从美丽红豆杉茎叶中提取分离紫杉醇的方法

专利名称：从美丽红豆杉茎叶中提取分离紫杉醇的方法技术领域：本发明涉及一种从天然植物中提取分离有效成分的方法，具体地说是一种从美丽红豆杉(Taxus mairei)茎叶中提取分离紫杉醇(Taxol)的方法。众所周知，紫杉醇是一种双萜类化合物。1971年由Wani等(Wani Mc，et al，J.A.C.S.93，2325，1971.)从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中首次分离得到。它对B-16黑色素瘤、L-1210和P-388白血病、MX-1乳腺癌和异种移植的CX-1结肠癌等许多肿瘤模型显示极满意的抗癌活性，由于它的作用机理独特，能促使微管蛋白聚合形成微管，并在其存在下微管不再解体，使癌细胞限制在构架组织内而死亡[Dentsch-HM et al，J.M.C.32(4)，788，1989； Manfredi JJ，et al，Phannacol ther 25，83，1984.]。因此，它已成为国内外科学家在抗肿瘤药物研究中的焦点，并且研究进展十分迅速。1992年12月，美国FDA批准BMS公司的紫杉醇作为转移性卵巢癌的二线治疗药；1993年12月又批准该药作为晚期乳癌治疗药。目前该药已经在美、英、德、法等20多个国家批准上市，其年销售量已超过3亿美元。随着该药的上市以及它对人体黑色素瘤、白血病、小细胞肺癌和结肠癌进行II期和III期临床试验的满意疗效，已经使紫杉醇供不应求。1992年美国有关专家预测，在最近二十年内很难再找到比紫杉醇疗效更高的天然药物。并呼吁全世界都来关心和提高紫杉醇的供应量，以缓解它的临床需要[Chemical and Engineering，69(35)，11—18，1991；Kingston DGI，et al，J.N.P.53(1)，1，1990.]。中国药科大学与日本岐阜药科大学合作研究美丽红豆杉茎皮未能得到紫杉醇；美国Purdue大学和台湾Hinchu工业技术研究所使用研究美丽红豆杉针叶仅仅完成HPLC定量测定该植物含有紫杉醇0.006—0.008％；中国医科院北京药物研究所研究了东北红豆杉(Taxus cuspidata)枝叶，其报道紫杉醇的得率为0.0007％以下；目前国外对红豆杉类植物茎叶中的10一去乙酰基浆果赤霉素III等化合物的研究较广泛，但是只见报道HPLC定量测定该植物茎叶中紫杉醇的百分含量，而未见报导从茎叶中制备紫杉醇。1988年法国科学家报道从欧洲红豆杉(Taxus baccata)的针叶中分离得到。可通过比较简单的半合成法转化为紫杉醇或其它有关的活性药物。全世界可供研究的红豆杉共有九个种类和四个变种，而我国占有四个种类和一个变种，资源丰富。近年来，北京、上海、南京、广州、昆明等地的一些科研单位和大专院校相继对东北红豆杉(Taxus cuspidata)、美丽红豆杉[梁敬钰等，化学学报，46，1053，1988；46，210，1988；J.-y.Zhou et al，LaternationalResearch eongress on Natural Products Halifax，N.S.，Canada July31-August4，1994，P59；佟晓杰等，药学学报，29(1)，55，1994.]和云南红豆杉(Taxus yusanenensis)开展了研究[陈未名等，药学学报，26(10)，747，1991；Mingky，el al，Phytochem 27，1534，1988.]，但不仅得率低且提取方法尚不完善。从长期生产的需要出发，从茎叶中提取紫杉醇是一个较佳的途径。采集针叶和嫩枝不会损伤植物，还可以不断再生，将会起到保护自然资源和生态系统，造益于人类。因此，从天然植物中提取紫杉醇的高效、简易的方法仍为人们探素的课题。本发明的目的是提供一种从天然植物美丽红豆杉中提取分离紫杉醇的方法。本发明的方法是以美丽红豆杉的茎叶作原料，可以经粉碎、溶剂浸出、浓缩得深绿色膏状物，加入适量水稀释，再用溶剂提取，提取液浓缩后用柱层析方法分离，除溶剂得紫杉醇粗产物。该粗产物经第二次柱层析分离即可获纯度为≥98％的紫杉醇，得率大于十万分之七。本发明中所用的浸出液是提高得率的关键之一。浸出液是二种或二种以上的混合溶剂。具体地说是乙醇和除乙醇外的水溶性的极性溶剂的混合物，也可以含有少量的水。它们的重量比依次为1∶0.01—0.30∶0—0.20。推荐的重量比是1∶0.01一0.10∶0—0.10。所述的水溶性的极性溶剂可以是除乙醇以外的其它水溶性的极性溶剂。如低碳链的酯、低碳链的醇，丙酮，乙腈等。低碳链的酯和醇可以是甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸甲酯，丙酸乙酯、甲醇、丙醇等。在用上述混合溶剂浸出美丽红豆杉茎叶时，至少要浸润美丽红豆杉茎叶，最好混合溶剂过量一些，以使浸出完全，用非常大量的混合溶剂浸出时也是有利于浸出的，但要增加浓缩或回收溶剂的工作量和能耗。通常美丽红豆杉与混合溶剂的重量比为1∶30。采用更多的混合溶剂也是有利的。推荐采用的重量比为1∶1—5。采用混合溶剂浸出时，最好用上述的方法用新的混合溶剂多次浸出，如浸出3—6次，以提高浸出率。更多次的浸出，对提高浸出率效果不显著。采用本发明的方法中，可以采用低碳链多氯代烷或混合多氯代烷提取，如二氯甲烷和三氯甲烷的混合液。柱层析分离可以采用硅胶柱层析，用低碳链的氯代烃和低碳链的醇混合溶剂洗脱，直至紫杉醇全部洗出。浓缩后获粗产品。粗产品可以用醇和水重结晶纯化，再用层析分离，如正相或反相的硅胶层析分离，用极性溶剂或和水作洗脱剂，浓缩获≥98％纯度的紫杉醇，得率大于十万分之七。采用本发明的方法，不仅可采用高山上生长的美丽红豆杉茎叶，如东北紫杉(又称红豆杉)和云南的美丽红豆杉。而且也可采用丘陵及平地上的、生长较快的美丽红豆杉茎叶作原料，如浙江美丽红豆杉茎叶。这也是本发明的又一重要的内容。目前生产紫杉醇的主要原料是红豆杉植物的树皮，但剥树皮会导致树木的死亡，最终会影响生态平衡。而浙江美丽红豆杉容易人工种植，生长速度较快，经实验证明该植物茎叶中紫杉醇的含量理想，是一种很有发展前途、可再生的紫杉醇的植物资源。所以，我们采用从茎叶中提出紫杉醇，不会破坏植物资源，经济效益显著，造益于社会。如上所述，采用本发明的方法，不需从红豆杉的树皮或根中提取紫杉醇，采用美丽红豆杉茎叶作原料，有利于资源保护和原料不断的提供。而且，本发明的方法简便，原料丰富、得率高，适宜于规模生产。通过下述实施例将有助于对本发明的理解，而不限制本发明的内容。实施例中熔点用Bortius熔点测定仪测定，未校正；旋光度用Perkin-Elmer241旋光仪测定；核磁共振谱用Bruker AMX-600型和AM-300核磁共振仪测定；质谱用JMS-DX300和Quattro GC/ms/ms质谱仪测定；柱层析用硅胶为青岛海洋化工厂产品，HPLC用日本岛津HPLC仪测定。显色剂为5％H2SO4乙醇溶液。实施例1取10Kg经室温自然干燥的浙江美丽红豆杉茎叶，经粉碎后，用95％乙醇和乙酸乙酯、丙酮、乙腈、丙醇或甲醇的1∶0.01-0.3重量比的混合溶剂浸提3—6次，每次茎叶与溶剂重量比为1∶5。浸出液减压浓缩得深绿色膏状物，然后加入适量H2O稀释，用CH2Cl2和CHCl3混合液萃取。合并CH2Cl2提取液，减压浓缩得提取物400—450g。然后，将CH2Cl2提取物进行硅胶柱层析分离，采用CH2Cl2-MeOH混合溶剂梯度洗脱，共收集80—90流份，每份300ml-400ml。用板层析检查所有流份，合并含有紫杉醇的流份，蒸去溶剂，得809。所得粗品再次进行硅胶柱层析，并用甲醇/水结晶纯化可以得到含紫杉醇1.95g。然后采用旋转薄层层析(正相硅胶或反相硅胶)或反相硅胶柱高效液相仪上进行最后分离，用甲醇/水作为洗脱剂，得≥98％紫杉醇0.72g，得率为十万分之七点二。实施例2同实施例1，采用混合溶剂浸出1次。获98％紫杉醇，得率0.0061％。实施例3分别用云南和东北红豆杉的茎叶作原料，其余同实施例1。分别实验重复二次，纯度为98％紫杉醇的得率均与以上类似，分别为0.0075％和0.0073％。结构鉴定紫杉醇，分子式为C47H51NO14白色针状或白色粉状结晶(H2O—MeOH或H2O-CH3CN)，mp217—218℃，[α]D20—48.5·(CO.20，MeOH)，薄层显紫色，IR(KBr)CM-13460(OH，NH)，1730，1720，1710(C＝0)，1650(NHC＝0)。FAB—MS m/z854(MH+)，794(MH+—HOAC)，569(MH+—CH16H15O4N)。490，430，404，324，307，105(基峰)。1HNMR(CD3Cl，600MHz)δ(ppm)1.16(3H，s，17-CH3)，1.25(3H，s，16-Me)，1.69(3H，s，19-Me)，1.81(3H，s，J＝1.1，18-CH3)，1.87(1H，m，6β-H)，2.24(3H，s，OAc)，2.30(2H，m，14-H2)，2.39(3H，s，OAc)，2.55(1H，ddd，J＝6.6，9.7，14，9Hz，6α-H)，3.81(1H，d，J＝7.0，3H)，4.20和4.31(each 1H，d，J＝8.5，20-H2)，4.40(1H，dd，J＝6.6，10.8，7-H)，4.79(1H，brs，Z′-H)，4.94(1H，dd，J＝2.1，9.5，5-H)，5.68(1H，d，J＝7，2-H)，5.78(1H，d，J＝8.8Hz，3′-H)，6.23(1H，brt，J＝8.3Hz，13-H)，6.28(1H，s，10-H)，7.00(1H，s，J＝8.8Hz，NH)，7.40(5H，m，Ar-H)，7.50(4H，m，Ar-H)，7.61(2H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.76(2H，d，J＝7.2Hz，Ar-H)，8.14(2H，d，J＝7.2Hz，Ar-H)，上述数据与文献记载相一致。实施例4国内外比较本发明的结果与国内外比较的结果列于表中权利要求1.一种从美丽红豆杉(Tarus mairei)茎叶中提取紫杉醇的方法，包括溶剂浸出、浓缩、加入适量水稀释，溶剂提取，提取液用柱层析分离和浓缩，其特征在于采用乙醇、除乙醇外的水溶性极性溶剂和水的混合溶剂浸出，重量比依次为1∶0.01—0.3∶0—0.20。2.一种如权利要求1所述的的从美丽红豆杉茎叶中提取紫杉醇的方法，其特征是所述的乙醇、除乙醇外的水溶性极性溶剂和水的混合溶剂重量比依次为1∶0.01—0.10∶0—0.10。3.一种如权利要求1所述的的从美丽红豆杉茎叶中提取紫杉醇的方法，其特征是所述的水溶性极性溶剂是丙酮、乙腈、低碳链的酯或除乙醇外的醇。4.一种如权利要求1所述的从美丽红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是用所述的混合溶剂提取3—6次。5.一种如权利要求1所述的从美丽红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是用低碳链的多氯代烷或混合多氯代烷提取，经硅胶柱层析。6.一种如权利要求1所述的从美丽红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是再经重结晶和层析分离。7.一种如权利要求1、2、3或4所述的从美丽红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是所述的美丽红豆杉茎叶是浙江产的美丽红豆杉的茎叶。全文摘要本发明涉及一种从美丽红豆杉茎叶中提取紫杉醇的方法，采用混合溶剂浸出、浓缩、溶剂提取、硅胶柱层析后获粗产品，再经重结晶纯化和柱层析分离可获≥98％纯度的紫杉醇，得率十万分之七左右。本发明方法可选用资源丰富的浙江红豆杉茎叶为原料。本方法不仅简易、且产物纯度和得率高，资源丰富，适于规模生产。文档编号C07D305/00GK1124735SQ9411404公开日1996年6月19日 申请日期1994年12月17日 优先权日1994年12月17日发明者卢立晃, 梁奕和, 邱毅华, 卢立修, 俞超美, 李榕, 贺小群 申请人:浙江省医学科学院