菠萝蛋白酶脱痂制剂及其制备方法

专利名称：菠萝蛋白酶脱痂制剂及其制备方法技术领域：本发明涉及生化酶烧伤脱痂药物及其制备与应用方法。去除各烧伤产生的焦痂(即脱痂)是烧伤治疗中的一个十分重要的环节，目前最为常用的手段仍然是手术脱痂，但手术法有以下不足其一，容易给病人造成手术痛苦；其二，需备新鲜血液，以防失血过多时急用；其三，伤及活体组织的情况经常发生，特别是关键功能部位的损伤，后果更严重；其四，麻醉处理的副作用风险常难避免。为了克服手术脱痂的上述不足之处，人们从六七十年代即开始寻求药物脱痂手段。但医学界认为已研制成功的脱痂药物，均不够理想。脱痂药物包括中药、化学药物和生化酶制剂三大类。脱痂中药较常用的有愈创十号、东方一号和水火烫伤膏，因这些药物无制菌作用，可使创面感染重，而很少被采用。化学脱痂药物，即酸性药物扩散剂，常用的酸性扩散剂有水杨酸、丙酮酸、琥珀酸和柠檬酸等，但因其刺激性给病人带来痛苦等原因，临床上已不被采用。生化酶脱痂制剂被认为是较有前途的脱痂药物，它又包括植物蛋白酶、细菌酶和动物酶三类生化酶；但至今只有一种被叫做“Travase”的细菌酶在人类烧伤临床上有少量应用。(《烧伤治疗手册》第三版，方之杨等编，1987年上海科技文献出版社；《烧伤理论与实践》方之杨等著，1989年辽宁科技出版社)。在植物蛋白酶中，以菠萝蛋白酶(Bromelain)、无花果蛋白酶(Dericin)和木瓜蛋白酶(Papain)研究较多。本发明直接与菠萝蛋白酶相关，公开了一种新的菠萝蛋白酶脱痂制剂及其制备的方法。有关菠萝蛋白酶制备酶脱痂药物的非专利文献报道始见于70年代初，专利文献报道则最早见于74年。根据用中国专利局世界知识产权组织数据库(WIPOData Base of Chinese Patent Office)的检索结果，在已公开的专利中有六篇专利(其中两篇相同)与本发明有不同程度的相关。Gerold.K.V.Klein和John.C.Houck在1979年申请的美国专利4,226,854，名称为用水解酶产品进行失活组织清创(DEBRUDENEBT OF DEVITALIZED TISSUE WITH HYDROLYTICENZYME PRODUCT)专利中，描述了一个等电点为6，至少含有两个亚基(每个亚基的分子量为14,300-15,000道尔顿)的酶混合物的主要特性及其用该酶混合物水溶性制剂进行脱痂的详细方法。1980年8月25日Klein和Houck二人又申请了一个专利(专利号为4,307,081)，名称为酶混合物(ENZYME MIXTURE)，该专利提出，脱痂酶(escharase)的概念，并在上一个专利的基础上提出酶混合物的分子量为30,000-50,000道尔顿，同时提了一个治疗配方(即酶混合物与生理盐水的配比为1∶1)。William Galbraith在1981年5月5日提出了一件新的专利申请(美国专利4,61,551)，名称为酶清创法(METHOD OF ENZYME DEBRIDEMENT)，该专利详细描述了酶混合物的分离方法及其特性在半胱氨酸存在条件下的蛋白酶活性为每mg15-35个酪蛋白活性，0.5-5个胶原蛋白活性。1991年12月3日Klein和Houck又申请了一件新的美国专利，并于92年12月2日通过PCT申请了国际专利(PCT/US92/10395)，名称为含有脱痂酶的蛋白水解酶混合物及该物质的分离方法(PROTEOLYTIC MIXTURE CONTAING ESCHARASE ADNMETHOD OF ISOLATING SAME)该专利描述了一种全然不同于以前的分离方法，即以抗坏血酸(Vc)作为抗氧化剂，(NH4)2SO4作为蛋白质沉淀剂的分离方法。具体步骤为①将粗酶溶于含有1％Vc的溶液中(4-10℃)→②用HCl调pH至3.5-3.9；→③在4-10℃条件下搅拌18小时→④用过滤或离心法去除不溶物→⑤制成40％的(NH4)2SO4饱和溶液(4-10℃)过夜沉淀→⑥离心或过滤，收集沉淀→⑦将沉淀溶于含0.1％Vc的0.3M醋酸溶液中(pH3.4，低温)；→⑧用Amicon DC-30超滤系统过滤→⑨清液冻干称重即为含有脱痂酶的蛋白水解酶混合物，该混合物中含有1-1.5％的脱痂酶(escharase)、发明人还给出了脱痂酶的氨基酸组成，并因为该酶缺乏脯氨酸和酪氨酸，发明人认为它是一种单一蛋白(Uniqueprotein)，该酶由三个分子量为15,000道尔顿的亚基组成，总分子量为45,000道尔顿。发明人认为该专利在收率(25％)，水解酶混合物中脱痂酶的含量(1-1.5％)、脱痂时间(4小时)以及混合物的稳定性等方面都显著优于以往专利，可以产生更好的植皮床(grafting bed)，中心残余焦痂(central escharremaing)也更小。并且可以根据需要通过葡聚糖凝胶SephadexG-75或等电聚焦方法获得更纯的脱痂酶。上述几项专利在分离方法或条件以至对脱痂酶的描述上虽都有不同，但在以下几点是相同的①所用的粗酶均是从菠萝茎中提取的；②酶混合物的分子量均在30,000-50,000道尔顿范围内；③酶混合物的最高活性为每mg蛋白质35个单位(在半胱氨酸存在条件下)；④等电点一般都在6左右；⑤脱痂时间最快为4小时。本发明之目的在于寻找一种脱痂效果更好、时间更短的酶脱痂制剂。这一发明目的通过以下描述的技术方案得以实现。本发明描述的精制菠萝蛋白水解酶是采用从菠萝果实中提取的粗酶作为提取原料，通过浸提、离心(或过滤)、浓缩干燥等工艺获得(更高纯度的精制品可以通过采用DEAE纤维素DE52作离子交换剂进行柱层析获得)。本品的有效成分为蛋白水解酶，经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其中含有两个具有水解蛋白质成分，分别称之为菠萝肽酶A和菠萝肽酶B，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定肽酶A和肽酶B的分子量分别为27,000和30,000道尔顿。等电聚焦电泳测定肽酶A的等电点为9.4。肽酶A和肽酶B的氨基酸组分如下菠萝肽酶A及菠萝肽酶B的氨基酸组成 <p>精制酶加入一定量的半胱氨酸作为激活剂混合均匀即为酶脱痂制剂干粉，脱痂时间3-4小时，最短只需1个小时。菠萝蛋白酶脱痂制剂的制备工艺(一)菠萝蛋白酶精制品工艺①取一定量的果实菠萝蛋白酶粗制品，用pH6.0-7.2，0.02-0.05M的磷酸缓冲液浸提，缓冲液与粗蛋白酶的比例为15-20∶1(V/W)，4-10℃条件下磁力搅拌2-4小时，4,000-10,000转/分离心10分钟左右，收集上清液；或用过滤法去除浸提液中的不溶杂质；②收集液用45％饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀过程很快完成；离心去掉上清液；③沉淀物再用蒸馏水透析脱盐(1∶100)，脱去硫酸铵，得浓缩液；④浓溶液冻干即可得菠萝酶精制品，收率20-34％(因粗酶来源不同)。步聚③所获的透析浓缩液亦可用冷丙酮沉淀，再用具盖离心管冷冻离心机离心10分钟，沉淀物自然低温干燥，即可获得较纯的蛋白水解酶混合物干粉。上述方法获得的菠萝蛋白水解酶精制品，水解酶活力为每克15-18万单位；蛋白含量16-20％。若需制备更高纯度的混合酶制品，则可将浸提液用DEAE—纤维素DE-52进行离子交换柱层析，收集两个在280nm处具有蛋白酶活性的吸收峰，收集光密度值0.5以上的部分。收集液进行冷冻干燥即可获得纯度更高的精制品。(二)脱痂制剂制备用上述方法制得的精制品加入10-20％的半胱氨酸作激活剂，磨混均匀，包装，即为脱痂制剂干粉成品，低温防潮保存待用(三)用脱痂酶制剂治疗烧伤组织的方法烧伤病人入院后，按如下步骤进行处理①用松节油清除伤面上的污物，再用生理盐水清洗伤面，撕去待脱痂伤面上的表皮，如表层已炭化，可用手术刀等将其刮除。②用1％利多卡因溶液将上述脱痂酶干粉调成糊状，将其均匀地涂敷在伤面上，约1-2mm。③静观5-10分钟，观察伤面变化，如伤面上小出血点多，并伴有大量渗液，证明脱痂效果好，需脱痂时间短。反之，脱痂时间稍长。④再在脱痂药物外盖一层无菌凡士林纱布，其外再盖上6-8层无菌纱布，最外层用绷带缠绕固定。⑤观察包扎纱布的变化，包扎纱布被血性渗液浸透，证明已脱痂成功。通常浅伤面只需2-3小时，较深的伤面时间稍长，一般4-5小时。三度伤面常是无色的渗液而不是血性透液。⑥打开包扎，用镊子刮去药物和坏死组织，再用0.5％NaHCO3溶液彻底清洗创面。或用生理盐水醮纱布擦净伤面，露出布满活动性出血点的新鲜伤面，至此，脱痂过程完成，根据不同情况作进一步的治疗处理。(四)酶活力测定以酪蛋白为底物，5ml反应液中含有1mM EDTA；5mM半胱氨酸(新配制的)；1％酪蛋白，20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2；20-80μg酶制品。将以上溶液在35℃保温10分钟，加入5ml 10％三氯乙酸终止酶反应，用定量滤纸过滤，测定滤液在275nm的光密度值，实验对照的条件与以上完全相同，只是在加入底物保温前先加入三氯乙酸溶液使酶失活(蛋白酶活力单位定义为在pH7.2，35℃时每分钟水解酪蛋白产生光密度值等于1μg/ml酪氨酸在275nm下的光密度值。)本发明与现有技术相比，具有以下积极效果(1)采用菠萝果实中提取的粗酶作原料，精制酶混合物的酶活力比现有技术高出3-5倍，酶活力每克为15-18万单位；(2)具有更高的收率，一般在20-34％。(3)脱痂时间短，二度烧伤一般2-3小时，临床上最快的只需六十分钟，且脱痂彻底。(4)临麻应用，未发现任何毒副作用，十分安全。(5)患者入院，可立即脱痂，可尽早去除病灶，利于伤面早日愈合。(6)可克服手术去痂时的手术痛苦及失血问题，不需麻醉，费用更低，患者乐于接受。(7)利于对烧伤程度的准确诊断，这对四肢功能部位的烧伤治疗具有深远的意义。(8)运输方便，保存有效期长，冰箱低温保存一年，其酶活基本没有损失，室温下保存一年，其酶活损失仅为5％。以下描述的是本发明四个实施例实例1①称取购自广西的菠萝果实粗酶30g，用pH7.2，0.02M的磷酸缓冲液450ml浸提，4℃条件磁力搅拌2小时，4,000转/分离心10分钟，得上清液400ml。②室温下将上述提取液400ml用45％饱和度硫酸铵(约110克)沉淀，4,000转/分离心20分钟，沉淀物用蒸馏水透析脱盐(1∶100)，低温下(4℃)脱盐24小时，其间换水4次。得浓缩液100ml。③将上述100ml浓缩液用冷冻干燥机冷冻干燥，得到含蛋白水解酶的混合物精制品9.6克，得率为32％。酶活力17万单位。加半胱氨酸1.5克，磨混均匀，密封名装，低温保存待用。实例2①称取购自广西的菠萝果实粗酶30克，用实实相同的方法浸提，得上清液400ml。②将上述浸提液用45％饱和度(NH4)2SO4沉淀，5000转/分离心20分钟，沉淀物用1∶100的蒸馏水透析脱盐5次，共24小时(4℃)，得浓缩液100ml。③将上述浓缩液用冷丙酮沉淀，用具盖离心管冷冻离心机8,000转/分离心10分钟，倒去上清液，沉淀物在低温下自然干燥，得菠萝蛋白水解酶混合物精制品7.3克，收率为24.3％。酶活力为18万单位。加入1克半脱氨酸，磨混均匀，密封包装低温保存待用。实例3(治疗病例)病人男性，19岁，右上臂深二度烧伤，面积1.3％，烫伤后27小时入院。常规清洁伤面，用本发明脱痂制剂涂敷5分钟后出现小出血点，包扎4小时后，坏死组织软化，刮除坏死组织，清洗伤面，脱痂十分彻底，常规换药9天后伤面愈合。实例4(治疗病例)病人为男性，因电孤光引燃化纤衣服致面部及双上肢烧伤，总面积10％，双上肢为三度烧伤，面积6％，伤后10小时用本发明脱痂制剂脱痂。涂敷本品后6分钟伤面出现小出血点，3小时40分钟后，完全脱痂，去除坏死组织清洗伤面，伤面基底仍为真皮，用辐射猪皮覆盖伤面，21天后，伤面基本愈合，住院41天出院时无疤痕增生，双手功能正常。权利要求1.一种用菠萝蛋白粗酶为原料，采用浸提、离心(或过滤)、浓缩、干燥等工艺制备用于烧伤组织脱痂的精制蛋白水解酶混合物的制备方法，其特征在于(1)用从菠萝果实中提取的粗酶为原料；(2)浸提用pH6.0-7.2磷酸缓冲清液；(3)以45％饱和度的(NH4)2SO4进行沉淀，然后盐析、透析脱盐；(4)干燥采用冷冻干燥或浓缩液用冷丙酮沉淀、离心再低温自然干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于浸提液沉淀采用DEAE-纤维素DE-52进行离子交换再进行干燥以获得更高纯度的精制酶混合物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在进行阴离子交换柱层析时，在280nm下收集光密度值在0.5以上部分溶液。4.一种包含精制菠萝蛋白水解酶的脱痂酶制剂，其特征在于(1)脱痂酶制剂由精制菠萝蛋白酶加10-20％的半胱氨酸磨混均匀而成；(2)精制菠萝蛋白水解酶混合物主要由肽酶A和肽酶B组成，其分子量分别为27,000和30,000道尔顿；(3)精制酶混合物的蛋白水解酶活性为15-18万单位。全文摘要本发明涉及烧伤脱痂药物及其制备与应用方法。以菠萝果实中提取的粗酶为原料经过浸提、离心(或过滤)、离子交换、盐析、透析、干燥等工艺制备的精制菠萝蛋白酶混合物，主要含有分子量为27,000-30,000道尔顿的两个肽酶，用其制备的脱痂制剂治疗深二度和三度烧伤可在3-4小时完成脱痂。全过程无需麻醉、备血，费用低，无手术痛苦，脱痂十分彻底，对于功能部位的烧伤治疗具有更重要的意义。文档编号C07K14/415GK1131159SQ94116530公开日1996年9月18日 申请日期1994年9月30日 优先权日1994年9月30日发明者阎隆飞, 梁鸿秋 申请人:阎隆飞