得物料用10000超滤膜超滤除去分子量＜10000的杂蛋白，得分子量为10000—30000的物料浓缩液；(7)、将步骤(6)所得物料用pH＝6.8—7.2的磷酸盐缓冲液透析，使物料pH值调整为6.8—7.2；(8)、将步骤(7)透析至pH＝6.8—7.2的物料移入离子交换纤维素层析柱，用pH＝6.8—7.2的缓冲液冲洗柱子，将洗下的物料依次接收于若干个容器中；(9)合并收集步骤(8)中波长为280nm，吸收值＞0.5的物料；(10)在步骤(9)所收集的物料中加入pH＝4的醋酸盐缓冲液，将—NGF二聚体解聚成单体，其中醋酸盐缓冲液加入量是物料体积的0.1—0.13倍；(11)将解聚后物料用醋酸盐缓冲液校正至pH＝3.8—4.2，入离子交换纤维素层析柱，NGF被吸附，按下列程序洗柱a、用pH＝3.8—4.2含NaCl的醋酸盐缓冲液洗脱未被吸附的杂蛋白；b、用pH＝8.5—9的Tris—HCl缓冲液洗去另一部分杂蛋白；c、用pH＝8.5—9的含NaCl的Tris—HCl缓冲液冲洗柱子，NGF被洗脱，收集NGF洗脱液；(12)将步骤(11)收集的NGF洗脱液过分子筛柱，用pH＝8.5—9的含NaCl的Tris—HCl缓冲液洗柱，收集洗脱液，过滤除菌即获得与人体神经生长因子相符的人神经生长因子HuNGF。本发明中，步骤(10)所用的醋酸盐缓冲液浓度为0.4—0.6mol/L；步骤(11)—a中所用的醋酸盐缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L，含NaCl0.3—0.4mol/L，步骤(11)—b中所用的Tris—HCl缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L；步骤(11)—c中所用的Tris—HCl缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L，含NaCl0.4—0.6mol/L。步骤(12)中所用Tris—HCl缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L，含NaCl0.15—0.3mol/L。本发明先通过步骤(5)和(6)除去分子量30000以上及10000以下的大部分杂蛋白，又通过步骤(8)和(11)二次离子交换层析柱分离除去95％以上的杂蛋白，使NGF浓缩50—100倍。后者根据NGF是等电点在pH9.5左右的碱性蛋白，在酸性缓冲液中易被纤维素吸附，在碱性缓冲液中由于接近等电点而不被吸附或易被洗脱的原理，先在步骤(8)层析柱中用pH7左右的缓冲液将部分杂蛋白吸附，而将NGF洗脱，再在步骤(11)层析柱中用pH为4左右的缓冲液洗柱，NGF被吸附，而另一部分杂蛋白被洗脱除去。对少量等电点与NGF相近的杂蛋白，采用步骤(12)的分子筛吸附分离的方法除净。在本发明纯化过程中，随着杂蛋白含量逐渐减少，NGF提取物的活性显著增长。步骤(10)使NGF二聚体的两个多肽链解聚成单体，从而提高分子活性，易于通过血脑屏障。本发明制得的人神经生长因子可用无菌生理盐水稀释制成1mg/ml的注射针剂，供临床使用。本发明制得人神经生长因子的原料绒毛、蜕膜主要取于人工流产吸出物，国内原料易得。由于原料来源于人体，提取的神经生长因子无异性蛋白，完全与人体所需的神经生长因子相符，可直接用于人体，无副作用。经测定，其是分子量为14000左右的多肽，活性试验表明，鸡背根神经节在含5—10ng/ml的本发明HuNGF的培养液中，感觉神经元突起又长又密，具有促进神经节神经纤维生长活性。临床应用证明，本发明制得的人神经生长因子使用安全，无毒副作用，对治疗老年性痴呆症，脑发育不良及脑血管疾病等有一定疗效。本发明制备工艺简单，成本大大降低，有利于推广应用，满足社会需求。实施例一制备过程取自约600人孕期40天—3个月人流的绒毛、蜕膜，经除血后匀浆，匀浆液计21800毫升，分装在500ml无菌盐水瓶内，经-25℃～37℃冻融6次，加C-6885酶，在37℃下酶解6小时，尔后经25000g离心1小时，收集上清液约20000毫升，用分子量3万滤膜，用横流超滤器超滤，收集滤液为18500毫升，再用分子量为1万滤膜超滤，收集浓缩液2100毫升，尔后用0.02mol/L，pH6.8的磷酸盐缓冲液透析6小时，加入CM32I层析柱，收集波长280nm，吸收值大于0.5的未吸附的蛋白组分780毫升，加入87毫升0.5mol/L，pH4.0的醋酸盐缓冲液，混匀后作用5分钟，加入到CM32I层析柱，先用含0.4mol/LNaCl，浓度为0.05mol/L，pH4.0的醋酸盐缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白，再用0.05mol/L，pH9.0的Tris—HCl缓冲液洗去剩余的一些杂蛋白，最后用pH9.0，0.05mol/L的Tris—HCl加0.5m/LNaCl洗柱，得NGF洗脱液480毫升，再加入到G100分子筛柱，用含0.2mol/LNaCl浓度的0.05mol/L的pH9.0Tris—HCl缓冲液洗柱，收集含NGF组分610毫升。用注射用无菌生理盐水稀成3600毫升灌制1mg/ml针剂。实施例二药效试验先用wistar系雄性大鼠，通过脑立体定位，在鼠脑的无名质区域注射微量的Ibotenic acid，造成中枢胆碱能系统破坏到痴呆的动物模型，并通过脑室注入本发明的HuNGF对其进行治疗，通过组化染色的方法，HuNGF治疗组无名质区乙酰胆碱脂酶(Ache)阳性细胞较对照组增多，额叶、顶叶Ache阳性纤维密度也明显多于对照组，表明HuNGF对中枢胆碱能系统损害有多方面的保护作用。权利要求1.绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法，其特征是以人胚胎绒毛、蜕膜为原料，制备步骤如下(1)、将绒毛、蜕膜除血匀浆；(2)、将匀浆后物料在低温下冻结，随后在＜38℃的室温下融化、重复冻融至细胞壁完全破裂；(3)、将步骤(2)的物料加入C—6885胶原酶酶解；(4)、将步骤(3)所得物料离心分离除去固体杂质，收集上清液；(5)、将步骤(4)的上清液用30000超滤膜超滤除去分子量＞30000的杂蛋白；(6)、将步骤(5)所得物料用10000超滤膜超滤除去分子量＜10000的杂蛋白；(7)、将步骤(6)所得物料用pH＝6.8—7.2的磷酸盐缓冲液透析；(8)、将步骤(7)透析至pH＝6.8—7.2的物料移入离子交换纤维素层析柱，用pH＝6.8—7.2的缓冲液冲洗柱子，将洗下的物料依次接收于若干个容器中；(9)合并收集步骤(8)中波长为280nm，吸收值＞0.5的物料；(10)在步骤(9)所收集的物料中加入pH＝4的醋酸盐缓冲液混匀，将—NGF二聚体解聚成单体，其中醋酸盐缓冲液加入量是物料体积的0.1—0.13倍；(11)将解聚后物料用醋酸盐缓冲液校正至pH＝3.8—4.2，入离子交换纤维素层析柱，按下列程序洗柱a、用pH＝3.8—4.2的含NaCl的醋酸盐缓冲液洗脱未被吸附的杂蛋白；b、用pH＝8.5—9的Tris—HCl缓冲液洗去另一部分杂蛋白；c、用pH＝8.5—9的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗柱，收集洗脱液；(12)将步骤(11)收集的NGF洗脱液过分子筛柱，用pH＝8.5—9的含NaCl的Tris—HCl缓冲液洗柱，收集洗脱液，获人神经生长因子HuNGF。2.根据权利要求l所述的绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法，其特征是步骤(10)所用的醋酸盐缓冲液浓度为0.4—0.6mol/L。3.根据权利要求1所述的绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法，其特征是步骤(11)—a中所用的醋酸盐缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L，含NaCl0.3—0.4mol/L，步骤(11)—b中所用的Tris—HCl缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L，步骤(11)—c中所用的Tris—HCl缓冲液浓度为0.04—0.06mol/L，含NaCl0.4—0.6mol/L。4.根据权利要求1所述的绒毛，蜕膜制人神经生长因子的方法，其特征是步骤(12)中所用Tris—HCl缓冲液浓长为0.04—0.06mol/L，含NaCl0.15—0.3mol/L。全文摘要本发明涉及绒毛、蜕膜制人神经生长因子的方法，以人体胚胎绒毛、蜕膜为原料，通过匀浆、冻融、酶解、离心分离、超滤、透析、解聚、二次离子交换层析分离及一次分子筛吸附分离等步骤除净杂蛋白，提纯得符合人体需要的人神经生长因子。本法原料来源广，制备工艺简单，成本低，制得的人神经生长因子无异性蛋白，对人体使用安全，无毒副作用，具有促进神经节神经纤维生长活性，临床用于老年痴呆症、脑发育不良及脑血管疾病等，有一定疗效。文档编号C07K14/48GK1114322SQ9411136公开日1996年1月3日 申请日期1994年6月20日 优先权日1994年6月20日发明者李法卿, 谭维国 申请人:中国人民解放军南京军区后勤部军事医学研究所