甲肝病毒减毒活疫苗株的互补脱氧核糖核酸序列的制作方法

专利名称：甲肝病毒减毒活疫苗株的互补脱氧核糖核酸序列的制作方法技术领域：本发明是一种甲肝病毒的核苷酸序列，特别是用于预防人类甲型肝炎的减毒活疫苗株(H2减毒株)的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，命名为HAV-H2。甲型肝炎是世界性传染病，它是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，全世界约40亿人受到威胁。在中国，35岁以上成年人中，甲肝受染率达90％，常引起季节性流行。由于该病的高发病率及较长的病程，给人民健康及经济发展带来严重影响。根据我国现实情况，控制甲肝流行的有效和根本的措施在于发展疫苗，而疫苗的关键是良好的减毒株。美国MERCK公司Provost等人于1986年曾报告获得甲肝病毒F’减毒株，美国NIH的Purcell等人也于1987年报告获得甲肝病毒HM175/7MK-5减毒株，但人试结果证明，免疫效果很差，故至今未有进一步扩大人试的工作。浙江省医学科学院病毒病研究所经过多年努力，成功地研制出甲肝病毒减毒活疫苗株(H2减毒株)，并经大量人群接种证明确可用于预防甲肝的传染，为控制该病流行提供最有效的措施，该甲肝病毒减毒活疫苗株(H2减毒株)已于1993年获得中国专利。本发明的目的是搞清疫苗株(H2减毒株)的全长互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，通过与现有的甲肝病毒cDNA序列相比较，从而搞清疫苗株序列的突变位点，为用人工突变等基因工程方法研制新型甲肝疫苗创造条件。该疫苗株cDNA序列的阐明，还有利于对疫苗株遗传稳定性的掌握及指导疫苗株的选育，还有利于了解疫苗株与野毒株病毒基因的特异性区别，为疫苗的遗传稳定性研究提供分析方法。另外，通过比较分析研究，还有利于对甲肝病毒减毒机理的了解，为今后用基因工程手段研制快速生长、高滴度、高抗原性的新型、优良的甲肝病毒减毒活疫苗提供科学依据。本发明是在成功地研制成甲肝减毒活疫苗(H2减毒株)的基础上，对该疫苗株进行分子生物学研究。采用疫苗株(H2减毒株)为毒种，接种到已基本长满的单层人胚肺二倍体细胞(KMB17)。在35℃～36℃培养增殖28天后，收获细胞，再经冻融，超声，氯化铯超速离心等，获得纯化的甲肝减毒株(H2减毒株)病毒，该病毒再经胍盐/热酚法提取病毒核糖核酸(RNA)，用cDNA合成药盒配合多聚酶链反应(PCR)技术，以及分子克隆技术获得甲肝病毒减毒活疫苗株(H2减毒株)的cDNA基因库。最后用DNA序列分析药盒，双脱氧末端终止法，对已有的cDNA克隆进行序列分析，再通过拼接，从而获得完整的H2减毒株cDNA序列(RAV-H2)，它由7473个核苷酸的基因组和一个多聚腺嘌呤核苷酸(PolyA)尾组成。疫苗株(H2减毒株)的基因组由7473个核苷酸组成，与美国HM175野毒株cDNA序列[Journal of Virology 1987；61(1)50～59]相比，其5’-非编码区有两处缺失，可能与病毒减毒有关，另外，两者还存在一些散在的核苷酸变异，分布于整个基因组，这也可能与病毒减毒有关。因为甲肝病毒减毒活疫苗株(H2减毒株)是世界上第一株经大量人群接种证明安全有效的疫苗株，因此，该疫苗株全长cDNA序列的阐明，有利于搞清疫苗株的突变位点，有利于对其遗传稳定性的掌握和疫苗的鉴别区分，有利于了解疫苗株与野毒株病毒基因的特异性区别，为疫苗的减毒提供理论依据。另外，通过比较分析研究，还有利于对甲肝病毒减毒机理了解，为今后用人工诱变等基因工程方法获得甲肝病毒减毒活疫苗提供理论依据，因而具有很大的社会效益和经济效益。实施例采用甲肝病毒减毒活疫苗株(H2减毒株)为毒种，接种到已基本长满的单层人胚肺二倍体细胞(KMB17)，在35℃培养增殖28天后，收获细胞，含病毒的细胞经冻融、超声、氯化铯、超速离心，获得纯化的甲肝减毒株(H2减毒株)病毒，该减毒株病毒再经胍盐热酚法提取病毒RNA，用cDNA合成药盒，多聚酶链反应(PCR)技术以及分子克隆技术获得甲肝病毒减毒活疫苗株(H2减毒株)的cDNA基因库。最后用DNA序列分析药盒，双脱氧末端终止法，对已有的cDNA克隆进行序列分析，再通过拼接，从而获得完整的甲型肝炎减毒活疫苗毒株(H2减毒株)的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，命名为HAV-H2，全长如下………………HAV-H2 Length7494 September 23，1994 11:46 TypeN Check802 ..5’1 TTCAAGAGGG GTCTCCGGGA ATTTCCGGAG TCCCTCTTGG AAGTCCATGG51 TGAGGGGACT TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT AGGCTAAATT101 TTCCCTTTCC CTTTTCCCTT TCCCATTCCC TTTTGCTTGT AAATATTGAT151 TCCTGCAGGT TCAGGGTTCT TAAATCTGTT TCTCTATAAG AACACTCATT201 TTCACGCTTT CTGTCTTCTT TCTTCCAGGG CTCTCCCCTT GCCCTAGGCT251 CTGGCCGTTG CGCCCGGCGG GGTCAACTCC 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